1、Our mission 愿景.for a healthier today and an even better tomorrowDedicated to improving the health and safety of people and the environment致力于改善人类的健康和促进我们生活环境的安全国际治疗路线HBV优化治疗路线图策略优化治疗路线图策略*由美国坦福大学医学中心Keeffe教授（专家组）提供各指南推荐的治疗终点 AASLD 2007 APASL 2008 EASL 2009HBeAg(+)CHB 患者患者HBeAg血清转换血清转换 (唯一的终点唯一的终点)HB
2、eAg血清转换血清转换和和/或或HBV DNA检测不检测不到到HBsAg 血清清除血清清除(“理想的终点理想的终点”)HBeAg 血清转换血清转换(“满意的终点满意的终点”)HBV DNA检测不检测不到到 HBeAg(-)CHB患者患者HBsAg血清血清清除清除 HBV DNA检测不到检测不到 以及以及ALT正常化正常化 HBsAg 血清清除血清清除(“理想理想的终点的终点”)HBV DNA检测不检测不到到 美肝会指南2008年美国肝病协会CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治疗终点，HBV DNA病毒载量尽可能小于或等于10 IU/ml。欧洲肝病研究学会EASL2010年指南指出：将HBV
3、 DNA病毒载量尽可能控制在10-15 IU/ml，能有效防止疾病的复发。欧肝会指南乙型肝炎病毒定量检测试剂注册申报技术指导原则乙型肝炎病毒（HBV）DNA定量检测试剂注册申报技术指导原则行业标准专家意见庄辉、鲁凤民等，庄辉、鲁凤民等，慢性乙型肝炎病毒慢性乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床意义定量检测的临床意义2012年年临床一线对超灵敏检测试剂需求旺盛临床阶段临床阶段 HBV DNA定量的目的定量的目的开始治疗前 确定患者乙肝感染的基线水平 选择针对性的药物 避免盲目用药治疗过程中 评估抗病毒治疗的效果 及时监测是否发生耐药 预测肝硬化、肝癌的发生风险治疗末期 确定治疗终点 为医生什么时候停止
4、治疗提供可靠依据治疗结束 每3-6个月定期监测HBV-DNA水平，监控疾病复发v 传统传统定量定量产品满足不了临床产品满足不了临床需求需求 临床用核酸提取试剂乙肝定量kit48测试/盒国食药监械（准）字2013第号2013年11月丙肝定量kit24测试/盒国食药监械（准）字2011第号2011年5月核酸提取kit32测试/盒沪青械备号2014年12月高灵敏：高灵敏：HBV 检测下限：20 IU/ml (2013年11月已拿到新证)HCV 检测下限：15 IU/ml (预计16年3月拿到新证)国家国家CFDACFDA技术审评中心技术审评中心HBV DNA/HCV RNA HBV DNA/HCV
5、RNA 定量试剂技术审评指导原则定量试剂技术审评指导原则中指出：中指出：HBV DNAHBV DNA最低检测限应最低检测限应 30IU/ml30IU/ml HCV RNA HCV RNA最低检测限应最低检测限应 50IU/ml50IU/mlPKI临床高敏定量检测产品方法学方法学 method磁珠法磁珠法 paramagnetic particle method样本类型 sample血清、血浆 serum or plasma上样量 sample volume200400ul检测型别 genotypesHBV A-H基因型线性范围 LOQ20 IU/mL-2*109 IU/mL灵敏度 LOD 20
6、 IU/mL注册证号国食药监械（准）字2013第号HBV产品性能高敏乙肝试剂对比试验开展单位北京大学医学部上海仁济医院湖北省人民医院上海第三人民医院温州医科大附属第一医院东营胜利油田中心医院昆明医学院第一附属医院沧州传染病医院中山大学附属第一医院北京三零二医院高敏乙肝试剂对比试验开展单位浙江PCR培训班现场评价重庆PCR培训班现场评价广州PCR培训班现场评价烟台PCR培训班现场评价一、北大医学部溯源性评价1重复性评价234临床血清盘评价线性范围评价Day 1:Genotype A Panel:WHO HBV Standard（NIBSC code:10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA
7、抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1Repeat 2Repeat 3PKI 稀释至20、50、200、2,000、20,000 IU/ml五个浓度值Day 2&3:repeat the above testing pattern1.WHO 标准血清盘可溯源性检测方案理论值理论值(IU/ml)理论值理论值(lg IU/ml)实测值实测值(lg IU/ml)相对偏差相对偏差(lg IU/ml)标准差标准差(lg IU/ml)200004.3014.210-0.0910.09520003.3013.24
8、8-0.0530.1442002.3012.3120.0110.145501.6991.7240.0250.111201.3011.4410.1400.225该该HBV定量试剂具有良好的溯源性定量试剂具有良好的溯源性PKI HBV定量试剂对WHO标准品溯源性检测结果灵敏度 WHO标准品（A亚型）2E42E32E25020105LOD can reach to 10 IU/ml；about 70%of 5 IU/ml could be detected.Day 1:Genotype B:卫生部临床检验中心（GBW09150）Genotype C:中国药品生物制品检定研究院Genotype D:S
9、eraCare公司（WWHD301-10）Rep 1Rep 2Rep 3Rep 4Rep 5Rep 6Genotype B/C/DPanelPKI 稀释至20、50、200、2,000、20,000 和200,000 IU/ml六个浓度Day 2&3:repeat the above testing pattern2.HBV B/C/D亚型的重复性比较方案HBV基因型基因型理论值理论值(IU/ml)理论值理论值(lgIU/ml)检测次数检测次数实测值实测值(lg IU/ml)相对相对偏差偏差(lg IU/ml)标准差标准差（lg IU/ml）LognormalCV%HBV B型型2000005
10、.301185.3290.0280.0581.096200004.301184.3760.0750.1082.46420003.301183.3840.0830.1303.8312002.301182.4200.1190.1215.000501.699181.7760.0050.1649.235201.301181.4480.1470.23916.502HBV C型型2000005.301185.3240.0230.0160.307200004.301184.3200.0190.0190.44020003.301183.3070.0060.0381.1652002.301182.340.039
11、0.0421.815501.699181.7170.0180.0985.754201.301181.4340.1330.1278.863HBV D型型 2000005.301185.145-0.1560.0751.462200004.301184.251-0.0500.0721.69920003.301183.187-0.1140.1605.0082002.301182.229-0.0730.2179.756501.699181.684-0.0150.25815.341201.301181.3010.0000.28722.068PKI HBV定量试剂对HBV B/C/D亚型标准血浆检测精密度评
12、价该该HBV定量试剂具有良好的重复性定量试剂具有良好的重复性重复性 临检中心标准品（B亚型）2E52E42E32E2503 repeat tests each concentration20System shows good repeatabilityRep 1Rep 2Rep 3高浓度假病毒颗粒PKI 稀释至20、50、100、1000、100001.0E+10 IU/ml等 11个浓度值试剂盒线性范围：20-109 IU/ml3.线性范围评价方案改良Doumas法该试剂的线性范围可达到（该试剂的线性范围可达到（201E+09）IU/ml线性范围分析改良Doumas法E9E8E7E6E5E4
13、E3E25020negativeSystem shows good linear relationship in the concentration range of 201E9IU/ml.线性范围图4.临床血清盘评价双盲法对比测试84例临床样本符合率100%其中2例样本低于两种检测试剂的检测下限20 IU/ml，两种试剂均可检出。Deming regression（图）分析结果显示：两中试剂的相关性较好（r=0.968，p0.0001）；二者关系为PKI=0.340+0.975*Roche；总符合率：总符合率：100%PKIposnegRochepos440neg040Correlation
14、 with Roche 该HBV定量检测试剂在溯源性、精密度及线性范围方面均有良好表现，临床样本检测与进口试剂具有良好的相关性。试剂考评结论二、上海仁济医院溯源性评价/准确度评价1批内/批间重复性评价234临床血清盘评价线性范围评价5检测限评价Genotype A Panel:WHO HBV Standard（NIBSC code:10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1Repeat 2Repeat 3PKI 稀释至20、50、100、1,000、10,0
15、00 IU/ml五个浓度值1.WHO 标准品准确度检测方案该该HBV定量试剂具有良好的溯源性和准确度定量试剂具有良好的溯源性和准确度PKI HBV定量试剂准确度检测结果Day 2&3&4:repeat the above testing pattern2.重复性比较方案批内重复:Rep 16次10号样本（2E7）浓度稀释至3E5，共8mlPKI 10号样本（2E7）浓度稀释至3E3，共8ml批间重复:Rep 4次9个5次方浓度样本混合成8ml，分装4管PKI 9个3次方浓度样本混合成8ml，分装4管Day1:Day 1:直接测试直接测试16次次批内重复性检测结果该该HBV定量试剂具有良好的重复
16、性定量试剂具有良好的重复性(Coefficient of Variance)批间重复性检测结果该该HBV定量试剂具有良好的重复性定量试剂具有良好的重复性Rep 1Rep 2Rep 3高浓度假病毒颗粒PKI 稀释至20、50、100、1000、100001.0E+10 IU/ml等 11个浓度值试剂盒线性范围：20-109 IU/ml3.线性范围评价方案改良Doumas法该试剂的线性范围可达到（该试剂的线性范围可达到（201E+09）IU/ml线性范围分析Correlate4.临床样本评价方案8次方浓度样本8个PKI 3次方浓度样本8个7次方浓度样本8个2次方浓度样本8个6次方浓度样本8个5次方
17、浓度样本8个4次方浓度样本8个1次方浓度样本8个Roche 对比临床对比结果临床对比结果1098765432110987654321S0.258789R-Sq98.8%R-Sq(adj)98.8%lgRochelgPKIFitted Line PlotlgPKI=-0.1344+1.054 lgRoche5.检测限评价方案Genotype A Panel:WHO HBV Standard（NIBSC code:10/264）稀释均采用HBV 阴性人EDTA抗凝血浆：HBsAg negative and anti-HBcAb negativeGenotype A PanelRepeat 1Rep
18、eat 2Repeat 5PKI 稀释至50、20、10 IU/ml3个浓度值Repeat 3Repeat 4检测限结果三、湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360相对于过柱相对于过柱法提取，磁法提取，磁珠方法提取珠方法提取全血有更高全血有更高的得率的得率湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360将全血原倍样本重复提取将全血原倍样本重复提取3次测试，并稀释次测试，并稀释5倍、倍、10倍测试，结果表明磁珠方法提取全血具有更好倍测试，结果表明磁珠方法提取全血具有更好的重复性、梯度关系的重复性、梯度关系湖北省人民全血测评结果 on Chemagic 360Group260/
19、230260/280QIAGENPKIQIAGENPKI2.42.22.01.81.61.41.21.0DataIndividual Value Plot of 260/280,260/230四、北京302医院精密度四、北京302医院临床样本对比四、北京302医院棋盘交叉污染测评Unbeatable Solution Magnet offRotation onMagnet onMagnetic Beads based on(PVA)1 m chemagic Separation TechnologyBloodSaliva/SwabsPlasma(Pathogens)Standard Kits
20、for:Pre-NAT技术特点-3转移磁珠而不采用转移液体的方式进行核酸提取，可以有效的减少气溶胶的产生几率，具有良好的防污染效果，而且可以极大的减少样本处理时间。用旋转磁棒的方式进行液体搅拌，从而确保磁珠完全重悬并释放杂质。能够避免磁棒振动模式混匀、或者吹吸混匀的气溶胶产生的风险。通过电磁铁控制磁场，磁珠被转移到下一个提取组分中，无需转移液体。防污染措施1.紫外灯消毒，有效防止交叉污染。2.磁棒旋转式混匀，液面上升幅度小，可防止液体喷溅。3.转移磁珠的方法，减少了液体/气溶胶暴露的机会，从而减少污染。4.废弃枪头处理方式：直接打到专用垃圾袋，防止含病原体的枪头污染台面。5.每次实验后进行仪器
21、清洁：75%酒精擦拭台面。6.使用滤芯枪头。7.MSM1排风口引到pre-NAT外部，防止气流回流造成污染。8.设有移液回吸动作，防止阳性样本滴出造成污染。试验煮沸法合计阳性阴性PerkinElmer 阳性04747阴性033合计05050表1 相对符合率分析五、与国内煮沸法HBV 低于500 IU/ml 样本结果测评分析简要分析：简要分析：q 国产试剂HBV PCR试剂500IU/ml的样本50例，均报告阴性例，均报告阴性结果结果;q 使用Perkinelmer HBV PCR试剂只检出3例阴性，其余其余47例均有检测例均有检测结果结果；q 20IU/ml浓度以上假阴性率达到64%以上，且个
22、别结果达到E4 E5高浓度样本漏检；可见普通煮沸法可见普通煮沸法HBV 定量试剂临床漏检率特别高，给临定量试剂临床漏检率特别高，给临床诊治带来错误的诊断治疗依据。床诊治带来错误的诊断治疗依据。试验一步法合计阳性阴性PerkinElmer 阳性13092222阴性06464合计130156286表2 相对符合率分析与一步法 HBV PCR试剂 样本结果测评对比分析-1一步法一步法 HBV PCR试剂对比情况分析：试剂对比情况分析：q PE与一步法平行对比HBV样本，总计286例；q一步法定量下限500IU/ml，即有156个样本报阴性或无结果，PE定量下限20IU/ml，总计64个样本不报结果。
23、实际有92个弱阳性标本被漏报，占总检测数量的32.17%，风险相当大；国产：曲线平台期不明显，扩增效率低 重复性一般。PE：曲线呈典型S曲线，扩增效率高 重复性非常好一步法一步法 HBV PCR试剂对比情况分析：试剂对比情况分析：q两例样本结果两种试剂差异较大，复测；q一步法HBV试剂检测准确性差，因杂质未去除，试剂抗干扰抗干扰能力差能力差，重复性差重复性差，不稳定。qPE HBV 高敏试剂抗干扰能力强，稳定，重复性好。抗干扰能力强，稳定，重复性好。与一步法 HBV PCR试剂 样本结果测评对比分析-2样本样本1一步法一步法内标未起跳内标未起跳PE1.78E+06 IU/ml复测复测复测复测原
24、倍原倍内标仍未起跳内标仍未起跳1.7E+06 IU/ml稀释稀释10倍倍3.9E+05IU/ml样本样本2一步法一步法9.92E+02IU/mlPE9.26E+01 IU/ml复测复测复测复测1.36E+02IU/mlPE9.68E+01 IU/mlReal time PCR普通PCRPKI-超灵敏PCRPCR上样量上样量2ul40ul体系20ul60ul 提取提取DNA 方法学方法学 煮沸法磁珠法优缺点（纯度纯度）杂质多 扩增效率低 纯度纯度高 扩增效率高(1+x)n=AF，109 PCR产物分子高灵敏的关键要素 PerkinElmer 全自动核酸检测反应体系构建系统-Pre-NAT仪器型号
25、：Pre-NAT条码扫描：原始管上机，条码扫描读取仪器大小：2300mm x 810mm x 950mm样本通量：196个样本处理体积：最大1.2ml液体加样范围：5ul800ul处理时间：2小时完成96个样本的PCR体系构建加样器：4通道磁场控制：电磁铁提取方法：磁珠法-转移磁珠 Pre-NAT 工作流程Pre-NAT 工作站核酸提取、扩增前工作站核酸提取、扩增前PCR反应体系构建等过程无需人工操作反应体系构建等过程无需人工操作将您从繁琐的操作中解放出来将您从繁琐的操作中解放出来Walk awayPre-NAT 四大模块Pre-NAT 操作界面175ul Tip头头900ul Tip头头试剂
26、槽试剂槽PCR八联管八联管1.5ml管架管架样本架样本架洗针槽洗针槽深孔板深孔板磁棒套管磁棒套管垃圾槽垃圾槽客户操作流程-全自动核酸提取工作站启动客户端软件启动客户端软件点击开始按钮运行仪器点击开始按钮运行仪器Pre-NAT完成试剂分装、样本完成试剂分装、样本提取、提取、PCR反应液准备反应液准备根据软件提示完成根据软件提示完成1.选择所需程序选择所需程序2.摆放所需耗材及试剂摆放所需耗材及试剂3.扫码工作扫码工作PCR扩增扩增约 510 min约120min约90min 人工操作人工操作Walk awayAccusense（精确液面感应）技术 可以感应电离液和非电离液（如DMSO/甲醇等）。
27、可以设置高，中，低等感应灵敏度。可探测的最小体积 试管中100L 微孔板中50L每个通道取样头均具有液面感应功能，可独立探测液面并在Z轴方向独立运动，保证可同时操作具不同液面高度的离心管，减少一次性吸头外壁的吸附，精确移液。Pre-NAT技术特点-2JANUS 4道移液臂（Varispan Arm）：Varispan（移液头间距调整）技术自动调节Tip头间的间距：9-20 mm(4 通道)9-40 mm(8 通道)Pre-NAT其他技术特点Pre-NAT其他技术特点模块化设计模块化设计，通过智能计算模块位置精准定位。仪器内部配件、载架均可移到外部进行冲洗。从而更有效的做到防止交叉污染。安全门设计仪器门意外打开，或按紧急制动按钮时，自动暂停程序，排除意外后程序继续进行，不会造成整批样本报废的情况。Our mission We are taking action to improve the health and safety of people and the environment.为了改善人类健康和环境安全，我们不断在行动Thanks for your attention！Thank You世界触手可及世界触手可及携手共进，齐创精品工程携手共进，齐创精品工程
