1、生物化学蛋白质的共价结构医学知识一、蛋白质通论蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成碳碳50%氢氢7%氧氧23%氮氮16%硫硫03%其它（其它（P、Fe、Cu、I、Zn、Mo、Mn、Ca等）等）生物化学蛋白质的共价结构医学知识2定氮法测定蛋白质含量 氮为蛋白质的特征元素，将提取并纯化的蛋氮为蛋白质的特征元素，将提取并纯化的蛋白质用凯氏定氮法测定氮的含量，然后通过下列公白质用凯氏定氮法测定氮的含量，然后通过下列公式可以计算蛋白质的含量：式可以计算蛋白质的含量：蛋白质含量（蛋白质含量（mg/mlmg/ml）=蛋白氮（蛋白氮（mg/mlmg/ml）6.256.25 （或（或 =蛋白氮（蛋白氮（mg/mlm
2、g/ml）16%16%）生物化学蛋白质的共价结构医学知识3蛋白质的分类 仅由氨基酸缩合而成，不含其它成分的蛋白仅由氨基酸缩合而成，不含其它成分的蛋白质叫单纯蛋白质（质叫单纯蛋白质（simple protein）；还含有其它）；还含有其它成分的蛋白质叫缀合蛋白质（成分的蛋白质叫缀合蛋白质（conjugated protein），缀合蛋白质中的非蛋白质成分叫配体），缀合蛋白质中的非蛋白质成分叫配体（ligand），有些配体与蛋白质通过共价键结合，），有些配体与蛋白质通过共价键结合，有些通过非共价键结合。有些通过非共价键结合。生物化学蛋白质的共价结构医学知识4蛋白质的分类蛋白质还可以：蛋白质还可以：
3、按溶解性质分类（见按溶解性质分类（见P158表表4-1）按所含配体种类分类（见按所含配体种类分类（见P158表表4-2）按生物学功能分类（见按生物学功能分类（见P158表表4-3）生物化学蛋白质的共价结构医学知识5蛋白质的形状纤维状蛋白质纤维状蛋白质 球状蛋白质球状蛋白质 膜结合蛋白质膜结合蛋白质Collagen Myoglobin Bacteriorhodopsin生物化学蛋白质的共价结构医学知识6蛋白质的大小蛋白质蛋白质Mr残基数目残基数目/链链 亚基组织方式亚基组织方式细胞色素细胞色素c（马）（马）125001041己糖激酶（酵母）己糖激酶（酵母）960002004胰岛素胰岛素57332
4、1（A）30（B）血红蛋白（人）血红蛋白（人）64500141（）146（）22糜蛋白酶（牛胰）糜蛋白酶（牛胰）2260013（）132（）97（）生物化学蛋白质的共价结构医学知识7蛋白质的大小 蛋白质的分子量很大，并且分布范围也很大，蛋白质的分子量很大，并且分布范围也很大，一般在大约一般在大约6000110 6 道尔顿。蛋白质的分子量道尔顿。蛋白质的分子量主要由组成蛋白质的氨基酸残基的数目决定，对于主要由组成蛋白质的氨基酸残基的数目决定，对于缀合蛋白质来说，有些配体也在蛋白质的分子量中缀合蛋白质来说，有些配体也在蛋白质的分子量中占有很大的比重。蛋白质的分子量范围是人为规定占有很大的比重。蛋白
5、质的分子量范围是人为规定的，更小的氨基酸缩合物叫做肽。的，更小的氨基酸缩合物叫做肽。生物化学蛋白质的共价结构医学知识8蛋白质氨基酸残基数的估计 对于简单蛋白质，用对于简单蛋白质，用110除它的相对分子量除它的相对分子量即可约略估计出其氨基酸残基数目。即可约略估计出其氨基酸残基数目。20种常见氨基酸的平均分子量为种常见氨基酸的平均分子量为138 组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为128 每个氨基酸残基的平均分子量为每个氨基酸残基的平均分子量为110生物化学蛋白质的共价结构医学知识9蛋白质结构的组织层次一级结构指的是多肽链的氨基酸序列一级结构指的是多肽链的氨基酸序列二
6、级结构指的是多肽链借助于氢键排列成有规二级结构指的是多肽链借助于氢键排列成有规律的、局部的结构律的、局部的结构三级结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、三级结构是指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象折叠成具有特定走向的紧密球状构象四级结构指的是寡聚蛋白质亚基间的结合，亚四级结构指的是寡聚蛋白质亚基间的结合，亚基间不同的排列方式会形成不同的构象。基间不同的排列方式会形成不同的构象。生物化学蛋白质的共价结构医学知识10Lys-Cys-Phe-Ala-Ile-Glu-Cys-Leu 蛋白质的一级结构SSN端C端生物化学蛋白质的共价结构医学知识11蛋白质的二级结构“Shorth
7、and”-helix “Shorthand”-strand生物化学蛋白质的共价结构医学知识12蛋白质的三级结构Chymotrypsin space-filling model Chymotrypsin ribbon生物化学蛋白质的共价结构医学知识13蛋白质的四级结构生物化学蛋白质的共价结构医学知识14蛋白质的一级结构决定高级结构 在肽链内或肽链间有时也有在肽链内或肽链间有时也有 两个半胱氨两个半胱氨酸之间形成二硫键的连接。酸之间形成二硫键的连接。生物化学蛋白质的共价结构医学知识15蛋白质功能的多样性1 1催化；催化；2 2调节；调节；3 3转运；转运；4 4贮存；贮存；5 5运动；运动；6 6
8、结构成分；结构成分；7 7支架作用；支架作用；8 8防御和进攻；防御和进攻；9 9异常功能。异常功能。生物化学蛋白质的共价结构医学知识16二、肽肽的命名肽的命名 肽是两个至数百个氨基酸之间由肽键连接而成的肽是两个至数百个氨基酸之间由肽键连接而成的线状线状聚合物。根据形成肽的氨基酸数目，一般氨基酸聚合物。根据形成肽的氨基酸数目，一般氨基酸数目在数目在12个以内时，称为二肽、三肽、四肽等；个以内时，称为二肽、三肽、四肽等；13个个至至20个时称为寡肽（个时称为寡肽（oligopeptide）；）；20个以上称为多个以上称为多肽（肽（polypeptide）。当分子量大到一定程度时，就称）。当分子量
9、大到一定程度时，就称为蛋白质。寡肽和多肽的区分完全是人为规定的，其为蛋白质。寡肽和多肽的区分完全是人为规定的，其间的界限并不严格。间的界限并不严格。肽链中的氨基酸因肽链中的氨基酸因缺少了一分子水，叫做氨基酸缺少了一分子水，叫做氨基酸残基。残基。生物化学蛋白质的共价结构医学知识17肽的两端 一条肽链是有方向性的，肽链的一端具一条肽链是有方向性的，肽链的一端具有游离的有游离的氨基，称其为氨基，称其为N端；另一端具有端；另一端具有游离的游离的羧基，称其为羧基，称其为C端。有少数小分子端。有少数小分子量的肽，其首尾也缩合成肽键，成为环肽。量的肽，其首尾也缩合成肽键，成为环肽。生物化学蛋白质的共价结构医
10、学知识18肽的命名 对于小分子量的肽的命名，是从其对于小分子量的肽的命名，是从其N端开始，端开始，称为某氨酰某氨酰某氨酰称为某氨酰某氨酰某氨酰某氨基酸，下例写成某氨基酸，下例写成Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu，左边是，左边是N端，右边是端，右边是C端。端。生物化学蛋白质的共价结构医学知识19肽的命名 对于生物体内的具有特定结构和功能对于生物体内的具有特定结构和功能的小分子量肽，还有特别名称，如脑啡肽、的小分子量肽，还有特别名称，如脑啡肽、内啡肽、催产素、加压素等。内啡肽、催产素、加压素等。生物化学蛋白质的共价结构医学知识20肽基的C、O和N原子间的共振相互作用生物化学蛋白质的共价结构医
11、学知识21肽键共振的结果 限制肽键的自由旋转，给肽主链的每一个氨限制肽键的自由旋转，给肽主链的每一个氨基酸残基只保留两个自由度。基酸残基只保留两个自由度。组成肽基的组成肽基的4个原子和个原子和2个相邻的个相邻的C原子倾原子倾向于共平面，形成所向于共平面，形成所谓的多肽主链的酰胺谓的多肽主链的酰胺平面（平面（amide plane）或称肽平面（或称肽平面（peptide plane）。）。肽平面肽平面生物化学蛋白质的共价结构医学知识22肽键共振的结果 CN 键的长度为键的长度为0.133nm，比正常的，比正常的 CN 单键（单键（0.145nm）短，但比典型的）短，但比典型的 C=N 键键（0.
12、125nm）长。估计肽基中的）长。估计肽基中的 CN 键具有键具有约约40%的双键性质，而的双键性质，而 C=O 键具有键具有40%的单键的单键性质，在室温下足以防止性质，在室温下足以防止 CN 键旋转。键旋转。杂化的中间态酰胺带有杂化的中间态酰胺带有0.28个净正电荷，羰个净正电荷，羰基带有基带有0.28个净负电荷，肽键具有永久偶极。个净负电荷，肽键具有永久偶极。生物化学蛋白质的共价结构医学知识23肽基的顺、反构型 肽平面内，两个肽平面内，两个C可以处于顺式或反式构型。可以处于顺式或反式构型。因为顺式构型两个因为顺式构型两个R基有空间位阻，所以反式构型基有空间位阻，所以反式构型比顺式构型稳定
13、，因此肽链中肽键几乎都是反式构比顺式构型稳定，因此肽链中肽键几乎都是反式构型。型。生物化学蛋白质的共价结构医学知识24脯氨酸的亚氨基形成的肽键 Of the peptide bonds between amino acid residues other than Pro,over 99.95%are in the trans configuration.For peptide bonds involving the imino nitrogen of proline,however,about 6%are in the cis configuration;many of these occur
14、 at turns.trans cis生物化学蛋白质的共价结构医学知识25肽的物理化学性质由于由于短肽晶体的熔点都很高，说明短肽的晶体短肽晶体的熔点都很高，说明短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。在在pH014范围内，肽键中的酰胺氢不解离，范围内，肽键中的酰胺氢不解离，所以肽的酸碱性主要决定于肽链末端的所以肽的酸碱性主要决定于肽链末端的羧基、羧基、氨基以及氨基以及R基团上的可解离基团。基团上的可解离基团。因为肽链末端的因为肽链末端的羧基和羧基和氨基相距很远，氨基相距很远，它们之间的静电引力较弱，所以它们的酸碱性比它们之间的静电引力较弱，所以它们
15、的酸碱性比氨基酸的氨基酸的羧基和羧基和氨基弱。氨基弱。R基上可解离基基上可解离基团的解离常数也有所变化。团的解离常数也有所变化。在某一在某一pH下，肽中各可解离基团解离得到的净下，肽中各可解离基团解离得到的净电荷为电荷为0，这个，这个pH就是该肽的等电点。就是该肽的等电点。生物化学蛋白质的共价结构医学知识26肽的物理化学性质肽的化学反应和氨基酸的一致。肽的化学反应和氨基酸的一致。N端的氨基酸端的氨基酸残基也可以与茚三酮反应，这一反应可用于肽的残基也可以与茚三酮反应，这一反应可用于肽的定性和定量测定。定性和定量测定。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的，氨基酸没有双缩脲反应是肽和蛋白质特有的，氨基酸没有
16、此反应。一般含有两个或两个以上肽键的化合物此反应。一般含有两个或两个以上肽键的化合物与与CuSO4碱性溶液都能发生双缩脲反应，生成紫碱性溶液都能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色的络合物，利用这个反应可以用分红色或蓝紫色的络合物，利用这个反应可以用分光光度法（光光度法（540nm）测定蛋白质的含量。）测定蛋白质的含量。生物化学蛋白质的共价结构医学知识27双缩脲反应形成的络合物生物化学蛋白质的共价结构医学知识28双缩脲与肽的结构比较双缩脲双缩脲三肽三肽生物化学蛋白质的共价结构医学知识29三、蛋白质一级结构的测定蛋白质测序的策略蛋白质测序的策略首先要得到较纯的蛋白质样品，纯度应在首先要得到较纯的蛋
17、白质样品，纯度应在97%以上。以上。测出它的分子量。测出它的分子量。分析蛋白质中是否有非肽成分。分析蛋白质中是否有非肽成分。测定蛋白质分子中的多肽链的数目。测定蛋白质分子中的多肽链的数目。拆分多肽链。拆分多肽链。测定肽链的氨基酸组成。测定肽链的氨基酸组成。鉴定肽链的鉴定肽链的C末端氨基酸及末端氨基酸及N末端氨基酸。末端氨基酸。生物化学蛋白质的共价结构医学知识30蛋白质测序的策略酶水解肽链成短的肽段。采用两套以上的酶酶水解肽链成短的肽段。采用两套以上的酶水解方法，得到互相重叠的肽段。分离纯化水解方法，得到互相重叠的肽段。分离纯化这些肽段，并鉴定各肽段的这些肽段，并鉴定各肽段的C末端氨基酸及末端氨
18、基酸及N末端氨基酸。末端氨基酸。测定各肽段的序列。测定各肽段的序列。确定天冬酰胺、谷氨酰胺以及链内或链间二确定天冬酰胺、谷氨酰胺以及链内或链间二硫键的位置。硫键的位置。拼出完整肽链的序列。拼出完整肽链的序列。生物化学蛋白质的共价结构医学知识31N末端分析二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNFB法）：用法）：用DNFB（Sanger试剂）与肽链试剂）与肽链N末端的氨基反应，生末端的氨基反应，生成成DNP多肽或多肽或DNP蛋白质。然后水解肽链，蛋白质。然后水解肽链，分离得到分离得到DNP氨基酸，纸层析、薄层层析或氨基酸，纸层析、薄层层析或HPLC分离鉴定。分离鉴定。丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNS法）：
19、与法）：与DNFB法类似，法类似，由于丹磺酰氯有强烈荧光，灵敏度比由于丹磺酰氯有强烈荧光，灵敏度比DNFB法法高高100倍。倍。DNP-氨基酸氨基酸生物化学蛋白质的共价结构医学知识32N末端分析苯异硫氰酸酯法（苯异硫氰酸酯法（Edman降解法）：肽链与降解法）：肽链与PITC（Edman试剂）反应生成试剂）反应生成PTC多肽（苯氨基硫甲多肽（苯氨基硫甲酰多肽）或酰多肽）或PTC蛋白质，在酸性有机溶剂中加热蛋白质，在酸性有机溶剂中加热时，时，N末端的末端的PTC氨基酸发生环化，生成苯乙内氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物（酰硫脲的衍生物（PTH氨基酸）并从肽链上脱落氨基酸）并从肽链上脱落下
20、来，除去下来，除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。分离的。分离PTH氨基酸并鉴定。肽链可用于鉴定下氨基酸并鉴定。肽链可用于鉴定下一个氨基酸，所以此法可以用于测序。一个氨基酸，所以此法可以用于测序。氨肽酶法：根据游离氨基酸出现的时间顺序分析氨肽酶法：根据游离氨基酸出现的时间顺序分析N末端氨基酸。值得注意是不同的末端氨基酸。值得注意是不同的N末端氨基酸水解末端氨基酸水解的速度不同，有时难以分析。的速度不同，有时难以分析。PTH-氨基酸氨基酸生物化学蛋白质的共价结构医学知识33C末端分析肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解。肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发
21、生肼解。反应中除反应中除C末端氨基酸以游离形式存在外，其它氨末端氨基酸以游离形式存在外，其它氨基酸都转变成相应的氨基酸酰肼。反应中生成的基酸都转变成相应的氨基酸酰肼。反应中生成的氨基酸酰肼可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯氨基酸酰肼可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。上清液中游离的基衍生物而沉淀。上清液中游离的C末端氨基酸借末端氨基酸借助助DNFB法或法或DNS法鉴定。肼解过程中，天冬酰胺、法鉴定。肼解过程中，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸被破坏不易测出，精氨酸转谷氨酰胺、半胱氨酸被破坏不易测出，精氨酸转变成鸟氨酸。变成鸟氨酸。生物化学蛋白质的共价结构医学知识34肼解法反应式生物化学蛋
22、白质的共价结构医学知识35C末端分析还原法：肽链还原法：肽链C末端的氨基酸可用硼氢化末端的氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的锂还原成相应的氨基醇，肽链水解后层氨基醇，肽链水解后层析鉴定。析鉴定。生物化学蛋白质的共价结构医学知识36C末端分析羧肽酶法：目前常用的有羧肽酶法：目前常用的有4种羧肽酶：种羧肽酶：A、B、C和和Y。羧肽酶。羧肽酶A能释放除能释放除Pro、Arg和和Lys之外的任之外的任何一种何一种C末端氨基酸；羧肽酶末端氨基酸；羧肽酶B只能水解以碱性氨只能水解以碱性氨基酸基酸Arg和和Lys为为C末端的氨基酸；羧肽酶末端的氨基酸；羧肽酶C和和Y可可以释放任何一种以释放任何一种C末端氨基酸。
23、末端氨基酸。-Val-Ser-Gly生物化学蛋白质的共价结构医学知识37二硫桥的断裂 先加先加8mol/L尿素或尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白盐酸胍使蛋白质变性，再用氧化法或还原法断裂二硫键。质变性，再用氧化法或还原法断裂二硫键。还原法产生的巯基要用烷基化试剂如碘乙酸还原法产生的巯基要用烷基化试剂如碘乙酸保护起来，以免重新形成二硫键。保护起来，以免重新形成二硫键。生物化学蛋白质的共价结构医学知识38还原法断裂二硫桥巯基保护反应巯基保护反应生物化学蛋白质的共价结构医学知识39氧化法断裂二硫桥过甲酸过甲酸生物化学蛋白质的共价结构医学知识40氨基酸组成的分析酸水解分析除色氨酸外的其它氨基酸，碱水解分
24、酸水解分析除色氨酸外的其它氨基酸，碱水解分析色氨酸。析色氨酸。为了准确分析酸水解中被部分破坏的为了准确分析酸水解中被部分破坏的Ser、Thr、Tyr、Cys的量，酸水解的量，酸水解24、48、72小时后，分析小时后，分析这些氨基酸的量，然后外推至这些氨基酸的量，然后外推至0时得到这些氨基酸时得到这些氨基酸不被破坏时的量。不被破坏时的量。分析酸水解液中分析酸水解液中NH3的量，得出有多少个的量，得出有多少个Asn+Gln。氨基酸的分析：离子交换柱层析分离，茚三酮染氨基酸的分析：离子交换柱层析分离，茚三酮染色，比色定量。色，比色定量。生物化学蛋白质的共价结构医学知识41某些氨基酸含量随水解时间的变
25、化易被破坏的氨基酸易被破坏的氨基酸采用外推法测定采用外推法测定疏水氨基酸难以水解，疏水氨基酸难以水解，采用极限法测定采用极限法测定生物化学蛋白质的共价结构医学知识42氨基酸分析仪示意图加热加热生物化学蛋白质的共价结构医学知识43氨基酸分析仪示意图长柱用于分离酸长柱用于分离酸性和中性氨基酸性和中性氨基酸短柱用于分离碱短柱用于分离碱性氨基酸和氨性氨基酸和氨柱中填料为细粒聚苯乙烯柱中填料为细粒聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂磺酸型阳离子交换树脂生物化学蛋白质的共价结构医学知识44氨基酸的离子交换柱层析图谱洗洗脱脱曲曲线线生物化学蛋白质的共价结构医学知识45多肽链的部分裂解酶裂解法：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶
26、（糜蛋白酶裂解法：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、酶）、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶、梭菌蛋白酶等，它们各自有自葡萄球菌蛋白酶、梭菌蛋白酶等，它们各自有自己的水解专一性。蛋白酶分为内肽酶和外肽酶己的水解专一性。蛋白酶分为内肽酶和外肽酶（羧肽酶、氨肽酶）。（羧肽酶、氨肽酶）。化学裂解法：溴化氰（只裂解由化学裂解法：溴化氰（只裂解由Met的羧基的羧基形形成的肽键）、羟胺（裂解成的肽键）、羟胺（裂解Asn-Gly之间的肽键，之间的肽键，也能部分裂解也能部分裂解Asn-Leu及及Asn-Ala之间的肽键）。之间的肽键）。生物化学蛋白质的共价
27、结构医学知识46蛋白酶的专一性AECys生物化学蛋白质的共价结构医学知识47溴化氰裂解法溴化氰只裂溴化氰只裂解由解由Met的的羧基羧基形成的形成的肽键肽键生物化学蛋白质的共价结构医学知识48肽段的分离纯化凝胶过滤凝胶过滤凝胶电泳凝胶电泳高效液相色谱高效液相色谱生物化学蛋白质的共价结构医学知识49氨基酸序列测定质谱法：两台质谱仪联用，第一台质谱仪通质谱法：两台质谱仪联用，第一台质谱仪通过电喷射电离使肽段带上电荷，将不同大小的过电喷射电离使肽段带上电荷，将不同大小的肽段分离。第二台质谱仪分析肽段的序列。在肽段分离。第二台质谱仪分析肽段的序列。在第二台质谱仪上，小肽段在碰撞池中与氮气分第二台质谱仪上
28、，小肽段在碰撞池中与氮气分子或氩气分子碰撞，碎裂成依次少一个氨基酸子或氩气分子碰撞，碎裂成依次少一个氨基酸残基的碎片，分析这些碎片的质量差，可得出残基的碎片，分析这些碎片的质量差，可得出序列。序列。生物化学蛋白质的共价结构医学知识50串联质谱仪生物化学蛋白质的共价结构医学知识51串联质谱测序工作原理分离肽段分离肽段测序测序生物化学蛋白质的共价结构医学知识52氨基酸序列测定Edman降解法：由降解法：由N端向端向C端逐步降解。先将端逐步降解。先将被测肽段的羧基端固定到不溶性的树脂上，便于被测肽段的羧基端固定到不溶性的树脂上，便于分离切下的氨基酸和剩余的肽段。分离切下的氨基酸和剩余的肽段。酶降解法
29、：用外肽酶逐个切下氨基酸分析。只酶降解法：用外肽酶逐个切下氨基酸分析。只能分析很少的几个氨基酸。能分析很少的几个氨基酸。根据核苷酸序列的推定法：找到该蛋白质的基根据核苷酸序列的推定法：找到该蛋白质的基因，从基因的编码序列按三联密码推出氨基酸序因，从基因的编码序列按三联密码推出氨基酸序列。列。生物化学蛋白质的共价结构医学知识53所得资料：所得资料：N-末端残基末端残基 H C-末端残基末端残基S 第一套肽段第一套肽段 第二套肽段第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO借助重叠肽确定肽段次序：借助重叠肽确定肽段次序：末端残基末端残基 H S 末
30、端肽段末端肽段 H O W T A P S 第一套肽段第一套肽段 H O W T O U S E O V E R L A P S 第二套肽段第二套肽段 H O W T O U S E O V E R L A P S 推断全序列推断全序列 H O W T O U S E O V E R L A P S 肽段在多肽链中次序的决定 生物化学蛋白质的共价结构医学知识54二硫桥位置的确定 在保留二硫桥的情况下对蛋白质部分水解，在保留二硫桥的情况下对蛋白质部分水解，利用对角线电泳可以鉴定出哪些肽段带有二硫利用对角线电泳可以鉴定出哪些肽段带有二硫桥。对角线电泳是双向电泳，把水解后的肽段桥。对角线电泳是双向电
31、泳，把水解后的肽段混合物点到滤纸的中央，第一向将肽段按大小混合物点到滤纸的中央，第一向将肽段按大小和带电荷情况分离，然后把滤纸暴露到过甲酸和带电荷情况分离，然后把滤纸暴露到过甲酸蒸气中，使二硫桥断裂，再在同样的条件下进蒸气中，使二硫桥断裂，再在同样的条件下进行第二向电泳。行第二向电泳。生物化学蛋白质的共价结构医学知识55对角线电泳生物化学蛋白质的共价结构医学知识56对角线电泳生物化学蛋白质的共价结构医学知识57二硫桥位置的确定 二硫桥连接的两个肽段在第一向时是一个二硫桥连接的两个肽段在第一向时是一个斑点，第二向时成了两个斑点，并离开对角线。斑点，第二向时成了两个斑点，并离开对角线。对这两个斑点
32、相对应的肽段进行测序，如果两对这两个斑点相对应的肽段进行测序，如果两个肽段中各只有一个个肽段中各只有一个Cys，它们就是参与二硫，它们就是参与二硫桥的桥的Cys。根据这两个肽。根据这两个肽段的序列，可知它们段的序列，可知它们在整个肽链中的位置。在整个肽链中的位置。生物化学蛋白质的共价结构医学知识58酰胺位置的确定 对肽链进行各种部分水解，直到测得一个对肽链进行各种部分水解，直到测得一个肽段中只有肽段中只有1 1个天冬酰胺或谷氨酰胺为止。个天冬酰胺或谷氨酰胺为止。生物化学蛋白质的共价结构医学知识59四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能 有些来源于不同生物的蛋白质的氨基酸序列具有有些来源于不同生物的蛋
33、白质的氨基酸序列具有明显的相似性，这种序列上的相似性叫做同源性。同明显的相似性，这种序列上的相似性叫做同源性。同源蛋白质中有许多氨基酸残基是相同的，称为不变残源蛋白质中有许多氨基酸残基是相同的，称为不变残基，或保守性残基，而在不同物种的同源蛋白质中不基，或保守性残基，而在不同物种的同源蛋白质中不同的氨基酸残基称为可变残基。同的氨基酸残基称为可变残基。亲缘关系越近的同源亲缘关系越近的同源蛋白质的同源性越强。蛋白质的同源性越强。同源蛋白质往往在不同生物体中行使相同或相似同源蛋白质往往在不同生物体中行使相同或相似的功能，例如各种脊椎动物体内的血红蛋白就属于同的功能，例如各种脊椎动物体内的血红蛋白就属
34、于同源蛋白质。源蛋白质。生物化学蛋白质的共价结构医学知识60细胞色素C 细胞色素细胞色素C是一种含血红素的蛋白质，在线是一种含血红素的蛋白质，在线粒体中起电子传递的作用。大多数细胞色素粒体中起电子传递的作用。大多数细胞色素 C 含含一百零几个氨基酸残基，一百零几个氨基酸残基，40多多个物种的细胞色素个物种的细胞色素C氨基酸序氨基酸序列分析表明，有列分析表明，有28个残基是不个残基是不变的，所有细胞色素变的，所有细胞色素C在第在第17位上都是一个位上都是一个Cys残基，这个残基，这个残基是血红素结合的部位。残基是血红素结合的部位。生物化学蛋白质的共价结构医学知识61细胞色素C的不变残基此此区区域
35、域可可能能是是与与酶酶结结合合的的区区域域生物化学蛋白质的共价结构医学知识62不同物种细胞色素C的差异残基数黑猩猩黑猩猩绵羊绵羊响尾蛇响尾蛇鲤鱼鲤鱼蜗牛蜗牛天蛾天蛾酵母酵母花椰菜花椰菜欧防风欧防风人人01014182931444443黑猩猩黑猩猩1014182931444443绵羊绵羊20112427444646响尾蛇响尾蛇262833474543鲤鱼鲤鱼2626444746蜗牛蜗牛28485150天蛾天蛾444441酵母酵母4747花椰菜花椰菜13生物化学蛋白质的共价结构医学知识63根据细胞色素C建立的系统树哺乳类哺乳类鸟和爬虫类鸟和爬虫类硬骨鱼类硬骨鱼类软骨鱼类软骨鱼类真菌真菌昆虫昆虫两栖
36、类两栖类植物植物生物化学蛋白质的共价结构医学知识64氧合血红素蛋白质 肌肉中的氧合血红素蛋白质肌肉中的氧合血红素蛋白质肌红蛋白肌红蛋白（Myoglobin）由一条肽链组成，含）由一条肽链组成，含153个氨基酸残个氨基酸残基，红细胞中的血红蛋白（基，红细胞中的血红蛋白（Hemoglobin）是一个由）是一个由两条两条链（每条链链（每条链141个氨基酸残基）和两条个氨基酸残基）和两条链链（每条链（每条链146个氨基酸残基）组成的四聚体蛋白。肌个氨基酸残基）组成的四聚体蛋白。肌红 蛋 白、血 红 蛋 白 的红 蛋 白、血 红 蛋 白 的 链 和链 和 链 都 是 珠 蛋 白链 都 是 珠 蛋 白（g
37、lobin），它们有很高的序列同源性，通过血红素），它们有很高的序列同源性，通过血红素结合氧的能力都被这结合氧的能力都被这3种多肽链保留下来了。种多肽链保留下来了。生物化学蛋白质的共价结构医学知识65氧合血红素蛋白的进化树生物化学蛋白质的共价结构医学知识66丝氨酸蛋白酶类 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶以及纤溶酶都是丝氨酸蛋白酶，它们有凝血酶以及纤溶酶都是丝氨酸蛋白酶，它们有足够的序列同源性，在它们的活性中心都有丝足够的序列同源性，在它们的活性中心都有丝氨酸，说明它们可能是由祖先丝氨酸蛋白酶进氨酸，说明它们可能是由祖先丝氨酸蛋白酶进化而来。化而来
38、。生物化学蛋白质的共价结构医学知识67五、肽和蛋白质的人工合成肽的人工合成肽的人工合成 最广泛应用的氨基保护基是苄氧甲酰基，它最广泛应用的氨基保护基是苄氧甲酰基，它可以用催化加氢或用金属钠在液氨中处理去除。可以用催化加氢或用金属钠在液氨中处理去除。其它可以用作氨基保护基的还有三苯甲基、叔丁其它可以用作氨基保护基的还有三苯甲基、叔丁氧甲酰基、对甲苯磺酰基等，这些基团可以用氧甲酰基、对甲苯磺酰基等，这些基团可以用HBr/CH3COOH在室温下除去。在室温下除去。（氨基的保护）生物化学蛋白质的共价结构医学知识69肽的人工合成（羧基的保护）羧基一般用盐或酯的形式保护。盐是对羧基羧基一般用盐或酯的形式保
39、护。盐是对羧基临时性的保护。酯有甲酯、乙酯、苄酯和叔丁酯临时性的保护。酯有甲酯、乙酯、苄酯和叔丁酯等。甲酯和乙酯可用皂化法除去，但易引起消旋。等。甲酯和乙酯可用皂化法除去，但易引起消旋。苄酯可用苄酯可用H2/Pd法或金属钠液氨法除去。叔丁法或金属钠液氨法除去。叔丁酯可在温和条件下用酸除去。酯可在温和条件下用酸除去。生物化学蛋白质的共价结构医学知识70肽的人工合成（侧链上活泼基团的保护）侧链上需要保护的活泼侧链上需要保护的活泼基团有：基团有：Asp和和Glu的的和和羧基，羧基，Ser、Thr和和Tyr的羟基，的羟基，Cys的巯的巯基，基，Lys的的氨基，氨基，Arg的胍基等。这些保护基团的胍基等
40、。这些保护基团有苄基、对甲苯磺有苄基、对甲苯磺酰基、甲基等。酰基、甲基等。生物化学蛋白质的共价结构医学知识71各种保护基团生物化学蛋白质的共价结构医学知识72现在最常用的氨基保护基团Fmoc(9-fluorenyl-methoxycarbonyl)-9-芴甲氧羰基芴甲氧羰基生物化学蛋白质的共价结构医学知识73羧基的叠氮法活化生物化学蛋白质的共价结构医学知识74羧基的活化酯法活化生物化学蛋白质的共价结构医学知识75羧基的混合酸酐法活化氯甲酸乙酯氯甲酸乙酯叔胺叔胺生物化学蛋白质的共价结构医学知识76碳二亚胺缩合剂生物化学蛋白质的共价结构医学知识77缩合剂催化的肽键形成生物化学蛋白质的共价结构医学知识78固相肽合成 将待合成肽链将待合成肽链C端的第一个氨基酸端的第一个氨基酸的羧基连接到氯甲基聚苯乙烯树脂上，的羧基连接到氯甲基聚苯乙烯树脂上，然后向然后向N端方向依次将后续的氨基酸缩端方向依次将后续的氨基酸缩合上去。此法便于自动化操作。合上去。此法便于自动化操作。生物化学蛋白质的共价结构医学知识79固相肽合成图生物化学蛋白质的共价结构医学知识80固相肽合成图生物化学蛋白质的共价结构医学知识81分步合成的效率对最终产量的影响 生物化学蛋白质的共价结构医学知识82
