1、1核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术Nucleic acid Hybridization 2主要内容主要内容 第一节第一节 核酸探针核酸探针 第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型 第三节第三节 杂交的影响因素杂交的影响因素3回顾：核酸杂交的基本原理回顾：核酸杂交的基本原理一、核酸的结构一、核酸的结构二、核酸变性与复性二、核酸变性与复性三、核酸分子杂交的基本原理三、核酸分子杂交的基本原理4一、核酸的结构一、核酸的结构 一级结构：核苷酸的排列顺序一级结构：核苷酸的排列顺序稳定键：磷酸二酯键稳定键：磷酸二酯键 二级结构：双螺旋结构二级结构：双螺旋结构稳定键：氢键、碱基堆积力稳定键：氢键、
2、碱基堆积力 高级结构：染色体高级结构：染色体5CGA一级结构一级结构 二级结构二级结构 高级结构高级结构6二、核酸变性与复性二、核酸变性与复性 变性（变性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，维系在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键断裂，分子二级结构的氢键断裂，DNA的双螺旋解开变成的双螺旋解开变成单链，形成无规则线团。单链，形成无规则线团。7 极端的极端的pH 有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）二、核酸变性与复性二、核酸变性与复性8变性变性DNA的性质：的性质：变性能导致变性能导致DNA 的一些的一些理化理化性质性质及
3、及生物学性质生物学性质发生改变发生改变二、核酸变性与复性二、核酸变性与复性 溶液粘度降低溶液粘度降低 DNA双螺旋是紧密的双螺旋是紧密的“刚性刚性”结构，变性后代之以结构，变性后代之以“柔软柔软”无规则单股线性结构，无规则单股线性结构，DNA粘度明显下降粘度明显下降 溶液旋光性发生改变溶液旋光性发生改变 变性后变性后DNA分子的对称性及局部构型改变分子的对称性及局部构型改变 紫外吸收增加紫外吸收增加 DNA变性后，变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强溶液的紫外吸收增强 双链双链DNA单链单链DNA单核苷酸单核苷酸9二、核酸变性与复性二、核酸变性与复性 增色效应与温度有十分密切的关系，这主要是变增
4、色效应与温度有十分密切的关系，这主要是变性温度取决于性温度取决于DNA自身的性质自身的性质。融解温度（融解温度（melting temperature，Tm）：）：在热变性过程中，在热变性过程中，DNA的变性会在一个狭窄的温的变性会在一个狭窄的温度范围内发生，当紫外吸收值达到最大值的度范围内发生，当紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为时的温度称为DNA的解链温度或融解温度的解链温度或融解温度10 Tm的影响因素：的影响因素：1 DNA分子大小和碱基分子大小和碱基 的组成的组成 2溶液的离子强度溶液的离子强度 3 pH值值 4变性剂变性剂 DNA复杂度对Tm的影响 二、核酸变性与复性二、核酸
5、变性与复性11 DNA的的（G+C）含量）含量 在溶剂固定的前提下，在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取值的高低取决于决于DNA分子中的（分子中的（G+C）的含量）的含量（G+C）含量越高，）含量越高，G-C 碱基对越多，碱基对越多，Tm 值越高。值越高。因因G-C碱基对具有碱基对具有3对氢键，而对氢键，而A-T碱基对只有碱基对只有2对氢键，对氢键，DNA中中（G+C）含量高显然更能增强结构）含量高显然更能增强结构的稳定性，破坏的稳定性，破坏 G-C间氢键需比间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量。氢键付出更多的能量。二、核酸变性与复性二、核酸变性与复性12 杂交双链（杂交双链（hybrid du
6、plex）DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA二、核酸变性与复性二、核酸变性与复性复性（复性（renaturation）：）：指变性指变性 DNA 在适当条在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程转过程13三、核酸分子杂交基本原理三、核酸分子杂交基本原理核酸杂交示意图核酸杂交示意图 分子杂交（分子杂交（molecular hybridizationmolecular hybridization）:单链的核酸分单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形子在
7、合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。可以是两条可以是两条DNADNA链或两条链或两条RNARNA链或一条链或一条DNADNA链和一条链和一条RNARNA链链 14 杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性实现复性 分子杂交技术分子杂交技术：利用探针（：利用探针（probe）与靶）与靶DNA（RNA）杂交，特异性识别靶）杂交，特异性识别靶DNA（RNA）三、核酸分子杂交基本原理三、核酸分子杂交基本原理15第一节第一节 核酸探针核酸探针一、核酸探针的种类一
8、、核酸探针的种类二、核酸探针的长度二、核酸探针的长度三、核酸探针的标记三、核酸探针的标记四、核酸探针的检测四、核酸探针的检测16第一节第一节 核酸探针核酸探针一、核酸探针的种类一、核酸探针的种类核酸探针（核酸探针（nucleic acid probe)：是特定核苷酸序列（是特定核苷酸序列（单单链链，被标记被标记）与靶序列发生特异性互与靶序列发生特异性互补（补（可杂交可杂交）杂交后可用特殊方法检杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸测的已知被标记的核酸分子分子17 高度特异性高度特异性 探针的来源是否方便探针的来源是否方便 制备探针的难易程度制备探针的难易程度第一节第一节 核酸探针核酸探针一、
9、核酸探针的种类一、核酸探针的种类 确定特定核苷酸序列（确定特定核苷酸序列（与靶序列互补与靶序列互补）标记（标记（检测方法检测方法）选择探针的最基本的要求选择探针的最基本的要求18第一节第一节 核酸探针核酸探针一、核酸探针的种类一、核酸探针的种类DNA探针探针cDNA探针探针DNA探针探针RNA探针探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针19 来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全部或部分序列全部或部分序列 制备方法制备方法:基因克隆的方法基因克隆的方法 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)特点特点:克隆在载体中的克隆在载体中的DNA片段，可
10、无限繁殖，制备简便片段，可无限繁殖，制备简便 相对相对RNA而言，而言，DNA探针不易降解探针不易降解 标记方法也较成熟标记方法也较成熟第一节第一节 核酸探针核酸探针一、核酸探针的种类一、核酸探针的种类-DNA探针探针20 cDNA（complementary DNA）：）：是指与是指与mRNA互补的互补的DNA分子分子 特点特点:不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究 排除了排除了RNA酶的影响，现已成为分子生物学实酶的影响，现已成为分子生物学实验室的常规实验验室的常规实验 第一
11、节第一节 核酸探针核酸探针一、核酸探针的种类一、核酸探针的种类-cDNA探针探针21 RNARNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高RNARNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争结合竞争结合 RNARNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，杂交后未杂交的探针分子水解可用杂交后未杂交的探针分子水解可用RNARNA酶去除，本酶去除，本底的干扰低。底的干扰低。RNARNA探针有探针有易降解易降解和和标记方法复杂标记方法复杂等缺点，限制了等缺点，限制了其广
12、泛应用其广泛应用。第一节第一节 核酸探针核酸探针一、核酸探针的种类一、核酸探针的种类-RNA探针探针22 特点特点:探针长度较短（一般为探针长度较短（一般为1750bp）人工合成（避免天然探针的缺点）人工合成（避免天然探针的缺点）尤其适合点突变的检测尤其适合点突变的检测 由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱，但经过精心设计仍可设计出非常但经过精心设计仍可设计出非常 特异的寡核苷酸探针特异的寡核苷酸探针 第一节第一节 核酸探针核酸探针一、核酸探针的种类一、核酸探针的种类-寡核苷酸探针寡核苷酸探针23 DNA，RNA探针探针 DNA探针：探针：4
13、00-500base RNA探针：不易控制，重组探针：不易控制，重组DNA分子线性化的限制性核酸分子线性化的限制性核酸内切酶的位点内切酶的位点 寡核苷酸探针寡核苷酸探针 探针长度：一般要求在探针长度：一般要求在1750bp 第一节第一节 核酸探针核酸探针二、核酸探针的长度二、核酸探针的长度24理想的探针标记物应具有以下特点理想的探针标记物应具有以下特点 特异：靶序列特异特异：靶序列特异 稳定：标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，稳定：标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值值 灵敏：标记物被检测灵敏：标记物被检测 无毒：标记物对环境污染
14、小，对人体无损伤无毒：标记物对环境污染小，对人体无损伤 简便：操作简单简便：操作简单 便易：价格低廉便易：价格低廉第一节第一节 核酸探针核酸探针三、核酸探针的标记三、核酸探针的标记25常用的探针标记物：常用的探针标记物：放射性同位素标记：放射性同位素标记：32P 非放射性同位素标记：生物素，地高辛，荧光素非放射性同位素标记：生物素，地高辛，荧光素 第一节第一节 核酸探针核酸探针三、核酸探针的标记三、核酸探针的标记261 1随机引物法随机引物法 （单链）（单链）2.2.缺口平移法（双链）缺口平移法（双链）第一节第一节 核酸探针核酸探针三、核酸探针的标记三、核酸探针的标记276 65末端标记末端标
15、记 第一节第一节 核酸探针核酸探针三、核酸探针的标记三、核酸探针的标记5 53末端标记末端标记 4 4化学法全程化学法全程标记标记 3 3全程全程RNA探针标记探针标记 生物素生物素-亲和素亲和素地高辛地高辛-抗地高辛抗体抗地高辛抗体 28第一节第一节 核酸探针核酸探针四、探针的检测四、探针的检测-放射性同位素探针的检测放射性同位素探针的检测 1.放射自显影放射自显影将杂交膜与将杂交膜与X胶片在暗盒中曝光一定时间胶片在暗盒中曝光一定时间2.液体闪烁计数法液体闪烁计数法-计数器计数器 杂交膜剪成小块，真空干燥后转入闪烁瓶，杂交膜剪成小块，真空干燥后转入闪烁瓶，加入闪烁液，在液闪仪上加入闪烁液，在
16、液闪仪上自动计数自动计数29 1酶促显色法酶促显色法 2荧光法荧光法 3化学发光法化学发光法 4多探针检测法多探针检测法 非放射性探针检测示意图非放射性探针检测示意图 第一节第一节 核酸探针核酸探针四、探针的检测四、探针的检测-非放射性的探针的检测非放射性的探针的检测 30常用核酸探针的标记和检测常用核酸探针的标记和检测第一节第一节 核酸探针核酸探针31第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型一、反向点杂交一、反向点杂交二、二、Southern印迹杂交印迹杂交三、三、Northern印迹杂交印迹杂交 四、原位杂交四、原位杂交 其它命名如：斑点杂交其它命名如：斑点杂交 菌落杂交菌落杂交
17、 微板酶联杂交微板酶联杂交32固相杂交固相杂交 探针探针 被测被测DNA（RNA）在固体支持物上杂交在固体支持物上杂交 容易洗膜容易洗膜液相杂交液相杂交 探针探针 被测被测DNA（RNA）在液体中杂交在液体中杂交 灵敏度高灵敏度高按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类：按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类：第二节 核酸分子杂交的类型杂交分类杂交分类 正向杂交（靶序列固定）正向杂交（靶序列固定）反向杂交（探针固定）反向杂交（探针固定）33分子杂交技术一般过程分子杂交技术一般过程 探针制备及标记（同位素或非同位素）探针制备及标记（同位素或非同位素）待测核酸样品制备（分离，纯化）待测核酸样品制
18、备（分离，纯化）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交（液相，固相，原位杂交）杂交后处理（去掉非特异杂交分子）杂交后处理（去掉非特异杂交分子）显示结果（显色，发光，放射自显影）显示结果（显色，发光，放射自显影）结果分析结果分析第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型34核酸分子杂交技术类型核酸分子杂交技术类型 第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型35点杂交点杂交正向：是将待检样（正向：是将待检样（DNA、RNA 或细胞）直接点到或细胞）直接点到膜上，烘烤固定膜上，烘烤固定反向：是将探针固定在膜上反向：是将探针固定在膜上第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型一、反向
19、点杂交（一、反向点杂交（reverse dot blot，RDB）1.将标记的探针固定在膜上2.真空抽滤3.烘干4.与待测DNA杂交5.洗脱显影36 反向点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程反向点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速简便、快速 一张膜上可以同时固定多个探针，进行多个位点一张膜上可以同时固定多个探针，进行多个位点检测检测 特别适合做点突变特别适合做点突变第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型一、反向点杂交一、反向点杂交37线粒体线粒体DNADNA的的8 8个突变位点膜杂交结果个突变位点膜杂交结果3256329033163394359336063618368
20、8野生型野生型突变型突变型3 290 TC 3 593 TC3 394 TC3 618 TC3 316 GA 3 606 AG C3 256T G 3 316 A G 3 688 C第三节第三节 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术一、反向点杂交一、反向点杂交38 Southern印迹杂交是应用印迹杂交是应用DNA探针检测特异探针检测特异DNA的一种膜上印迹技术的一种膜上印迹技术 是由英国爱丁堡大学的是由英国爱丁堡大学的E.M.Southern于于1975年年建立的。建立的。主要用于分析基因是否发生突变主要用于分析基因是否发生突变第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型二、二、South
21、ern印迹杂交印迹杂交39DNA变性变性 中和中和 Southern印迹印迹 预杂交预杂交 杂交杂交 洗膜洗膜 检测检测 第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型二、二、Southern印迹杂交印迹杂交40 毛细管转移示意图毛细管转移示意图第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型二、二、Southern印迹杂交印迹杂交41电转移示意图电转移示意图第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型二、二、Southern印迹杂交印迹杂交42 Northern印迹印迹(Northern blot)杂交是应用杂交是应用DNA探探针检测特异针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术的另
22、一种膜上印迹技术 是由是由Alwine于于1977年建立的。后经年建立的。后经Thomas等人等人改进改进 主要用于分析主要用于分析mRNA分子大小及分子大小及mRNA的转录情的转录情况况第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型三、三、Northern印迹杂交印迹杂交43Northern印迹印迹杂交流程图杂交流程图 第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型三、三、Northern印迹杂交印迹杂交44与与Southern印迹杂交比较：印迹杂交比较：RNA提取过程中需特别注意提取过程中需特别注意RNA酶酶的污染的污染 所用的器材最好与所用的器材最好与Southern印迹实验的分
23、开使用印迹实验的分开使用 RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解RNA 2-OH 变性剂的作用：变性剂的作用：防止防止RNA分子形成发夹式的二级分子形成发夹式的二级结构，以保持其单链线形状态结构，以保持其单链线形状态第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型三、三、Northern印迹杂交印迹杂交45原位杂交（原位杂交（In situ hybridization）是以特定标是以特定标记的核酸探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交记的核酸探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并用组化或免疫组化等方法对其检测的技术。并用组化或免疫组化等方法对其检测的技术
24、。第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型四、原位杂交四、原位杂交它属于固相分子杂交的范畴，但有别于其它任何它属于固相分子杂交的范畴，但有别于其它任何固相核酸分子杂交技术固相核酸分子杂交技术46 原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点之外，并之外，并可精确定位可精确定位，因此该技术已广泛地应用于医学，因此该技术已广泛地应用于医学分子生物学的研究之中分子生物学的研究之中 其应用有以下几方面：其应用有以下几方面：正常或异常染色体的基因定位正常或异常染色体的基因定位 应用核酸探针与细胞内应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交，检测基因表
25、进行杂交，检测基因表达水平达水平 应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行杂应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以检测有无该病原体的感染等交，以检测有无该病原体的感染等第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型四、原位杂交四、原位杂交47石蜡包埋组织切片石蜡包埋组织切片冰冻切片冰冻切片细胞涂片细胞涂片培养细胞爬片培养细胞爬片第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型四、原位杂交四、原位杂交-原位杂交材料原位杂交材料48 细胞或组织切片的处理细胞或组织切片的处理 玻片清洗玻片清洗 组织和细胞的固定组织和细胞的固定 增强组织的增强组织的通透性通透性和核酸探针的和核
26、酸探针的穿透性穿透性 预杂交预杂交 杂交杂交 杂交后漂洗杂交后漂洗 结果检测结果检测第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型四、原位杂交四、原位杂交-基本方法基本方法49荧光原位杂交（荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization,FISH）是一种利用非放射性的荧光素标记，对原位杂交样本进行是一种利用非放射性的荧光素标记，对原位杂交样本进行检测的技术检测的技术第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型荧光原位杂交荧光原位杂交50 生物素标记探针与荧光素标记的抗生物素抗体生物素标记探针与荧光素标记的抗生物素抗体 地高辛标记的抗体与荧光素标记的
27、抗地高辛抗体地高辛标记的抗体与荧光素标记的抗地高辛抗体 氨乙酰基荧光氨乙酰基荧光（aminoacetylfluroence,AAF）-改改良探针与抗良探针与抗AAF抗血清等抗血清等 上述的检测系统有上述的检测系统有直接法和间接法直接法和间接法两种，后者两种，后者灵敏度更高灵敏度更高 第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型荧光原位杂交荧光原位杂交-荧光素标记检测系统荧光素标记检测系统51FISH技术在染色体分析中的应用技术在染色体分析中的应用第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分子杂交的类型荧光原位杂交荧光原位杂交52菌落杂交示意图菌落杂交示意图第二节第二节 核酸分子杂交的类型核酸分
28、子杂交的类型菌落杂交菌落杂交53 核酸分子浓度（靶核酸、单链探针）核酸分子浓度（靶核酸、单链探针）高浓度双链探针：自身复性高浓度双链探针：自身复性 碱基组成：碱基组成：G+C的含量（含量越高，杂交速度越快，稳定性越好）；的含量（含量越高，杂交速度越快，稳定性越好）；Tm值值 盐浓度：盐浓度：与速度成正比，但与速度成正比，但1mol/L的的NaCl达到平台期（经验）达到平台期（经验）稳定性：高离子促进杂交分子的稳定，低盐高温有利于非特异性杂交的探针的洗脱。稳定性：高离子促进杂交分子的稳定，低盐高温有利于非特异性杂交的探针的洗脱。温度：越高杂交速度越快；注意温度：越高杂交速度越快；注意Tm值值 R
29、NA：DNA杂化：低于杂化：低于Tm值值1015，DNA：DNA杂化：低于杂化：低于Tm值值2025，达，达到最大速率到最大速率 甲醛：降低甲醛：降低Tm值，低温易于固定，提高稳定性值，低温易于固定，提高稳定性 错配错配 加速剂：很少使用加速剂：很少使用第三节第三节 杂交的影响因素杂交的影响因素一、长探针杂交的影响因素一、长探针杂交的影响因素-杂交速率与杂化分子的稳定性杂交速率与杂化分子的稳定性54 酶联探针：酶联探针：酶对酶对Tm值的影响，酶的稳定性值的影响，酶的稳定性 杂交反应体积：杂交反应体积：越小越好越小越好 杂交时间：杂交时间：RNA：DNA;DNA：DNA杂交：杂交：6-18小时；
30、小时；RNA：RNA杂交：杂交：10-12小时小时 特异性与灵敏度的矛盾特异性与灵敏度的矛盾第三节第三节 杂交的影响因素杂交的影响因素一、长探针杂交的影响因素一、长探针杂交的影响因素55Tm值比较低，稳定性较差。值比较低，稳定性较差。影响杂交稳定的因素：影响杂交稳定的因素：Tm值的影响（四胺盐消除碱基序列对值的影响（四胺盐消除碱基序列对Tm值的影响，只考虑碱探值的影响，只考虑碱探针的长度；碱基的错配减低稳定性）针的长度；碱基的错配减低稳定性），盐溶液（一般不调整），盐溶液（一般不调整）杂交时间：杂交时间：寡核苷酸杂化双链不稳定，杂交时间短，一般寡核苷酸杂化双链不稳定，杂交时间短，一般23小时，小时，加速剂：加速剂：很少用，本身杂交速度比较快，不会自身复性很少用，本身杂交速度比较快，不会自身复性 洗脱条件：时间短洗脱条件：时间短 杂交条件优化：杂交的温度、盐浓度、洗脱时间等杂交条件优化：杂交的温度、盐浓度、洗脱时间等第三节第三节 杂交的影响因素杂交的影响因素二、短小寡核苷酸探针杂交的影响因素二、短小寡核苷酸探针杂交的影响因素56基因突变的分析基因突变的分析基因表达的研究基因表达的研究基因定位的研究基因定位的研究基因克隆的筛选基因克隆的筛选核酸杂交的主要应用核酸杂交的主要应用
