1、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR在临在临床医学中的应用床医学中的应用罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断 病原体测定 肿瘤诊断 基因差异表达研究 主要内容2实时荧光定量PCR在临床医学中的应用3实时荧光定量PCR在临床医学中的应用PCRPCR与基因诊断技术与基因诊断技术4 基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病做出诊断的方法。Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。实时荧光定量PCR在临床医学
2、中的应用荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术 实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧光染料：SYBR Green I、EVA Green，ResoLight 荧光探针：TaqMan、Hybridization Probes、Molecular Beacon实时荧光定量PCR在临床医学中的应用6罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程罗氏应用科学部整合细胞组学和基因组学的研究流程实时荧光定量PCR在临床医学
3、中的应用LightCyclerLightCycler Real-Time PCR Platform Real-Time PCR Platform 超过十年的实时荧光超过十年的实时荧光 PCR 的技术革新的技术革新 LightCycler 1.0Instrument32 320 Sample number Detection channels Sample volume l LightCycler 2.0Instrument32 620/100 LightCycler 1536Instrument1536 2 0.5 2 l1998199820032003 200920092005/200820
4、05/2008 LightCycler 480 Instruments(I,II)96/384 5/610-100/5-20 7实时荧光定量PCR在临床医学中的应用LightCycler 480 LightCycler 480 广泛的应用广泛的应用 绝对定量绝对定量相对定量相对定量基于熔解曲线的基因分型基于熔解曲线的基因分型终点法基因分型终点法基因分型ATATAAAATTTT基于基于HRMHRM的突变扫描的突变扫描8实时荧光定量PCR在临床医学中的应用罗氏应用科学部在临床诊断的整体解决方案基因诊断 病原体测定病原体测定 定性分析定性分析 绝对定量绝对定量 耐药性研究耐药性研究 肿瘤诊断 基因差
5、异表达研究 主要内容9实时荧光定量PCR在临床医学中的应用荧光定量荧光定量PCRPCR技术的临床应用技术的临床应用10 病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测 性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV）的基因检测 优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒II型（HSV）、风疹病毒 其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等实时荧光定量PCR在临床医学中的应用HBV DNAHBV DNA检测缩短检测缩短“窗口期窗口期”11PCR检测“窗口期”核酸检测缩短的“窗口期”的天数HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利
6、于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断实时荧光定量PCR在临床医学中的应用荧光定量荧光定量PCRPCR方法检测方法检测HBVHBV感染的各期感染的各期12血清标本Copies/mlHBeAg阳性慢性乙型肝炎病人经干扰素治疗后HBeAg转阴非活动性HBsAg携带者血清原先血中HBV DNA阳性，已痊愈超过12个月的血清实时荧光定量PCR在临床医学中的应用乙肝的治疗乙肝的治疗13n 治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类：干扰素：重组人-1b干扰素、-2a、-2b干扰素等 核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。实时荧光定量PCR在临床医学中的应用HBsAgHBsAg和和HBeAgHBeAg均阳性
7、而均阳性而HBV DNAHBV DNA阴性？阴性？14 干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。PCR所用引物相应的DNA序列发生突变，此引物与突变DNA不能配对结合。病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离HBV DNA很少或缺乏。实时荧光定量PCR在临床医学中的应用抗病毒治疗中存在的问题抗病毒治疗中存在的问题 逆转录酶催化中心逆转录酶催化中心YMDDYMDD变变异异15 YMDD：酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸 蛋氨酸（M）突变为异亮氨（I）或纈氨酸（V）形成YIDD变异株或YVDD变异株实时荧光定量PCR在临床医学中的应用HBV-YMDDHBV-YMDD变异检测的临床意义变异检
8、测的临床意义16 动态检测：服用拉米夫定3个月开始，每月检测1次 提前发现：可在耐药临床表现发生前1-4个月检测出突变株 及时调整：适时调整用药方案，防止因耐药而导致病情恶化实时荧光定量PCR在临床医学中的应用HRMHRM的应用介绍的应用介绍用用12 12 个个MIRUVNTR MIRUVNTR 位点对位点对结核杆菌菌株结核杆菌菌株进行基因分型进行基因分型Yu Pang et al Journal of Microbiological Methods 2011in press不同不同MIRU40 MIRU40 位点重复标准品的位点重复标准品的HRM HRM 分析结果分析结果.R=repeat.
9、R=repeat8888个菌株不同个菌株不同MIRU40 MIRU40 数量的数量的Tm Tm 值的统计值的统计流行病学研究流行病学研究17实时荧光定量PCR在临床医学中的应用小结小结18 荧光定量PCR可以对致病微生物核酸含量进行定量检测 弥补免疫检测的缺陷（如HCV）缩短诊断的窗口期（如HIV），利于早期诊断 对治疗过程进行疗效监测 指导用药过程及剂量，以制定合理的疗效方案 结合临床表现，并与传统的免疫学、影像学等诊断方法来综合评判，更为科学。实时荧光定量PCR在临床医学中的应用罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断 病原体测定 肿瘤肿瘤诊断诊断 突变检测突变检测个性化用药个性化用
10、药 甲基化 基因差异表达主要内容19实时荧光定量PCR在临床医学中的应用高分辨率熔解曲线高分辨率熔解曲线定义定义高分辨率熔解曲线高分辨率熔解曲线(HRM)(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR仪器与专门的分析算法 分辨率高，可以区分一个碱基突变的多组核酸样本，可以区分野生型（纯合子）、突变型（纯合子），杂合子 使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)与其它方法相比，具有高特异性、高灵敏度与方便快捷的优点；而且通量更高，单次成本更低！20实时荧光定量PCR在临床医学中的应用H
11、RMHRM的应用的应用 SNP SNP 位点的检测位点的检测 (已知与未知位点已知与未知位点)单倍型分析，杂合性丧失的筛查单倍型分析，杂合性丧失的筛查,种群中优势等位基因分析，物种群中优势等位基因分析，物种鉴定种鉴定,DNA,DNA遗传作图，潜在易感基因的筛选遗传作图，潜在易感基因的筛选 医学应用：产前诊断，传染病与遗传疾病的监控，药物疗效的观察医学应用：产前诊断，传染病与遗传疾病的监控，药物疗效的观察 突变，包括小片段的插入和缺失突变，包括小片段的插入和缺失 医学应用：肿瘤的快速诊断医学应用：肿瘤的快速诊断,治疗与预后评价治疗与预后评价 甲基化应用甲基化应用 医学应用：肿瘤的快速诊断医学应用
12、：肿瘤的快速诊断,治疗与预后评价治疗与预后评价21实时荧光定量PCR在临床医学中的应用饱和荧光染料饱和荧光染料创新的饱和荧光染料创新的饱和荧光染料能够识别单碱基突变能够识别单碱基突变,并且不抑制并且不抑制PCRPCR反应反应不饱和双链不饱和双链DNADNA荧光染料荧光染料SYBR Green ISYBR Green I纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同饱和双链饱和双链DNADNA荧光染料荧光染料ResoLightResoLight、LCGreenLCGreen、EvaGreenEvaGreen都为绿色荧光染料，最佳激发波长范围都为绿色荧光染料，最佳激发波长范围44
13、0-440-470nm470nm，发射荧光波长，发射荧光波长470-520nm470-520nm。序列的变化会导致熔解曲线的显著变化序列的变化会导致熔解曲线的显著变化纯合子纯合子杂合子杂合子VSVSvsvs22实时荧光定量PCR在临床医学中的应用创新的创新的HRM染料准确区分野生型纯合子和杂合子染料准确区分野生型纯合子和杂合子LC480 HRM Master Mix ResoLight Dye SYBR Green I vsLightCycler 480 ResoLight Dye后者提供更高的信号灵敏度和分后者提供更高的信号灵敏度和分辨率辨率23实时荧光定量PCR在临床医学中的应用24HRM
14、HRM技术和技术和dHPLCdHPLC的分辨率比较的分辨率比较dHPLCdHPLCHRMHRMwtmuthetwtwtwtwtwtmutmutmutmutmutwthetno separation ofno separation of homozygous homozygous variantvariant FAB Ex15J,318 bp amplicon,SNP A/G实时荧光定量PCR在临床医学中的应用PCRPCR产物的高分辨率熔解曲线产物的高分辨率熔解曲线基于基因扫描的基因分型基于基因扫描的基因分型DNA withheterocygoteSNPPCR+.TCTTTTTCCCCCGAAA
15、AAAGGGGGDenaturationreannealing+IntercalatingfluorescentdyeIncreasingtemperature25实时荧光定量PCR在临床医学中的应用26Melting CurvesTemperatureCGTA两种同源双链两种同源双链两种异源双链两种异源双链CATG观察到的观察到的4 4种种双链结构双链结构杂合子扩增杂合子扩增实时荧光定量PCR在临床医学中的应用基因基因扫描扫描高分辨率熔解分析高分辨率熔解分析 纯合子野生型(homoduplexes)纯合子突变 型(homoduplexes)杂合子案例:LPLH3基因的突变(SNP CT)72
16、样品，PCR产物大小164 bp27实时荧光定量PCR在临床医学中的应用LightCyclerLightCycler 480 HRM 480 HRM 应用介绍应用介绍基因扫描基因扫描 显著降低测序成本显著降低测序成本 甘露糖结合凝集素MBL2基因序列变异分析(384 个样本,扩增子长度219 bp):4种最常见的基因型在图像上被分为4组;少量样本呈现另外的3种遗传变异28实时荧光定量PCR在临床医学中的应用29实时荧光定量PCR在临床医学中的应用突变定量分析：CYP2C9目前约有16%的临床药物由其负责代谢(如华法林、甲苯磺丁脲和苯妥因)portion T portion T alleleal
17、lele50%,1:120%,1:514%,1:7 10%,1:10 4%,1:250%144 bp amplicon,SNP C/T30凝血因子VIII的突变检测第八因子的单碱基替换导致了 50%急性血友病A。由于该基因转录本长达9kb，且外显子较小（69262 bp)，利用dHPLC 或者测序检测昂贵耗时。用HRM可筛选出90%的突变。Detection of Factor VIII Gene Mutations by High-Resolution Melting Analysis.Laurie et al.Clin Chem.2007实时荧光定量PCR在临床医学中的应用HRMHRM法检
18、测法检测KRASKRAS基因的敏感性结果基因的敏感性结果31扩增片段92bp，突变型质粒所占的比例分别为0%、2%、5%、10%、20%、50%、100%的混合质粒DNA系列中，HRM分析方法可以明显的检测出只含2%的突变型DNA。50%20%100%10%5%WT2%14%实时荧光定量PCR在临床医学中的应用不同的不同的KRASKRAS突变类型在突变类型在HRMHRM判读图谱中显示出与野生型判读图谱中显示出与野生型不同的突变型的曲线不同的突变型的曲线32实时荧光定量PCR在临床医学中的应用34 在一般正常的细胞中，CpG成分处于非甲基化的状态 甲基化研究对于了解基因的调控模式以及疾病的分子生
19、物学机制具有重要 意义：发育、癌肿瘤发生、基因印迹、X 染色体失活及相关遗传性疾病 在特定条件下，譬如许多发育相关基因，在发育的特殊阶段去甲基化表达 肿瘤的DNA甲基化改变表现为总体的甲基化水平降低与启动子区CpG岛的甲基化水平升高。抑癌基因与修复基因的甲基化导致抑癌基因沉默与修复基因失活;而总体低甲基化使反转录转座子、癌基因活化和染色体不稳定基于甲基化特定标志物的量化情况，对不同的病人进行风险水平分级DNA DNA 甲基化现象和疾病研究甲基化现象和疾病研究实时荧光定量PCR在临床医学中的应用2.PCR 扩增，脲嘧啶经PCR扩增后变为胸腺嘧啶，使甲基化差别转换为碱基序列差别TCmCU1.重硫酸
20、盐处理已变性的DNA，未甲基化的胞嘧啶转变为脲嘧啶mCmCCU3.分析:测序，甲基化特异性PCR，引物延伸，限制性酶消化，杂交 or Real-time PCR!DNA DNA 甲基化研究的常规流程甲基化研究的常规流程35实时荧光定量PCR在临床医学中的应用结直肠癌FFPE样品启动子甲基化测定High Quality Assessment of DNA Methylation in Archival Tissues from Colorectal Cancer Patients Using Quantitative High-Resolution Melting Analysis.Balic,
21、M.et al.(2009),J.Mol.Diagn.11,102-108.在肿瘤发生过程中，超甲基化的启动是一个常见的抑制基因转录的机制，它也同时被视为肿瘤发生的特点之一。适当保存的组织是检测重要的生物标志物的重要来源。在早期癌症监测、风险分析和治疗中，DNA甲基化分析方法是一个理想的手段。使用使用HRMHRM分析方法，可以稳定地检分析方法，可以稳定地检测到测到1%1%的甲基化的甲基化DNADNA实时荧光定量PCR在临床医学中的应用37甲基转移酶MGMT与肿瘤预见性、个体化治疗Krypuy,M.et al.Rapid high-throughput methylation analysis
22、using the LightCycler 480 system.Biochemica 1 1,1113;2008 O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶MGMT，是细胞修复DNA损伤的一种酶，可以修复由各种烷化剂造成的细胞DNA烷基化损伤细胞中的MGMT水平决定了细胞对烷化剂的耐药程度MGMT的甲基化程度直接反映了其表达水平实时荧光定量PCR在临床医学中的应用罗氏应用科学部在临床医学的整体解决方案基因诊断 病原体测定 肿瘤诊断 基因基因差异差异表达表达研究研究 早期筛查早期筛查 分子指纹分子指纹主要内容38实时荧光定量PCR在临床医学中的应用qPCRqPCR图谱作为肿瘤指纹用于早期筛查图谱作为肿瘤
23、指纹用于早期筛查早期筛查早期筛查肿瘤的恶性生长会引起血液生化环境的特征性变化，这些变化将会影响血细胞某些基因的表达。根据不同肿瘤与免疫系统的关系，对外周血细胞的表达谱进行人类全基因的表达差异分析（生物芯片），筛选出肿瘤相关表达差异基因。乳腺癌早期诊断乳腺癌早期诊断（荧光定量PCR法）：通过对外周血细胞的表达谱进行人类全基因组的表达差异分析，筛选乳腺癌早期诊断的基因标记物，采用实时荧光定量PCR技术，检测临床血液样本中乳腺癌标志物的表达差异，检测结果可用于乳腺癌的早期筛查和辅助诊断。39实时荧光定量PCR在临床医学中的应用qPCRqPCR图谱作为图谱作为成神经细胞瘤成神经细胞瘤指纹指纹Predi
24、cting outcomes for children with neuroblastoma using a multigene-expression signature.Vermeulen,J.et al.(2009),Lancet Oncol.10,663-671.在最大的成神经细胞瘤库（n=579）中建立、验证了大量的预后多基因表达。实时定量PCR(qPCR)检测，只需20ng RNA，使用59种预后基因和5种内参基因。这个验证结果构成的“指纹信息”可以作为一种独立的风险预测机制，使得在当前的治疗组中能鉴别出病情可能加重的病人。40实时荧光定量PCR在临床医学中的应用41多因子疾病治疗预
25、后多因子疾病治疗预后A multiplex real-time PCR method for detection of GSTM1 and GSTT1 copy numbers.Timofeeva,M.et al.(2009),Clinical Biochemistry 42,500-509.对于致癌物质解毒和药物代谢，谷胱甘肽结合十分重要。人体中大量的GSTT1 和 GSTM1 发生缺失。GST基因缺失的多样性对于多因子疾病，例如不同类型的癌症，有潜在的风险和预见因素。在LightCycler 480 上使用多重PCR反应对GSTM1 和 GSTT1进行基因分型，内参基因为albumin。所
26、有的Ct值和标准化比例使用LightCycler 480 软件进行相对定量。这种新的半定量基因分型方法具有高灵敏度，是大型分子流行病和临床研究的理想工具。实时荧光定量PCR在临床医学中的应用42European Space Agency Mission European Space Agency Mission 欧洲航天计划欧洲航天计划 宇航员的基因表达在太空旅行前后是否有变化？宇航员的基因表达在太空旅行前后是否有变化？GPCRs通过cMAP介导的信号通路影响免疫学功能 样本来源：进入外太空前后的宇航员血样 UPL通用探针库让您更快地从实验设计到开始实验 Roche:1 day Roche:1
27、 day Others:2 weeks Others:2 weeks实时荧光定量PCR在临床医学中的应用43外太空环境对免疫系统相关的基因表达的影响外太空环境对免疫系统相关的基因表达的影响 Changes in expression Changes in expression patternpattern before and after trip before and after trip to the ISSto the ISS(RealTime ready GPCR panel)Data kindly distributed from Dr.Dr.S.Kreth,PD Dr.A.Chou
28、ker,and Prof.Dr.M.Thiel,LMU Munich/Germany;(ESA Project(ESA Project IMMUNO)IMMUNO)出发前,返回后1,7,30天分别进行相对定量检测5位宇航员的基因表达水平检测到显著差异10fold 10fold downregulatdownregulateded10fold 10fold upregulatedupregulatedUPLUPL通用探针库让您更快地从实验设计通用探针库让您更快地从实验设计到开始实验到开始实验 Roche:1 day Roche:1 day Others:2 weeks Others:2 week
29、s Mechanism of actionMechanism of action实时荧光定量PCR在临床医学中的应用44RealTime RealTime readyready Human GPCR Panel Human GPCR Panel宇航员在进入外太空前后血样中的基因表达变化宇航员在进入外太空前后血样中的基因表达变化Gene 1Gene 2Gene 3Gene 4Gene 5Gene 6Gene 7Gene 8Gene 9Gene 10Gene 11Gene 12Gene 13Gene 14Gene 15Gene 16P1R1R2R3P1R1R2R3P1R1R2R3P1R1R2R3相
30、对定量检测多个基因在血液中表达量的变化：进入外太空前(P1),返回地球1天后(R1)，返回7天后(R2)，返回30天后(R3)Data kindly distributed from Dr.Dr.S.Kreth,LMU Munich/Germany;unpublished results,publication in press实时荧光定量PCR在临床医学中的应用使用使用RealTime ready GPCR Panel对宇航员血样的基因表达对宇航员血样的基因表达变化分析变化分析(ESA Project IMMUNO)使用 GPCR Panel，对5位宇航员进入外太空前后血样中的基因表达水平进
31、行了分析 出发前(P1),返回后1(R1),7(R2),30天(R3)分别进行相对定量检测Astronaut 1Astronaut 2Astronaut 3Astronaut 4Astronaut 5Astronaut 1Astronaut 2Astronaut 3Astronaut 4Astronaut 5Astronaut 1Astronaut 2Astronaut 3Astronaut 4Astronaut 5黄线=无明显变化,蓝线=下调超过10倍,红线 Line=上调超过10倍Data kindly distributed from Dr.Dr.S.Kreth,PD Dr.A.Chou
32、ker,and Prof.Dr.M.Thiel,LMU Munich/Germany;Unpublished results,publication in preparation45实时荧光定量PCR在临床医学中的应用荧光定量荧光定量PCRPCR技术的优点技术的优点46 特异性强：直接扩增特异DNA或异常基因片段 灵敏度高：可检测到极少量的DNA，有效降低漏诊率 高效省时：扩增周期短，有利于快速诊断 取材范围广：血清、痰液、体液、毛发，组织等多种样本 全封闭反应：无需PCR后处理，降低污染 定量准确:利用标准曲线法，采用对数期分析 自动化程度高：操作安全，避免人为判断实时荧光定量PCR在临床医学中的应用47实时荧光定量PCR在临床医学中的应用
