1、肝表面抗体肝表面抗体ELISA检测检测 实验实验目的目的1.1.掌握掌握ELISAELISA的原理和操作方法。的原理和操作方法。2.2.熟悉酶标仪的使用方法。熟悉酶标仪的使用方法。免疫标记技术免疫标记技术是用是用荧光素、酶荧光素、酶、或者、或者放射性核素放射性核素等标记抗体或等标记抗体或抗原，利用标记技术的高度敏感性进行的抗原抗体的反应。抗原，利用标记技术的高度敏感性进行的抗原抗体的反应。Y细胞1细胞2标记物标记物荧光素荧光素放色性核素放色性核素酶酶放射免疫技术放射免疫技术免疫荧光技术免疫荧光技术酶免疫技术酶免疫技术 酶免疫技术酶免疫技术用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。用酶标记的抗原或
2、抗体进行的抗原抗体反应。可用酶标测定可用酶标测定仪测定光密度（仪测定光密度（ODOD）来反应抗原或抗体含量，灵敏度可达到）来反应抗原或抗体含量，灵敏度可达到ng-pg/mlng-pg/ml水平。水平。Y酶酶酶具有高效催化性酶具有高效催化性：可以加快化学反应的速度：可以加快化学反应的速度 ；在反应前后，；在反应前后，没有质和量的改变；微量的酶便可发挥巨大的催化作用。没有质和量的改变；微量的酶便可发挥巨大的催化作用。DH2+H2O2D+2H2O酶酶无色无色有色有色 酶免疫技术酶免疫技术酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶免疫组化法酶免疫组化法用于检测可溶性抗用于检测可溶性抗原或抗体原或抗体用于检测组
3、织中或用于检测组织中或细胞表面的抗原细胞表面的抗原酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验-ELISA ELISA是一种免疫测定（是一种免疫测定（immunoassay，IA）。）。抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记；抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物；产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。性或定量分析。ELISAELISA的类型的类型 间接法（间接法（测抗体测抗体）双抗体夹心法（双抗体夹心法（测大分子抗原测大分子抗原）竞争法（竞争
4、法（测小分子抗原测小分子抗原）间接法间接法将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；加酶标抗体：与固相抗原抗体复合物中的加酶标抗体：与固相抗原抗体复合物中的 抗体结合，使该抗体问接地标记上酶；抗体结合，使该抗体问接地标记上酶；加受检血清：其特异抗体与抗原结合，加受检血清：其特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。形成固相抗原抗体复合物。固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用就可利用同一酶标抗抗体同一酶标抗抗体建立检测
5、相应抗体的方法建立检测相应抗体的方法。双抗体夹心法双抗体夹心法特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物；标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物；加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，酶量与标本中受检物质的量成正相关；酶量与标本中受检物质的量成正相关；酶标抗体血清样品或参比品底物加底物：夹心式复合物中的酶催化加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物底物成为有色产物酶标仪测定OD值终止液根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量
6、根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被就可用于包被固相载体固相载体和制备和制备酶结合物酶结合物而建立此法。而建立此法。竞争法竞争法 用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体表面，以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和待测抗原的混经洗涤后分成两组：一组加酶标
7、记抗原和待测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。抗原的量。这种这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位就可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程，但需用较多量的酶标记抗原。操作步骤操作步骤 1.1.从冰箱取出试剂盒，室温平衡从冰箱取出试剂盒，室温平衡3030分钟。分钟。2.2.按如下方式加按如下方式加待测血清待测血清，每孔，每孔1 1滴。滴。待待2 2待待3 3待待1 1
8、阳性阳性阴性阴性空白空白3.3.每孔加每孔加酶结合物酶结合物1 1滴（滴（孔上方悬空滴加，无气泡孔上方悬空滴加，无气泡），混匀，），混匀，空白孔不加，置空白孔不加，置3737度温箱度温箱3030分钟。分钟。4.4.取出反应板，弃液，拍干。取出反应板，弃液，拍干。5.5.每孔每孔注满注满洗涤液洗涤液，（，（不要溢出不要溢出）静置）静置5 5秒后弃液，拍干，秒后弃液，拍干，重复洗涤重复洗涤5 5次，拍干。次，拍干。6.6.每孔加每孔加显色剂显色剂A A和和B B各各1 1滴，置滴，置3737度温箱度温箱1515分钟。分钟。7.7.每孔加每孔加终止液终止液1 1滴混匀，观察结果。滴混匀，观察结果。结
9、果观察结果观察 结果观察结果观察乙型肝炎病毒采用乙型肝炎病毒采用ELISAELISA检测法具有检测法具有操作简便操作简便、灵敏度高灵敏度高、试试剂成本低剂成本低、环保环保和和适用于大批量人群适用于大批量人群抗原、抗体筛查等优点抗原、抗体筛查等优点,目前在国内实验室被广泛使用。目前在国内实验室被广泛使用。缺点易产生缺点易产生假阳性假阳性结果。结果。酶标仪洗板机酶标仪洗板机 排枪加样排枪加样酶标仪酶标仪乙肝病毒（乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）抗原,抗体:1、表面Ag（HBsAg）HBsAb2、核心抗原（HBcAg）HBcAb3、e抗原（HBeAg）HBeAb两对半：HBsAg HBsAb HBcAb HBeAg HBeAb HBV-Ag、Ab检测结果临床分析检测结果临床分析HBsAg HBeAg HBsAb HBcAb HBeAb +-HBV感染/无症状携带者 +-急性/慢性乙肝/无症状携带者 +-+急性/慢性乙肝 （传染性强，大三阳）+-+急性感染趋向恢复（小三阳）-+既往感染恢复期 -+-既往感染恢复期 -+既往感染或“窗口期”-+-既往感染或接种过疫苗
