1、第七章第七章7外源化学物致突变作用(chemical mutagenesis)【目的要求】掌握突变、致突变作用、致突变物的基本概念；熟悉突变的类型（基因突变、染色体畸变与数目改变）以及生殖细胞、体细胞突变的主要后果;熟悉致突变试验的方法分类及其配套原则;了解常见的致突变试验的方法的原理与意义。2【主要内容】概述化学毒物致突变的类型化学毒物致突变作用的机制与后果机体对致突变作用的影响观察化学毒物致突变作用的基本方法3第一节 概 述4外源化学物致突变作用突变（mutation）是指遗传结构本身的变化及其引起的变异。即生物体的遗传物质发生了突然的、根本的、遗传的变化。这种变化起源于基因和染色体，是可
2、遗传的变异。一、基本概念 变异（variation）由于普遍存在的内外环境因素的影响，在种族世代繁衍的过程中，亲代与子代或子代之间出现不同程度上的生物学性状的差异。1901年De Vries 首次提出突变这一术语1909年摩尔根发现在红眼果蝇中有白眼果蝇 5外源化学物致突变作用遗传毒理学（genetic toxicology）致突变作用（mutagenesis）致突变物（mutagen）遗传毒物（genetic agent）6外源化学物致突变作用研究化学性和放射性物质的致突变作用以及人类接触致突变物可能引起的健康效应的科学。是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此
3、种改变可随同细胞分裂过程而传递。凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。由于致突变物能损伤遗传物质，因此致突变物又称为遗传毒物。二、突变的主要类型1.自发突变（spontaneous mutation）在普遍存在的未知因素的作用下，生物体在自然条件下发生的突变。2.诱发突变（induced mutation）人为的用已知的某种化学、物理和生物因素所引起的突变。7外源化学物致突变作用特点：发生过程长、频率很低，与物种进化有关。通常只发生在某一个基因位点上，而且通常是隐性的。特点：发生过程短、频率高，可被人类利用（筛选或转基因技术等），也可能对人类产生危害（遗传毒性）。
4、第二节 化学毒物致突变的类型8外源化学物致突变作用基因突变染色体畸变碱基置换移码突变结构异常数目改变突变整码突变片段突变9外源化学物致突变作用一、基因突变（genetic mutation）是指基因中DNA序列的变化，即DNA碱基组成和排列顺序的改变。由于基因突变限制在某一特定的部位又称点突变（point mutation）。可分为碱基置换和移码突变两种类型1.碱基置换（base subsititution）：类型:转换（transition）：即嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的变化。颠换（transversion）：即嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的变化。10外源化学物致突变作用某一碱基配对性能改变或脱落所
5、致的突变。即DNA分子内一个碱基被另一个碱基所替代。11外源化学物致突变作用组成碱基对的碱基包括腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)同义突变(missense mutation)：指没有改变基因产物氨基酸序列的改变碱基置换的后果错义突变(synonymous mutation)：指碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变无义突变(nonsense mutation)：指某个碱基的改变使代表某个氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子，导致多肽链在成熟之前终止合成的改变12外源化学物致突变作用遗传密码子13外源化学物致突变作用苯丙氨酸-Phe；亮氨酸-Leu；异
6、亮氨酸-Ile；蛋氨酸-Met；缬氨酸-Val；丝氨酸-Ser；脯氨酸-pro；苏氨酸-Thr；丙氨酸-Ala；酪氨酸-Tyr；组氨酸-His；谷氨酰胺-Gln；天冬酰胺-Asn；赖氨酸-Lys；天冬氨酸-Asp；谷氨酸-Glu；半胱氨酸-Cys；色氨酸-Trp；精氨酸-Arg；甘氨酸-Gly32114外源化学物致突变作用2.移码突变（frameshift mutation）：15外源化学物致突变作用指发生一对或几对不等于3的倍数的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译为不正常的氨基酸。移码突变结果：是从原始损伤的密码子开始一直到信息末端的氨基酸序列 完全改变
7、。使读码框架改变其中某一点形成无义密码，于是产生一个 无功能的肽链片段移码较易成为致死性突变16外源化学物致突变作用二、染色体畸变 定义：指染色体的结构改变。通常由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失或引起各种重排，从而出现染色体结构的异常。根据畸变涉及的范围分为染色单体型畸变与染色体型畸变。17外源化学物致突变作用染色体结构改变的基础是DNA链的断裂，表明遗传物质严重的损伤，可在光学显微镜下观察到某些损伤的类型。(1)缺失(deletion)：染色体上丢失了片段。末端缺失:ABCDEABCD 中间缺失:ABCDEABCE(2)重复(duplication)：染色体连续出现两段或两
8、段以上完全相同的片段。ABCDEABCDEde(3)倒位(inversion):染色体片段在染色体内作180的颠倒。根据倒位的染色体有无着丝点分为臂间倒位与臂内倒位。ABCDEFGABCEDFG(4)易位(translocation):非同源染色体间相互交换了染色体片段。ABCDEABCIJ FGHIJFGHDE染色体的结构异常的类型 1.稳定性畸变：可通过细胞分裂而传递下去的畸变类型。18外源化学物致突变作用染色体结构异常示意图19外源化学物致突变作用2.不稳定性畸变：这种类型的畸变常由于丧失重要的遗传物质或有丝分裂的机械障碍导致细胞死亡。20外源化学物致突变作用无中心粒片段、双中心粒染色体
9、、环状染色体及各种其他不对称重排等。染色体畸变裂隙(gap)断裂(break)断片(fragment)和缺失(deletion)微小体(minute body)无着丝点环环状染色体 双着丝点染色体 倒位(inversion)易位(translocation)插入(insertion)和重复(duplication)辐射体 21外源化学物致突变作用染色体畸变的后果涉及的基因数量非常大，可对整个基因组造成严重影响；22外源化学物致突变作用双着丝粒、环、无着丝粒断片等不稳定的畸变，在细胞分裂过程中容易丢失导致细胞死亡；缺失、倒位、重复及易位等稳定的畸变，在细胞分裂过程中细胞的复制不受影响，故畸变可通
10、过细胞分裂传给子代，并可能导致遗传性疾病。三、染色体数目改变正常体细胞染色体数目为2n，染色体数目异常可能表现为单条或多条或成倍性染色体数目的增减。23外源化学物致突变作用非整倍体：指细胞丢失或增加一条或几条染色体。如：缺体(2n-2)、单体(2n-1)、三体(2n+1)、四体(2n+2)多倍体：指染色体数目以染色体组为单位成倍的增加。如：三倍体(3n)、四倍体(4n)。影响：将导致基因平衡的失调，能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常，对生殖细胞有时可能致死性的。如：21-三体综合征(Down氏综合征、先天愚型）；在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中常见三倍体细胞的存在。染色体数目异常的基
11、本类型注：A、B、C、D代表非同源染色体 24外源化学物致突变作用Take a break25外源化学物致突变作用第三节 化学毒物致突变作用的机制及后果26外源化学物致突变作用一、引起突变的DNA变化烷化剂(alkylating agent)：是指对DNA和蛋白质具有强烈烷化作用的物质。（一）碱基损伤1.碱基错配致突物攻击DNA链上的碱基（共价结合）碱基错误配对基因突变或染色体畸变主要致突变物：烷化剂27外源化学物致突变作用目前认为最常受到烷化的位点是:鸟嘌呤的N-7位，其次是O-6位 腺嘌呤的N-1、N-3和N-7也易烷化AP位点(apurinic or apyrimidinic site)
12、：是指丢失碱基的DNA留下了一个无嘌呤或无嘧啶的位点。一般情况下甲基化乙基化高碳烷基化烷化作用：指烷化剂提供甲基或乙基等烷基与DNA共价结合的过程。28外源化学物致突变作用2.平面大分子嵌入DNA链嵌入剂(intercalating agent)：指能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间的物质。如丫啶类染料分子多数是多环的平面结构，特别是三环结构，其长度为6.8102nm，恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍。通常引起移码突变29外源化学物致突变作用3.碱基类似物取代：4.破坏或改变碱基的化学结构：30外源化学物致突变作用致突物的结构与碱基相似即碱基类似物
13、细胞DNA合成期（S期）取代正常的碱基错配碱基置换。常见的致突变物：Brdu胸腺嘧啶 2-氨基嘌呤鸟嘌呤致突物对碱基产生氧化作用破坏或改变碱基结构碱基置换、染色体畸变 如：亚硝酸盐、甲醛、氨基甲酸乙酯等1.二聚体的形成：紫外线照射DNA链环丁烷嘧啶二聚体和（4-6）光产物大损伤染色体畸变。这类大损伤可阻止DNA复制并引起细胞死亡2.DNA加合物形成：致突物与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合物突变（碱 基置换、移码突变）DNA加合物形成可活化癌基因 如：烷化剂、芳香胺、多环芳烃、黄曲霉毒素以及一些植物毒素等3.DNA-蛋白质交联物（DPC）形成：致突物细胞内DNA与蛋白质稳定的共价结合物（
14、DPC）影响DNA构象与功能染色体畸变 如：烷化剂、B(a)P、砷化合物、醛类化合物及重金属等。（二）DNA链受损 31外源化学物致突变作用二、引起突变的细胞分裂过程改变致突物纺锤体、中心粒和其他核细胞器干扰细胞有丝分裂染色体分离异常产生非整倍体和多整倍体。如：秋水仙碱、常春新碱、灰黄霉素等秋水仙碱是典型的引起细胞分裂完全抑制的物质，因此这种效应又称秋水仙碱效应或细胞有丝分裂有些干扰剂仅使细胞群体的有丝分裂数减少，被称之为抗有丝分裂剂32外源化学物致突变作用三、其他间接诱变机制1.致突物DNA合成酶和修复酶类酶活性下降或丧失DNA复制高保真性改变、DNA修复障碍突变2.致突物组蛋白和非组蛋白遗
15、传结构的完整性和基因表达调控改变突变33外源化学物致突变作用四、突变的后果 突变的后果取决于化学毒物所作用的靶细胞体细胞：其影响仅能在直接接触该物质的个体身体上表现出来，不可能遗传到下一代。生殖细胞：其影响有可能遗传到下一代。34外源化学物致突变作用DNA损伤修复的效率体 细 胞 突 变生 殖 细 胞 突 变良性肿瘤恶性转化细胞衰老分化的胚胎细胞受损未分化胚胎细胞受损显性致死隐性致死存活突变动脉硬化未知病变癌变老化出生缺陷（流产/死胎）癌变出生缺陷（功能或结构畸的形）流产死产出生缺陷基因负荷增加先天性疾病突变后果示意图35外源化学物致突变作用1.生殖细胞突变的后果显性致死：突变配子与正常配子结
16、合后，突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡在着床前或着床后的早期胚胎死亡 隐性致死：需要纯合子或半合子才能出需要纯合子或半合子才能出现死亡效应（1）致死性突变：先天畸形等遗传性疾病 遗传易感性改变（2）非致死性突变（可遗传的改变）:36外源化学物致突变作用生物个体生殖细胞发生突变或染色体畸变后，有些可能会在世代传递、选择过程中在人群中固定下来，增加人类下一代基因库的遗传负荷。遗传负荷（genetic load）：指人群中每个个体所携带有害基因或致死基因的平均水平。基因库（gene pool）：指某一物种在特定时期中能将遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和。
17、37外源化学物致突变作用2.体细胞突变的后果（1）癌变：体细胞突变是细胞癌变的重要基础，在许多肿瘤中，都可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在 缺失、易位、倒位等染色体畸变。（2）致畸胎：致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，所以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果。（3）其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老。38外源化学物致突变作用第四节 机体对致突变作用的影响39外源化学物致突变作用一、DNA损伤的修复机体修复DNA损伤的机制分为两大类：（二）DNA修复机制（一）损伤耐受机制损伤耐受：指DNA遗传可绕过那些阻止DNA复制的DNA损伤。如：细菌的重组修复。1.直接修复 2.切除修复
18、40外源化学物致突变作用DNA修复直接修复切除修复“适应性”反应光复活核苷酸切除修复碱基切除修复误配修复复制后修复呼救性修复41外源化学物致突变作用指引起DNA损伤的反应为可逆性的。依赖某种酶的作用，为一步完成的修复机制。1.直接修复：（1）光复活（photoreactivation）：修复紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体，广泛存在原核和真核生物体内。所依赖的酶为“光裂合酶”（photolyase）（2）“适应性”反应：主要是O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）修复鸟嘌呤 O6 位的烷基化损伤。42外源化学物致突变作用（5）呼救性修复：SOS修复（易错修复）指将损伤或不正确的甲基去除和
19、替换。是多步骤修复过程，需多种酶的参与。2.切除修复有下列五类修复方式：（1）核苷酸切除修复：最常见的修复机制（2）碱基切除修复（4）复制后修复：损伤耐受过程（3）误配修复：细菌误配修复：DNA糖基酶作用、“AP位点”43外源化学物致突变作用任何DNA损伤，只要修复无误，突变就不会发生；如果修复错误或未经修复，损伤就得以固定下来，于是发生突变。因此，诱发突变是一个受控制的过程，失控才真正发生突变。化学致突变作用模式：损伤-修复-突变44外源化学物致突变作用遗传毒物 终致突变物+DNA 加合物 DNA损伤DNA复制 损伤正在复制的DNA 突变 修复 无错细胞 存活易错修复复制后修复细胞 存活加合
20、的碱 基错配 解毒 细胞死亡、静 止 状 态 的细胞45外源化学物致突变作用二、遗传因素对致突变作用的影响先天性：即遗传因素，指遗传多态性，起决定作用。个体因素对致突变作用的影响：后天性：主要指不同生活方式，如吸烟、饮酒、营养 缺乏、年龄等。46外源化学物致突变作用(一)代谢酶遗传多态性：如细胞色素P-450、GST等具有多态性。47外源化学物致突变作用遗传多态性（genetic polymorphysm）：即群体中多态基因的比例。基因多态性（genetic polymorphysm）：当一个基因座位的最常见的等位基因频率不超过0.95时，这个基因座位即是多态性。代谢酶多态性：由于遗传背景的差
21、异和环境因素的作用，使不同个体的代谢酶活力及毒物代谢能力存在个体差异，因而对化学物及致癌物的易感性不同。（二）修复酶遗传多态性48外源化学物致突变作用修复酶存在多态性明显的个体差异修复能力差异机体对损伤的反应不同。修复损伤保持高保真复制修复不力或易错修复基因突变、肿瘤发生如：O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）聚（二磷酸腺苷-核糖）多聚酶（PARP）Take a break49外源化学物致突变作用第五节 观察化学毒物致突变作用的基本方法50外源化学物致突变作用致突变试验的目的检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测 其对人类的遗传危险性 检测外源化学物的致突变性，预测其对哺
22、乳动物和人的 致癌性51外源化学物致突变作用一、观察项目的选择 遗传学终点(genetic end point)：在致突变试验中观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点。（1）DNA完整性改变（形成加合物/断裂/交联）1.观察效应终点的类型：（5）染色体分离改变（非整倍体和多倍体）（4）染色体完整性改变（染色体畸变）（3）DNA碱基序列改变（基因突变）（2）DNA重排或交换（DNA修复合成、重组）52外源化学物致突变作用常见致突变试验遗传学终点分类53外源化学物致突变作用2.试验组合的原则试验组应包括每一类型的遗传学终点，如细胞回复突变试验、微核试验、细菌 DNA修复试验和体外姐妹染色单体
23、交换试验（SCE)。（遗传学终点的齐全）试验组中的指示生物应包括几个进化阶段，至少要包括原核细胞与真核细胞两个系统（包括有原核生物和真核生物）试验组应包括体内试验与体外试验（体内试验与体外试验相配合），体外试验（+S9和-S9)和体内试验细胞突变试验为阳性者有必要进行生殖细胞突变试验。（包括生殖细胞和体细胞）54外源化学物致突变作用二、常用的致突变试验 Ames试验 微核试验 染色体畸变分析 姐妹染色单体交换试验（SCE）果蝇伴性隐性致死试验 显性致死试验 程序外DNA合成试验 彗星试验 55外源化学物致突变作用1.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）正向突变鼠伤寒沙门氏菌原养型(his
24、+)鼠伤寒沙门氏菌突变型(his-)回复突变 代谢活化系统(S9)受试物Ames 试验原理示意图组氨酸突变菌(his-)在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，如回复突变成野生型（his+）后则可以生长。用组氨酸突变菌（his-）作为指示菌观察化学物的诱变性.56外源化学物致突变作用鼠伤寒沙门氏菌野生型（his）鼠伤寒沙门氏菌 突变型（his）正向突变回复突变受试物试验菌种(his-)S9试验菌种(his-)S9Ames试验原理57外源化学物致突变作用组氨酸突变菌(his-):在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长；回复突变成野生型(his+):可在不含组氨酸的最低营养平皿上生长；标准试验菌株有四
25、种:TA97 和TA98 检测移码突变、TA100 检测碱 基置换突变、TA102 对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感；这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏 感性。58外源化学物致突变作用结果判断只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物 不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。加S9混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物。59外源化学物致突变作用微核（micronucleus）：是指染色体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内，成为
26、一个或几个规则的次核，因比主核小，故称微核。2.微核试验（micronucleus test，MNT)常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞（PCE）做微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。主要是检出DNA断裂剂（染色体完整性改变）和非整倍体诱变剂（染色体分离改变）。60外源化学物致突变作用微核试验简单操作程序大鼠或小鼠每天染毒一次，连续四天第五天处死动物，取出骨髓，涂片，固定，染色计数PCE的微核细胞率61外源化学物致突变作用MNNCEPCEPCE：嗜多染红细胞MN：微核NCE：正染红细
27、胞62外源化学物致突变作用原理：在电泳槽中，DNA断片在电场的作用下，由细胞核中移出，并向阳极泳动，经荧光染色后见到细胞核和移出的DNA断片，形成有如彗星一样的彗星头和彗星尾，故又称彗星试验（comet test）。3.单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)在单细胞水平上定量检测DNA损伤。63外源化学物致突变作用彗星试验的基本步骤：在磨砂玻片制胶(三层)碱性裂解、解旋 电泳荧光染色、荧光显微镜观察测定彗星细胞头长、尾长64外源化学物致突变作用65外源化学物致突变作用三、致突变试验中的一些问题1.阴性、阳性对照的设立：阴性对照：即未处理对照或
28、溶剂对照 阳性对照：用某种已知能产生阳性反应的物质作对照 2.体外试验活化系统的采用 S9：是指经酶诱导剂处理大鼠后制备的肝匀浆，再经9,000g离心分离所得上清液，其中含有微粒体和胞溶质。S9混合液（S9 mix)：在S9中再加入一些辅助因子（如NADP、葡萄糖-6-磷酸等）。肝S9的主要成分是混合功能氧化酶66外源化学物致突变作用3.致突变试验的质量控制措施（1）盲法观察（2）阴性对照和阳性对照的设立（3）资料的统计学分析（4）试验结果的重现性 4.阴性结果的判定条件（1）最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量；（2）各剂量的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突
29、变能力的某些外源化学物；（3）阳性结果应当具有剂量-反应关系，即剂量越高，致突变效果越大，并在一组或多组的观察值与阴性对照之间有显著差异。67外源化学物致突变作用本章毒理学英文词汇mutation（突变）mutagen（诱变物）gene mutation（基因突变）basepair substitution（碱基置换）frameshift（移码）chromosome aberration（染色体畸变）DNA damage repair（DNA损伤修复）genetic end point（遗传学终点）68外源化学物致突变作用1.突变、致突变作用、致突变物的基本概念2.突变的类型（基因突变、染色体畸变与数目改变）以及生殖细胞、体细胞突变的主要后果3.致突变试验的方法分类及其配套原则4.常见的致突变试验的方法的原理与意义本章要点69外源化学物致突变作用
