1、免疫标记（免疫标记（immunolabelling technicimmunolabelling technic）是指用一些易测定的、具有高度敏感性的标记物质：荧光素、放射性核素、酶、胶体金、生物素、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记特异性的抗原、抗体分子进行的抗原、抗体反应。通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原、抗体的性质与含量。并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定。可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上对抗原、抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液中的半抗
2、原、抗原进行定性和定量测定。具有高度敏感性、特异性、快速性。免疫标记技术免疫标记技术主要分为：v 免疫荧光技术：免疫荧光技术：v 放射免疫测定：自动化仪器价格昂贵、所用试剂半衰期短、危及人体健康v 酶免疫技术：敏感、快速、简便、应用范围广、不需特殊设备免疫标记技术的应用免疫标记技术的应用v 标记物与抗原、抗体的连接技术；v 标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理以及相应的检测仪器的使用方法。免疫荧光标记技术（免疫荧光标记技术（immunofluorescence techniqueimmunofluorescence technique）是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对
3、应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。免疫荧光标记技术免疫荧光标记技术始创于20世纪40年代初，1942年Coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。当时由于异氰酸荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至1958年Riggs等合成了性能较为优良的异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）。Marshall等又对荧光抗体标记的方法进行了改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。荧光荧光荧光荧光v用于标记的抗体：高特异性和高亲
4、和力v作为标记的荧光素应符合以下要求：v应具有能迅速而稳定地与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。v荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。v有强的荧光效应，即使标记后也不出现非特异染色荧光色泽,与背景组织的色泽对比鲜明。容易与自发荧光及其他荧光相区别（如双重标记时）v与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。v尽可能少褪色v标记方法简单、安全无毒。v与蛋白质的结合物稳定，易于保存v有良好的水溶性，溶解后不与其它物质发生化学反应，v纯净，可用标准试剂检验。常用的荧光标记试剂:v荧光素类 ：标准荧光素及其衍生物v异硫氰酸荧
5、光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）v羟基荧光素（carboxyfluorescein,FAM）v四氯荧光素（tetrachlorofluorescein,TET）v罗丹明类（Rhodamine dye)标准荧光素的衍生物v 四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）v 四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）v 外观：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。v 分子式：C21H11NO5Sv
6、分子量为 389.4v 纯度：95%(HPLC)v 最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，v 有两种同分异结构，其中异构体型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。v 主要优点：人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。异硫氰酸荧光素(FITC)四甲基异硫氰酸罗丹明（四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）v最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nmv呈橙红色荧光v与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色v其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低四乙
7、基罗丹明（四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）v 橘红色粉末v 不溶于水，易溶于酒精和丙酮v 性质稳定，可长期保存v 最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nmv 呈橘红色荧光荧光荧光FITC+RB200FITC+RB200标记标记荧光素FITC标记抗体当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合1520个，一个IgG分子可结合28个分子的FITC，其反应式如下：FITC-N=C=S+N-H2-蛋白质 FITC-N
8、S-C-N-H2-蛋白质FITCFITC标记方法：标记方法：v搅拌法：搅拌法：适用于标记体积较大、蛋白质含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短、荧光试剂用量少，但此法所受影响因素较多，若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色出现。v直接标记法v间接标记法v改良法v透析法：透析法：适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液，此法标记抗体比较均匀，非特异性染色也比较少。【主要试剂与器材主要试剂与器材】1器材（1）铁立架、蝴蝶夹、层析柱、洗脱瓶、搅拌器、磁棒、紫外分光光度计（2）烧杯、试管、滴管、吸管、洗耳球、pH试纸、黑纸2试剂（1）抗体（2）异硫氰基荧光黄（FITC）（3）葡聚糖凝胶（Sephadex
9、 G-25）（4）pH9.5，0.5M 碳酸缓冲液（5）pH7.0，0.005M 磷酸缓冲液v取已知浓度的抗体蛋白溶液，用pH9.5，0.5M 碳酸缓冲液稀释至最终浓度为20mg/ml。置于包黑纸的小烧杯中，并放入磁棒。v称取适量FITC：按FITC(mg)/抗体蛋白(mg)的质量比为1/100，并计算出需要FITC的量。即：FITC的量(mg)=待标记抗体蛋白总量(mg)0.01。v将称好的FITC放在试管中，并用黑纸包好，然后取相当于稀释后抗体蛋白溶液体积1/10的pH9.5，0.5M 碳酸缓冲液溶解FITC。v开启搅拌器，将FITC溶液用滴管逐滴滴入含抗体蛋白溶液的烧杯内，加完后用pH试
10、纸测试，如pH低于9.5，则用碳酸缓冲液调整pH至9.5，加盖搅拌1小时。v用Sephadex G-25装层析柱，用pH7.0，0.005M 磷酸缓冲液（PB）平衡洗脱。v将上述标记液上Sephadex G-25柱。v用pH7.0，0.005M PB 洗脱，流速控制为1ml/分钟。v用三支试管收集：待黄绿色荧光走至离下端2cm处时，用第一支试管开始收集；当黄绿色荧光出现在洗脱液时，用第二支试管收集全部黄绿色荧光溶液，待黄色荧光溶液在流出层析柱口时，换用第三支试管收集，直至流出液黄色消失，则停止收集。v记录收集管的OD495读数与OD280读数，根据公式：2.87OD495F/P =OD2800
11、.35OD495 计算F/P值，并对该比值作一简单分析。【结果判断结果判断】荧光抗体的鉴定荧光抗体的鉴定v效价效价抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者较为理想。v荧光素与蛋白质的结合比率荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p1.5为宜，用于活细胞染色的以f/p2.4为宜。抗体工作浓度抗体工作浓度抗体工作浓度的确定方法类似ELISA间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1:41:256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓
12、度。荧光抗体的保存荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，20冻存，这样就可放置34年。在4中一般也可存放12年。【影响标记的因素影响标记的因素】v温度:温度低则所需标记时间长，温度高则标记时间短。在0-4 时标记体需搅拌6-12h,而在7-9 时搅拌4h即可,20-251-2h，3730-45minvpH 值:pH低时，标记较慢，pH值偏高（大于10），抗体易变性，pH值9.0-9.5最为适宜，在弱碱性条件下FITC易溶解，同时免疫球蛋白的羧基容易暴露，便于两者结合。v反应液中荧光试剂和免疫球蛋白的比例:抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含20-25mg蛋白为宜。【注意事
13、项注意事项】v严格掌握整个反应体系中的抗体蛋白含量，可提高标记效率。v装柱及上样操作参照实验一。v最后洗脱时应注意掌握洗脱速度及每管收集量。前向角散射光（FSC）：反映细胞的大小荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术侧向角散射光（SSC）：反映细胞内的颗粒多少 荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术荧光免疫显微技术直方图分析：对细胞的某一个直方图分析：对细胞的某一个单参数进行统计分析单参数进行统计分析横坐标为荧光或散射光强度横坐标为荧光或散射光强度纵坐标为细胞数纵坐标为细胞数 荧光显微镜台式机荧光显微镜台式机-FACSCalibur双激光双激光-488nm 635nm四荧光参四荧光参数数分选、浓分选、浓缩系统缩系统大型机大型机-FACSVantage SE多激光多多激光多波长八荧光波长八荧光参数高速分参数高速分选单细胞点选单细胞点对点分选对点分选
