1、病史、症状和体症病史、症状和体症系谱分析系谱分析生物化学检查生物化学检查基因诊断基因诊断遗传病的诊断遗传病的诊断(Diagnosis of Hereditary Disease)可以分为产前诊断、症状前诊断和可以分为产前诊断、症状前诊断和现症病人诊断三种类型。遗传病的诊断是现症病人诊断三种类型。遗传病的诊断是开展遗传咨询和防治工作的基础。开展遗传咨询和防治工作的基础。普遍性诊断原则普遍性诊断原则 是指与一般疾病相同的诊断是指与一般疾病相同的诊断方法，即通过对病史、症状、体症、实验室检查和方法，即通过对病史、症状、体症、实验室检查和其他诊断技术所获得的资料进行归纳分析，同时排其他诊断技术所获得的
2、资料进行归纳分析，同时排除拟诊疾病，然后确立诊断。除拟诊疾病，然后确立诊断。遗传学的特殊诊断遗传学的特殊诊断 主要是指染色体检查、性主要是指染色体检查、性染色质检查、特异性酶和蛋白质以及代谢中间产物染色质检查、特异性酶和蛋白质以及代谢中间产物的生化分析、的生化分析、DNARNA以及家系分析、皮肤纹理以及家系分析、皮肤纹理分析、携带者的检出等等。分析、携带者的检出等等。由于遗传病多有家族聚集现象，所以病由于遗传病多有家族聚集现象，所以病史的采集的准确性非常重要。除关注一般病史的采集的准确性非常重要。除关注一般病史外，主要着重于患者的家族史、婚姻史和史外，主要着重于患者的家族史、婚姻史和生育史。生
3、育史。2.家族史家族史采集家族史时应该特别注意因患者或代述采集家族史时应该特别注意因患者或代述人由于文化程度、记忆能力、思维能力、判断人由于文化程度、记忆能力、思维能力、判断能力以及精神状态而使症状、体症的描述不够能力以及精神状态而使症状、体症的描述不够准确、全面，或者因为患者、代述人提供假材准确、全面，或者因为患者、代述人提供假材料等都会影响家族史的准确性。料等都会影响家族史的准确性。着重了解结婚年龄、次数、配偶健康状况着重了解结婚年龄、次数、配偶健康状况以及是否近亲结婚等。以及是否近亲结婚等。着重了解生育年龄、子女数目、健康状况、着重了解生育年龄、子女数目、健康状况、有无流产、死产、早产史
4、等。如有新生儿死亡有无流产、死产、早产史等。如有新生儿死亡或患儿，则除询问父母及家庭成员上述情况外，或患儿，则除询问父母及家庭成员上述情况外，还应该了解患儿有无产伤、窒息，妊娠早期母还应该了解患儿有无产伤、窒息，妊娠早期母体有无患病毒性疾病和接触过致畸因素，如服体有无患病毒性疾病和接触过致畸因素，如服用过致畸药物或接触过电离辐射或有害化学物用过致畸药物或接触过电离辐射或有害化学物质等。质等。遗传病除和其他疾病有相同的体症之外，往遗传病除和其他疾病有相同的体症之外，往往有其本身的往有其本身的特异性症候群特异性症候群，为诊断提供初步的，为诊断提供初步的线索。线索。苯丙酮尿症：苯丙酮尿症：智力发育不
5、全，特殊腐臭尿液智力发育不全，特殊腐臭尿液半乳糖血症：半乳糖血症：智力发育不全伴有白内障，肝智力发育不全伴有白内障，肝硬化。硬化。1.由于大多数遗传病在婴儿和儿童时期即可有体由于大多数遗传病在婴儿和儿童时期即可有体症和症状出现，故除观察外貌特征外，还应该症和症状出现，故除观察外貌特征外，还应该注意身体发育情况：诸如体重增长速度，智力注意身体发育情况：诸如体重增长速度，智力增进、性器官以及第二性症发育、肌肉的张力、增进、性器官以及第二性症发育、肌肉的张力、婴儿啼哭的声音等情况。婴儿啼哭的声音等情况。2.由于有遗传异质性，若欲作出病因诊断，单凭由于有遗传异质性，若欲作出病因诊断，单凭体症、症状资料
6、是非常困难的，一定要进行必体症、症状资料是非常困难的，一定要进行必要的实验室检查。要的实验室检查。系谱系谱(Pedigree)：将患者家族的所有将患者家族的所有成员及其发病情况按照一定格式排绘制成成员及其发病情况按照一定格式排绘制成的图解，就成为系谱。的图解，就成为系谱。系谱分析系谱分析(Pedigree Analysis)：对某对某种性状或者疾病的多个系谱种性状或者疾病的多个系谱 进行综合研究，进行综合研究，从而得出这种性状或者疾病的遗传方式，从而得出这种性状或者疾病的遗传方式，称之为系谱分析。称之为系谱分析。一例并指症的系谱一例并指症的系谱一例多指（趾）的系谱一例多指（趾）的系谱12 23
7、41567123456一例一例-地中海贫血的系谱地中海贫血的系谱12213456789812345679101112设：贫血基因 0 正常基因 A A 0A 0A 0A A重型贫血重型贫血轻型贫血0 0A 0 12113764510912412813163421535610 11 12 13 14 15一例白化病的系谱一例白化病的系谱一例甲型血友病的系谱21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 912一例抗维生素D性佝偻病的系谱1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 91设：致病基因XA 正常基因XaXA XaXaYX
8、AYXAXaXAY1.系谱的系统性、完整性、可靠性。去伪存真。系谱的系统性、完整性、可靠性。去伪存真。2.分析显性遗传病时应注意延迟显性、不规则显分析显性遗传病时应注意延迟显性、不规则显性、外显不全等。性、外显不全等。3.分析性连锁遗传病时应注意与从性和限性遗传分析性连锁遗传病时应注意与从性和限性遗传相区别。相区别。4.要注意显隐性的相对性。因为同一种遗传病采要注意显隐性的相对性。因为同一种遗传病采用不同观察指标会得出不同的结论。用不同观察指标会得出不同的结论。5.注意新的基因突变。注意新的基因突变。HbA HbA HbA HbS HbS HbS 正常人正常人 携带着携带着 患者患者（致死）（
9、致死）无无 有有（50%）有有（全部）（全部）无无 有有（生存力强）（生存力强）-基因型基因型 疾疾 病病（隐性）（隐性）镰形细胞镰形细胞（显性）（显性）抗抗 疟疟 疾疾（显性）（显性）基因突变引起的单基因病往往表现在酶和蛋白质的质与量的改变或者缺如。因此酶和蛋白质的定量分析是诊断单基因病和先天性代谢性的主要方法。酶的缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而导致代酶的缺陷导致一系列生化代谢紊乱，从而导致代谢底物、中间产物、终产物、旁路代谢产物发生改变。谢底物、中间产物、终产物、旁路代谢产物发生改变。因此，检测某些代谢常物的质和量的改变，可以间接因此，检测某些代谢常物的质和量的改变，可以间接反映出酶的变
10、化而作出诊断。反映出酶的变化而作出诊断。苯丙酮尿症苯丙酮尿症：血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。血清中的苯丙氨酸；尿中苯乙酸。粘多糖病粘多糖病：尿中的硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素。尿中的硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素。DMD：血清中的磷酸肌酸酶活性。血清中的磷酸肌酸酶活性。基因突变导致的单基因病主要是特定基因突变导致的单基因病主要是特定的蛋白质、酶的质和量改变的结果。因此的蛋白质、酶的质和量改变的结果。因此对酶的活性和蛋白质含量的测定是确定某对酶的活性和蛋白质含量的测定是确定某些单基因病的主要方法。些单基因病的主要方法。检测材料的主要来源有：检测材料的主要来源有：特定的组织和细特定的组织和细胞，如肝细胞、皮
11、肤成纤维细胞，肾，肠粘膜胞，如肝细胞、皮肤成纤维细胞，肾，肠粘膜细胞等。细胞等。注意的问题：一种酶的缺乏不一定在所有注意的问题：一种酶的缺乏不一定在所有组织中都能够检测出来。例如苯丙氨酸羟化酶组织中都能够检测出来。例如苯丙氨酸羟化酶必须用肝组织活检，而血细胞中无法得到。必须用肝组织活检，而血细胞中无法得到。上海：上海：19811987年对年对284,396名新生儿进行名新生儿进行PKU筛查，查出筛查，查出PKU患儿患儿15名，高苯名，高苯丙氨酸血症丙氨酸血症4名。名。生物化学检查生物化学检查 苯丙酮尿症苯丙酮尿症,PKU酶活性检查酶活性检查 PAH 肝细胞肝细胞血液滤片法血液滤片法 Guthr
12、ie test 血液血液FeCl3显色反应显色反应 苯丙酮酸苯丙酮酸 尿液尿液基因分析，即基因诊断基因分析，即基因诊断(Gene Diagnosis)：是是利用利用DNA 分析技术直接从基因水平分析技术直接从基因水平(DNA or RNA)检测遗传病的基因缺陷。检测遗传病的基因缺陷。这种方法和传统的诊断方法主要差别在于直接这种方法和传统的诊断方法主要差别在于直接从基因型推断表型，可以越过基因产物，直接检测从基因型推断表型，可以越过基因产物，直接检测基因的结构而作出诊断，改变了传统的表型诊断方基因的结构而作出诊断，改变了传统的表型诊断方式，所以又称为式，所以又称为逆向诊断逆向诊断(Reverse
13、 Diagnosis)。基因诊断的优点基因诊断的优点1.材料容易获得，不受细胞类型的限制；材料容易获得，不受细胞类型的限制；2.不受基因表达的时空限制。不受基因表达的时空限制。3.不受年龄的限制；不受年龄的限制；4.可以于发病前做出诊断；可以于发病前做出诊断；5.方便有效，迅速准确，携带者也可以有效检方便有效，迅速准确，携带者也可以有效检出。出。基因诊断的难点：基因诊断的难点：对大多数疾病尚未找到合适对大多数疾病尚未找到合适的基因诊断方法，另外由于遗传异质性、基因突的基因诊断方法，另外由于遗传异质性、基因突变的多样性，一种基因诊断方法对同一疾病往往变的多样性，一种基因诊断方法对同一疾病往往有很
14、大差异。有很大差异。基因诊断的对象：基因诊断的对象：一般是指单基因病和某些有一般是指单基因病和某些有主基因改变的多基因病。主基因改变的多基因病。至至19971997年，发现人类单年，发现人类单基因病遗传病已达基因病遗传病已达85878587种，现已达到种，现已达到1598815988种种(1)(1)致病基因的染色体定位已明确致病基因的染色体定位已明确(2)(2)致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚(3)(3)致病基因与致病基因与DNADNA多态存在连锁关系多态存在连锁关系根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术 目前常用的
15、基因诊断方法目前常用的基因诊断方法:(1)(1)聚合酶链反应聚合酶链反应DNADNA扩增法扩增法 (2)(2)限制性酶谱限制性酶谱SouthernSouthern印迹杂交直接分析法印迹杂交直接分析法 (3)(3)限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(RFLP)(RFLP)连锁分析法连锁分析法 (4)(4)寡核苷酸探针寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)(oligonucleotide probe)检测法检测法 (5)DNA(5)DNA测序测序 (6)(6)基因芯片基因芯片（一）（一）聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)
16、聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）是在体外特异）是在体外特异和迅速地扩增特定靶和迅速地扩增特定靶DNA序列的方法序列的方法PCRPCR的原理：的原理：1.1.为可选择性扩增为可选择性扩增,要有特异引物要有特异引物2.2.要有前身物、聚要有前身物、聚合酶和离子合酶和离子3.3.是链式反应，每是链式反应，每一周期经过变性、一周期经过变性、复性和延伸三步复性和延伸三步4.4.一周期后一周期后DNADNA倍增倍增 PCRPCR的过程：的过程：变性（92-95；1分钟）复性（40-60；1分钟）延伸（72；1.5分钟）5 3 3 5 变性变性 5 3 3 5 特异引物特异引物 复性复性 5 3 5 3
17、 3 5 3 5 DNA聚合酶聚合酶 延伸延伸 3 5 5 3 PCR 以以 地贫基因诊断为例地贫基因诊断为例 由于中国人由于中国人地贫地贫80%以上为东以上为东南亚型缺失型南亚型缺失型（-SEA/）,该突变的该突变的缺失范围约缺失范围约20kb基因片段。因此，基因片段。因此，采用跨越断裂点采用跨越断裂点PCR法（法（gap-PCR）,一次即可诊断出各种基因型。一次即可诊断出各种基因型。PCR的应用的应用1 21 21 2 3 4 5a b1：正常人；：正常人；2,4,5：纯合体患者；：纯合体患者；3：杂合体：杂合体(2的弟弟的弟弟)左为泳动变位模式：左为泳动变位模式：a 正常人；正常人；b
18、纯合体患者纯合体患者GAAGAGTGTTATCTCCAC PCR-DHPLCDHPLC（变性高效液相色谱）（变性高效液相色谱）进行基因突变检测的原理进行基因突变检测的原理 DHPLC进行基因突变检测是基于异源双进行基因突变检测是基于异源双链的形成和不同的双链与吸附拄的结合牢固程链的形成和不同的双链与吸附拄的结合牢固程度不同。度不同。一个杂合子个体，一个杂合子个体，PCR产物一定含有野生型和突产物一定含有野生型和突变型两种变型两种DNA，并且两者的比例为，并且两者的比例为1:1，将，将PCR产物进产物进行变性复性过程，杂交会形成同源双链和异源双链，行变性复性过程，杂交会形成同源双链和异源双链，同
19、样，当把野生型和突变型同样，当把野生型和突变型PCR产物混合后，进行变产物混合后，进行变性复性过程，杂交后会出现四种情况。性复性过程，杂交后会出现四种情况。异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性的温度条件下，就会在不匹配的碱基对处部分的温度条件下，就会在不匹配的碱基对处部分解链，由于单链解链，由于单链DNA带负电荷减少，结合力弱，带负电荷减少，结合力弱，因此，异源双链比同源双链先洗脱出来，根据因此，异源双链比同源双链先洗脱出来，根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离，出现不同的检测峰。离，出现不同的检测峰。DHP
20、LCDHPLC的特点：的特点：1）快速分离DNA分子，一般进行基因突变检测，一个样品约需8.8分钟 2）自动化操作系统 3）准确测定DNA片段大小 4）基因突变检出率高，达95-100%5）经济、操作简便、PCR产物无须进行纯化处理即可用于突变检测（二）分子杂交（二）分子杂交 Southern印迹杂印迹杂交交 (Southern blot hybridization)原理原理:DNADNA碱基的替换和数目的改变可碱基的替换和数目的改变可导致限制性酶切片段长度改变导致限制性酶切片段长度改变 1.1.点突变至酶切位点消失或出现新切点突变至酶切位点消失或出现新切点点 2.2.较大片段碱基缺失较大片段
21、碱基缺失 3.3.串联重复数目较大的改变串联重复数目较大的改变 4.4.较大片段碱基重复较大片段碱基重复限制酶的识别序列与切割：限制酶的识别序列与切割：绝大多数绝大多数型限制酶的识别序列都是型限制酶的识别序列都是 回文结构回文结构,即即以双对称轴按以双对称轴按5 3方向阅读时方向阅读时,其碱基顺序在双链其碱基顺序在双链上相同上相同 BamH识别GGATCC 5-GGATCCATGGAACCGTAGCGGATCCTAGT-3 3-CCTAGGTACCT TGGCATCGCCTAGGATCA-5 Bgl识别AGATCT 5-AGATCTTACATTGGCATCGAGATCTTAGT-3 3-TCT
22、AGAATGTAACCGTAGCTCTAGAATCA-5 探针的种类和标记 DNA 探针标记(probe labeling)同位素标记:32P,35S,3H 非同位素标记:生物素，地高辛标记方法标记方法:缺口平移 双链探针标记 随机引物 PCR 寡核苷酸标记:5末端标上标记物1 1限制性酶谱直接分析法：限制性酶谱直接分析法：应用专一性基因探针和限制性内切酶，经应用专一性基因探针和限制性内切酶，经 Southern印迹杂交直接检测致病基因存印迹杂交直接检测致病基因存在在 原理：原理：限制性内切酶能识别限制性内切酶能识别 DNA中特定核苷酸顺序，中特定核苷酸顺序，在正常情况下某种限制性内切酶所切出
23、的片段长在正常情况下某种限制性内切酶所切出的片段长度是固定的，当基因发生突变后度是固定的，当基因发生突变后,核苷酸顺序发核苷酸顺序发生改变生改变,导致限制性内切酶的酶切位点改变，从导致限制性内切酶的酶切位点改变，从而使片段长度发生改变。而使片段长度发生改变。/-/-/-4.7 kb3.0 kb?ASOASO点杂交点杂交(ASO dot hybridization)(ASO dot hybridization)(ASO:allele-specific(ASO:allele-specific oligonucleotide)oligonucleotide)能鉴定一对等位基因中单一核苷酸的差别能鉴定
24、一对等位基因中单一核苷酸的差别原理：原理：1.1.点突变时突变点的碱基被替换点突变时突变点的碱基被替换 2.2.设计分别与正常和点突变序列互补的探针设计分别与正常和点突变序列互补的探针 3.3.单一碱基的不配对足以导致异源杂交链的结合单一碱基的不配对足以导致异源杂交链的结合不稳定不稳定 4.4.严格的洗脱条件下严格的洗脱条件下,只有完全互补的异源杂交只有完全互补的异源杂交链能保留而显示杂交信号链能保留而显示杂交信号 A A ASO(N probe)5CTCCTGAGGAGA 3S ASO(M probe)5CTCCTGTGGAGAA 3221331 AA正常正常A S 杂合子杂合子ASO斑点杂交鉴定镰型细胞贫血突变斑点杂交鉴定镰型细胞贫血突变A S杂合子杂合子S S纯合子纯合子DNA测序用四种不同颜色荧光素分别标记A，T，G，C核苷酸碱基，经过测序反应，标记的碱基代替原有碱基，通过标记碱基发出的荧光颜色确定待测DNA样本的序列。基因基因(DNA)芯片技术芯片技术将大量标记的探针分子（通常每平方将大量标记的探针分子（通常每平方厘米点阵密度高于厘米点阵密度高于 400）固定于支持）固定于支持物上后与样品分子进行杂交，通过检物上后与样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子杂交信号的强度，获测每个探针分子杂交信号的强度，获取样品分子的数量和序列信息取样品分子的数量和序列信息
