1、基因操作基因操作第七章第七章Gene ManipulatingGene Manipulating基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-121The Significance of Gene Manipulating in Medical Develapments基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-122基因操作技术在医学方面的价值主要包括：基因操作技术在医学方面的价值主要包括：（1）疾病相关基因和疾病分子机制的分析家；疾病相关基因和疾病分子机制的分析家；（5）高效率、低成本地生产用于疾病防治的生物）高效率、低成本地生产用于疾病防治的生物 活性蛋白质、细胞、器官。活性蛋白质、细胞、
2、器官。（2）建立新的疾病诊断方法建立新的疾病诊断方法-基因诊断；基因诊断；（4）纠正人类基因缺陷的方法）纠正人类基因缺陷的方法-基因治疗；基因治疗；（3）发展出新的法医学鉴定方法）发展出新的法医学鉴定方法-法医学鉴定；法医学鉴定；基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-123一、疾病相关基因分析一、疾病相关基因分析 要确认某一疾病的相关基因，就是利用不同的要确认某一疾病的相关基因，就是利用不同的方法将各种基因确定到染色体的实际位置上，并分方法将各种基因确定到染色体的实际位置上，并分析基因的结构和疾病状态下基因的突变。析基因的结构和疾病状态下基因的突变。1911年年Wilson将将红绿色盲基
3、因红绿色盲基因首次定位到首次定位到X染染色体色体上，开创了人类基因定位的先河。上，开创了人类基因定位的先河。1968年年Donahue利用系谱分析将利用系谱分析将Duffy血型基因血型基因定位于定位于1号染色体号染色体上，这是人类首次将基因定位于常上，这是人类首次将基因定位于常染色体上。染色体上。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-124 20世纪世纪80年代以前，可进行结构分析的疾病相年代以前，可进行结构分析的疾病相关基因仅限于个别关基因仅限于个别功能异常非常明确，基因表达产功能异常非常明确，基因表达产物纯化较易物纯化较易的遗传性疾病，尤其是血液系统疾病如的遗传性疾病，尤其是血液系统
4、疾病如镰刀状贫血、地中海贫血等。镰刀状贫血、地中海贫血等。20世纪世纪80年代中期以后，随着分子生物学技术年代中期以后，随着分子生物学技术的发展，尤其是的发展，尤其是重组重组DNA技术技术水平的提高和水平的提高和PCR技技术术的广泛应用，使的广泛应用，使疾病相关基因的鉴定与克隆疾病相关基因的鉴定与克隆工作工作得以迅速发展。得以迅速发展。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-125（一）功能性克隆（一）功能性克隆(functional cloning)从对一种致病基因的功能理解出发，克隆该致病从对一种致病基因的功能理解出发，克隆该致病基因。实际上是利用纯化蛋白克隆致病基因。基因。实际上是利
5、用纯化蛋白克隆致病基因。获得纯化蛋白后的基因克隆方式有两种：获得纯化蛋白后的基因克隆方式有两种：获取部分氨基酸序列，推导出获取部分氨基酸序列，推导出mRNA序列，合成序列，合成 寡核苷酸探针，筛选寡核苷酸探针，筛选 cDNA 文库；从基因组文库文库；从基因组文库 获取其基因组序列。获取其基因组序列。制备特异性抗体，筛选表达型制备特异性抗体，筛选表达型cDNA文库。文库。只要能获得部分氨基酸序列就可以进行基因克隆。只要能获得部分氨基酸序列就可以进行基因克隆。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-126根据根据mRNAmRNA表达差异来克隆疾病相关基因：表达差异来克隆疾病相关基因：（1 1）
6、削减杂交）削减杂交(subtractive hybridization)(subtractive hybridization)（2 2）差异显示（）差异显示（differential displaydifferential display）PCRPCR（3 3）基于）基于PCRPCR的削减杂交法的削减杂交法 将正常与异常的同一组织的将正常与异常的同一组织的mRNA或或cDNA文文库进行杂交，筛选出表达有差异的克隆；库进行杂交，筛选出表达有差异的克隆；能很灵敏地扩增两个能很灵敏地扩增两个mRNA样品中有差异的片样品中有差异的片段，克隆后进行分析；段，克隆后进行分析；将前两种方法结合起来，克服了削
7、减杂交灵敏将前两种方法结合起来，克服了削减杂交灵敏度低，差异显示度低，差异显示PCR假阳性高的缺点。假阳性高的缺点。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-127缺点：缺点：大多数症状的生理、生化变化很复杂，对与之大多数症状的生理、生化变化很复杂，对与之有关的蛋白质了解甚少，对其基因表达主要组织也有关的蛋白质了解甚少，对其基因表达主要组织也知之不多。知之不多。不同组织甚或至于同一组织的蛋白质与不同组织甚或至于同一组织的蛋白质与mRNA的的“正常正常”差异很难与特异性差异区别。差异很难与特异性差异区别。功能性克隆技术成熟、方法直接、费用较低，功能性克隆技术成熟、方法直接、费用较低，迄今仍是克
8、隆基因的首选策略。迄今仍是克隆基因的首选策略。优点：优点：基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-128（二）定位克隆（二）定位克隆（positional cloning）从一种致病基因的染色体定位出发，逐步缩小从一种致病基因的染色体定位出发，逐步缩小范围，最后克隆该基因范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆包含：系统的定位克隆包含：遗传学分析：遗传学分析：分子生物学分析：分子生物学分析：包括交换分析和连锁不平衡分析以确定致病基包括交换分析和连锁不平衡分析以确定致病基因的染色体定位；因的染色体定位；包括染色体异常（缺失、易位等）分析和基因包括染色体异常（缺失、易位等）分析和基因文库的筛选与基
9、因克隆。文库的筛选与基因克隆。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-129杜氏肌营养不良杜氏肌营养不良(DMD)致病基因的克隆：致病基因的克隆：首先，遗传学的家族连锁分析确首先，遗传学的家族连锁分析确定了致病基因位于定了致病基因位于Xp21（性（性染色体染色体X短臂第短臂第2区第区第1条带条带）。）。将病人的将病人的Xp21 DNA与正常人的杂与正常人的杂交，从而减掉了相同的基因序列，最后交，从而减掉了相同的基因序列，最后剩余的序列即为病人缺失的基因。剩余的序列即为病人缺失的基因。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1210新的技术新的技术非定位候选基因克隆策略非定位候选基因克隆
10、策略(position-independent candidate gene approaches)：定位候选基因克隆策略定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches)：直接根据分子病理学变化和基因组作图中各种直接根据分子病理学变化和基因组作图中各种基因产物功能的了解预测出候选致病基因。基因产物功能的了解预测出候选致病基因。一旦致病基因的染色体定位得以确认，可以利一旦致病基因的染色体定位得以确认，可以利用因特网上的基因网站所提供的基因序列数据鉴定用因特网上的基因网站所提供的基因序列数据鉴定出候选致病基因。出候选致病基因。基因操作与医学(3_LM
11、J)2022-10-1211（三）基因结构和产物功能的分析（三）基因结构和产物功能的分析利用对于某基因结构和功能的理解，分析其与利用对于某基因结构和功能的理解，分析其与疾病的关系、是否有突变、突变产物的致病机制。疾病的关系、是否有突变、突变产物的致病机制。获得未知基因后可进一步进行下列工作：获得未知基因后可进一步进行下列工作：1 1克隆和分析全长克隆和分析全长cDNAcDNA序列：序列：根据根据cDNA序列推出序列推出该基因编码的蛋白质的氨基酸序列；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列；2 2克隆基因全序列：克隆基因全序列：分析存在的内含子，启动子分析存在的内含子，启动子以及其调节位点，探讨基因表达
12、调控方式；以及其调节位点，探讨基因表达调控方式；3 3确定基因在的位置和拷贝数：确定基因在的位置和拷贝数：染色体中定位多染色体中定位多用原位杂交法，拷贝数可用用原位杂交法，拷贝数可用Southern杂交法确定。杂交法确定。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12124 4基因表达谱分析：基因表达谱分析：该基因在不同组织、细胞的表该基因在不同组织、细胞的表达状态。达状态。Northern blotting和点阵杂交检测和点阵杂交检测mRNA的的水平。水平。Western blotting检测蛋白质的表达。检测蛋白质的表达。5 5基因表达产物的功能分析：基因表达产物的功能分析：（1）找已知
13、功能的同源蛋白或同源结构域。）找已知功能的同源蛋白或同源结构域。（2）在细胞内过量表达该基因，观察各种功能影响。）在细胞内过量表达该基因，观察各种功能影响。（3）在细胞内抑制该基因表达，分析细胞功能变化；）在细胞内抑制该基因表达，分析细胞功能变化；建立基因剔除小鼠，分析基因产物功能。建立基因剔除小鼠，分析基因产物功能。（4）分析与该基因产物相互作用分子，或者是相互）分析与该基因产物相互作用分子，或者是相互 作用的蛋白分子或核酸。作用的蛋白分子或核酸。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1213二、制造生物活性蛋白二、制造生物活性蛋白 基因工程技术的发展在医学上最重要的成就表基因工程技术
14、的发展在医学上最重要的成就表现在治疗用生物活性蛋白或疫苗的生产和使用。现在治疗用生物活性蛋白或疫苗的生产和使用。通过基因的克隆，可获得具有特定生物学活性通过基因的克隆，可获得具有特定生物学活性的蛋白质。这尤其适用于那些来源特别有限的蛋白的蛋白质。这尤其适用于那些来源特别有限的蛋白质，或自然界本不存在的蛋白质。质，或自然界本不存在的蛋白质。克隆基因的表达可在大肠杆菌、枯草杆菌、酵克隆基因的表达可在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳类细胞或整体动物体内。母、昆虫细胞、哺乳类细胞或整体动物体内。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1214生物安全性：生物安全性：活性的可控性：活性的可控
15、性：资源和生产成本：资源和生产成本：未发现诸有如此类猪胰岛素、牛脑垂体提取的未发现诸有如此类猪胰岛素、牛脑垂体提取的生长激素、人血生长激素、人血VIII因子的副作用。因子的副作用。基因工程产品的可重复性要好于生物提取物。基因工程产品的可重复性要好于生物提取物。无资源依赖性，生产成本也明显低于生物提取。无资源依赖性，生产成本也明显低于生物提取。基因工程产品比生物提取产品有明显的优势：基因工程产品比生物提取产品有明显的优势：基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1215产品名称产品名称适应症适应症乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原人胰岛素人胰岛素生长激素生长激素组织肝淳蛋白激活物（组织肝淳蛋白
16、激活物（TPA）-干扰素干扰素-干扰素干扰素-干扰素干扰素促红细胞生成素（促红细胞生成素（EPO）*粒细胞刺激因子（粒细胞刺激因子（GSF）粒细胞粒细胞-巨噬细巨噬细胞刺激因子（胞刺激因子（GMSF）*表皮生长因子（表皮生长因子（EGF）第第VIII因子因子第第IX因子因子白细胞介素白细胞介素2（IL-2）白细胞介素白细胞介素3（IL-3）白细胞介素白细胞介素4（IL-4）干细胞生长因子（干细胞生长因子（SCF）抗抗CD3抗体抗体CAMPATH-1HCAMPATH-1H（淋巴细胞抗体）（淋巴细胞抗体）抗内毒素抗体抗内毒素抗体抗肿瘤坏死因子抗体抗肿瘤坏死因子抗体注射疫苗用于预防乙型肝炎注射疫苗用
17、于预防乙型肝炎糖尿病糖尿病垂体功能低下垂体功能低下急性心肌梗塞急性心肌梗塞慢性髓系白血病，骨髓瘤慢性髓系白血病，骨髓瘤乙型肝炎，艾滋病人并发乙型肝炎，艾滋病人并发kaposis肉瘤肉瘤多发性硬化（试用）多发性硬化（试用）抗抗贫血贫血*肾性贫血肾性贫血化疗后白细胞和内体骨髓移植再生化疗后白细胞和内体骨髓移植再生*严重烧伤严重烧伤血友病血友病A，B血友病血友病A，B肿瘤免疫治疗肿瘤免疫治疗化疗后促进髓母细胞形成化疗后促进髓母细胞形成免疫缺陷病，肿瘤，免疫佐剂免疫缺陷病，肿瘤，免疫佐剂骨髓移植前扩增骨髓干细胞骨髓移植前扩增骨髓干细胞器官移植器官移植类风湿性关节炎，非何杰金氏淋巴瘤类风湿性关节炎，非何
18、杰金氏淋巴瘤革兰氏阳性菌感染革兰氏阳性菌感染严重炎症，类风湿性关节炎严重炎症，类风湿性关节炎表表7-1 7-1 临床正在使用或试用的部分基因工程产品临床正在使用或试用的部分基因工程产品基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1216质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化连接酶连接酶转化转化 体外包装，转染体外包装，转染筛选筛选基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1217 是在编码蛋白质基因的特定位置引入碱基替代、是在编码蛋白质基因的特定位置引入碱基替代、产生小的碱基缺失或插
19、入，使其编码的蛋白质的一产生小的碱基缺失或插入，使其编码的蛋白质的一级结构发生改变。级结构发生改变。在合成在合成PCRPCR引物时，除了在定点诱变的位置引引物时，除了在定点诱变的位置引入相应的突变（点突变、小片段插入或缺失）外，入相应的突变（点突变、小片段插入或缺失）外，其余序列与模板完全配对其余序列与模板完全配对 PCR扩增后，产物中就引入特定的突变；将扩增后，产物中就引入特定的突变；将PCR产物克隆表达，可获得定点突变的蛋白质。产物克隆表达，可获得定点突变的蛋白质。PCR诱变：诱变：1.1.蛋白质工程中的定点诱变技术蛋白质工程中的定点诱变技术基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12
20、18 包括包括表达载体表达载体的构建、的构建、受体细受体细胞胞的建立和的建立和表达产物的分离、纯化等技术表达产物的分离、纯化等技术和策略。和策略。涉及目的基因的克隆、复制、转涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程，录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程，需要在适合的需要在适合的表达系统表达系统中完成。中完成。表达系统可根据受体细胞的不同分为表达系统可根据受体细胞的不同分为和和。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1219大多是穿梭载体大多是穿梭载体基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1220大肠杆菌（大肠杆菌（E.coliE.coli）表达体
21、系最常用）表达体系最常用 优点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大优点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产。规模生产。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1221 在真核细胞中表达外源基因的体系主要有酵母、在真核细胞中表达外源基因的体系主要有酵母、昆虫细胞（杆状病毒）、哺乳动物和高等植物。昆虫细胞（杆状病毒）、哺乳动物和高等植物。常用的瞬时表达宿主是来源于非洲绿猴肾常用的瞬时表达宿主是来源于非洲绿猴肾CV-1CV-1细胞的细胞的COSCOS细胞。细胞。常用的稳定表达宿主细胞是来源于中国仓鼠卵常用的稳定表达宿主细胞是来源于中国仓鼠卵巢的巢的CHOCHO细胞。细胞。基因操作与医学(
22、3_LMJ)2022-10-1222（二）转基因技术简介（二）转基因技术简介转基因技术转基因技术(transgenic technique)利用利用DNA重组技术在动物体内引入可遗传给子代重组技术在动物体内引入可遗传给子代的外源基因的技术。的外源基因的技术。被导入的目的基因被导入的目的基因Microinjection into the Pronucleus of a Bovine Zygote：目的基因的受体动物目的基因的受体动物基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1223基本原理基本原理 采用基因转移技术将目的基因导入采用基因转移技术将目的基因导入受精卵的细胞受精卵的细胞核内核内或或
23、着床前的胚胎干细胞着床前的胚胎干细胞，然后将细胞，然后将细胞导入受体动导入受体动物子宫物子宫，使之发育成个体。，使之发育成个体。基因的导入方式：基因的导入方式：显微注射法显微注射法(最常用最常用)胚胎干细胞法胚胎干细胞法逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法 基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1224显微注射是最早发展，也是最为有效的外源显微注射是最早发展，也是最为有效的外源 基因导入方法。基因导入方法。将目的基因直接注射到受精卵内，目的基因即可与将目的基因直接注射到受精卵内，目的基因即可与 受精卵的染色体整合，最终可产生带有外源基因的受精卵的染色体整合，最终可产生带有外源基因的 转基因动
24、物。转基因动物。转基因动物发育后，在其体细胞和生殖细胞中都有转基因动物发育后，在其体细胞和生殖细胞中都有 外源基因的存在和表达，并可将该基因遗传给子代。外源基因的存在和表达，并可将该基因遗传给子代。可以在携带外源基因的载体内加上组织特异性启动可以在携带外源基因的载体内加上组织特异性启动 子，从而在转基因动物体内限定表达外源基因的组子，从而在转基因动物体内限定表达外源基因的组 织和器官。织和器官。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1225显微注射法建立转基因鼠技术路线显微注射法建立转基因鼠技术路线目的基因目的基因供体动物供体动物受精卵受精卵受体动物受体动物输卵管输卵管动物动物幼崽幼崽转
25、基因转基因动物动物微注射微注射移植移植妊娠妊娠出生出生分子分子检测检测基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12261982年哈佛年哈佛R.D.Palmiter“制造制造”的的“超级小超级小鼠鼠”其中有七只带有融合其中有七只带有融合基因，六只生长迅速，每基因，六只生长迅速，每只体重平均可达只体重平均可达44g44g，为，为同窝无融合基因小鼠平均同窝无融合基因小鼠平均体重体重29g29g的的1.51.5倍。倍。把这种重组的质粒注射入小鼠受精卵中，经过把这种重组的质粒注射入小鼠受精卵中，经过充分发育后分娩出了充分发育后分娩出了2121小鼠。小鼠。将大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白基因的将大鼠
26、生长激素基因与小鼠金属硫蛋白基因的启动子顺序连接，再引入质粒中。启动子顺序连接，再引入质粒中。转基因小鼠转基因小鼠正常小鼠正常小鼠基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12272000年法国科学家年法国科学家“制造制造”出发出绿色荧光出发出绿色荧光的兔子的兔子“Alba”。改造水母的荧光蛋白基因使荧光蛋白发光率提改造水母的荧光蛋白基因使荧光蛋白发光率提高了高了2 2倍，再将该基因显微注射转入到兔子的受精倍，再将该基因显微注射转入到兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子卵中，由此培养出了会发光的兔子AlbaAlba。在普通光线下它在普通光线下它看上去与其它同类没看上去与其它同类没有区别，
27、但在较暗光有区别，但在较暗光线下它的身体就会放线下它的身体就会放射出奇异的绿光。射出奇异的绿光。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1228乳腺生物反应器的诞生乳腺生物反应器的诞生 1987年年Gordon等将组等将组织型纤溶酶原激活剂织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清蛋白基因的启动与小鼠乳清蛋白基因的启动子构成重组基因，培育出了子构成重组基因，培育出了37只在乳汁中能表达只在乳汁中能表达tPA 的的转基因小鼠。转基因小鼠。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1229动物动物多肽药物多肽药物用途用途绵羊绵羊a1抗胰蛋白酶蛋白抗胰蛋白酶蛋白治疗气肿治疗气肿绵羊绵羊CFTR治疗
28、治疗 囊肿性纤维化囊肿性纤维化绵羊绵羊组织型纤溶酶原活化因子组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓治疗血栓绵羊绵羊凝血凝血VIII因子、因子、IX因子因子治疗血友病治疗血友病绵羊绵羊纤维蛋白原纤维蛋白原伤口愈合伤口愈合猪猪组织型纤溶酶原活化因子组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓治疗血栓猪猪凝血凝血VIII因子、因子、IX因子因子治疗血友病治疗血友病山羊山羊人蛋白质人蛋白质 C治疗血栓治疗血栓山羊山羊抗血栓因子抗血栓因子 3治疗血栓治疗血栓山羊山羊谷氨酸脱羧酶谷氨酸脱羧酶治疗治疗I型糖尿病型糖尿病山羊山羊Pro542治疗爱滋治疗爱滋 病病牛牛a-乳清白蛋白乳清白蛋白抗炎症抗炎症牛牛凝血凝血VIII因子因子治
29、疗血友病治疗血友病牛牛纤维蛋白原纤维蛋白原伤口愈合伤口愈合牛牛胶原蛋白胶原蛋白 I,II组织修复组织修复,治疗风湿性关节炎治疗风湿性关节炎牛牛乳铁蛋白乳铁蛋白治疗肠道感染治疗肠道感染,感染性关节炎感染性关节炎牛牛人血清白蛋白人血清白蛋白维护血液体积维护血液体积鸡鸡,牛牛,山羊山羊单克隆抗体单克隆抗体用于疫苗生产用于疫苗生产基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1230基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1231显微注射法等传统的转基因技术具有随机显微注射法等传统的转基因技术具有随机性和不可预见性、整合率、表达低等式缺陷。性和不可预见性、整合率、表达低等式缺陷。外源基因的拷贝数和整
30、合位点都是随机的；外源基因的拷贝数和整合位点都是随机的；小鼠小鼠,大鼠大鼠,兔兔,牛牛,猪猪,绵羊阳性率分别为绵羊阳性率分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0.9%。整合率极低，得到的转基因动物数量更少。整合率极低，得到的转基因动物数量更少。采用非受精卵还出现嵌合体；采用非受精卵还出现嵌合体；受到宿主染色体上整合位点的影响，大部分转受到宿主染色体上整合位点的影响，大部分转 基因表达水平较低。基因表达水平较低。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1232 即即体细胞克隆技术体细胞克隆技术，是用显微操作、电融合等，是用显微操作、电融合等方法将方法将动物体细胞的细胞核动物体细胞
31、的细胞核全部导入另一个个体的全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。内，使之发育成为个体。核转移技术可使一个细胞变成一个个体，所产核转移技术可使一个细胞变成一个个体，所产生的个体携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质生的个体携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，完全一样，是一种无性繁殖过程是一种无性繁殖过程，即，即克隆克隆(clone)。（三）核转移技术简介（三）核转移技术简介基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12331.1.动物克隆动物克隆转移的核末经修饰转移的核末经修饰基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1234基因操作与医学(
32、3_LMJ)2022-10-1235多利羊诞生于多利羊诞生于1996年年7月月5日，日，1997年首年首次向公众披露。次向公众披露。被美国被美国科学科学杂杂志评为志评为1997年世界十年世界十大科技进步的第一项，大科技进步的第一项，也是当年最引人注目也是当年最引人注目的国际新闻之一。的国际新闻之一。科学家认为，科学家认为，“多多利利”的诞生标志着生的诞生标志着生物技术新时代的来临。物技术新时代的来临。1997年年2月月27日日Nature报道，报道，维尔穆特维尔穆特(Wilmut)和和坎贝尔坎贝尔(Campbell)利用利用克隆克隆技术培育出一只小母羊。技术培育出一只小母羊。基因操作与医学(3
33、_LMJ)2022-10-1236 坎贝尔利用克隆多利时冷冻保存下来的，同一坎贝尔利用克隆多利时冷冻保存下来的，同一只母羊乳腺组织样本，克隆出只母羊乳腺组织样本，克隆出“多利四羊组多利四羊组”。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1237 转基因动物可以作为天然的生物工厂，合成多肽转基因动物可以作为天然的生物工厂，合成多肽和蛋白质等生物活性物质，制备药物、抗体和疫苗等，和蛋白质等生物活性物质，制备药物、抗体和疫苗等，称为称为动物生物反应器动物生物反应器(animal bioreactor)。生物药物生产主要通过乳腺生产生物药物生产主要通过乳腺生产(动物乳腺生物动物乳腺生物反应器反应器)
34、，少数通过肾脏和膀胱。，少数通过肾脏和膀胱。用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等。体等。2.2.转基因动物生物反应器的制备转基因动物生物反应器的制备 转移的核经过修饰转移的核经过修饰基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12381997年年6月月伊恩伊恩维尔穆特维尔穆特(Wilmut)报道用基因改造报道用基因改造过的胎儿成纤维细胞为核供体，获得了表达人凝血因过的胎儿成纤维细胞为核供体，获得了表达人凝血因子子IX的转基因克隆绵羊的转基因克隆绵羊
35、“波莉波莉”。成功克隆出携带有人凝血因子成功克隆出携带有人凝血因子X基因的绵羊早基因的绵羊早期期 胚胎成纤维细胞；胚胎成纤维细胞；以该细胞系为核供体移植到去核卵母细胞中，经以该细胞系为核供体移植到去核卵母细胞中，经 过处理后将卵母细胞植入假孕绵羊体内发育。过处理后将卵母细胞植入假孕绵羊体内发育。获得获得3只能高水平表达人凝血因子只能高水平表达人凝血因子X（125g/ml）的绵羊。的绵羊。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1239 人体移植器官短缺是一个世界性难题，研究人员人体移植器官短缺是一个世界性难题，研究人员把目光移向动物以寻求可替代移植器官。把目光移向动物以寻求可替代移植器官。
36、猪器官的体积、猪器官的体积、形状和形状和DNADNA基本与人类基本与人类相似，是理想的器官相似，是理想的器官供应者，但这种器官供应者，但这种器官移植的主要问题之一移植的主要问题之一是免疫排斥。是免疫排斥。三、制造用于移植的细胞、组织和器官三、制造用于移植的细胞、组织和器官基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1240解决办法之一：解决办法之一：通过转基因技术，特别是基因打靶技术：通过转基因技术，特别是基因打靶技术：敲除敲除-半乳糖抗原决定基因，再结合克隆技术，半乳糖抗原决定基因，再结合克隆技术，培育大量不含免疫排斥的转基因克隆猪的器官。培育大量不含免疫排斥的转基因克隆猪的器官。向供体器官
37、基因组向供体器官基因组敲入敲入某种调节因子，抑制某种调节因子，抑制-半半乳糖抗原决定基因的表达；乳糖抗原决定基因的表达；基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1241（一）基因打靶技术简介（一）基因打靶技术简介 可在细胞水平进行，从而建立新的细胞系；也可可在细胞水平进行，从而建立新的细胞系；也可在动物整体水平进行，以建立基因剔除动物。在动物整体水平进行，以建立基因剔除动物。基因打靶基因打靶(Gene targeting)，是一种在，是一种在胚胎干细胞胚胎干细胞(ES)(ES)技术技术和和同源重组技术同源重组技术的基础之上，定向改变生物的基础之上，定向改变生物体内某种基因的技术。体内某种基
38、因的技术。基因敲除基因敲除(gene knockout)：定向敲除某种基因：定向敲除某种基因基因敲入基因敲入(gene knockin)：定向替代某种基因：定向替代某种基因基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1242基本过程包括：基本过程包括：用同源基因片段构建含有目的基因的载体；用同源基因片段构建含有目的基因的载体；用显微注射法将含有目的基因的载体导入用显微注射法将含有目的基因的载体导入ES细胞，细胞，与与ES细胞染色体的相应基因发生同源重组，替代细胞染色体的相应基因发生同源重组，替代 ES细胞中原有的基因；细胞中原有的基因；将基因替代了的将基因替代了的ES细胞注入动物的囊胚中，使其
39、细胞注入动物的囊胚中，使其 与囊胚中的细胞共同组成囊胚内的细胞团；与囊胚中的细胞共同组成囊胚内的细胞团；将囊胚移植到假孕动物的子宫中，使之发育成一将囊胚移植到假孕动物的子宫中，使之发育成一 种既有含目的基因细胞又有原有细胞的嵌合体；种既有含目的基因细胞又有原有细胞的嵌合体；将嵌合体动物与正常动物交配，最终筛选出基因将嵌合体动物与正常动物交配，最终筛选出基因 替代的纯合子动物。替代的纯合子动物。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1243跨物种感染：跨物种感染：一般不会感染人的病毒，通过异种器官移植提一般不会感染人的病毒，通过异种器官移植提供的种间细胞亲密接触，可能感染人或者与人的病供的
40、种间细胞亲密接触，可能感染人或者与人的病毒重组形成更危险更致命的病毒，而且免疫系统受毒重组形成更危险更致命的病毒，而且免疫系统受到抑制的移植受体比一般人更容易被感染。到抑制的移植受体比一般人更容易被感染。更加重要的是，转基因动物带的未知病毒是否更加重要的是，转基因动物带的未知病毒是否会从移植受体扩散出去，从而传播到其他人造成疫会从移植受体扩散出去，从而传播到其他人造成疫病大流行，引起流行病？病大流行，引起流行病？风险风险基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1244组织工程组织工程 是利用人体自是利用人体自身细胞和组织工程身细胞和组织工程的理论与方法，使的理论与方法，使原先缺损的组织和原
41、先缺损的组织和器官沿着设计好的器官沿着设计好的支架、模型顺其自支架、模型顺其自然地成长起来发。然地成长起来发。多能干细胞的定向分化多能干细胞的定向分化基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1245 2006 2006年，京都大学的山中伸弥年，京都大学的山中伸弥(Shinya Yamanaka)(Shinya Yamanaka)从从2424个候基因中筛选出个候基因中筛选出4 4个与胚胎干细胞多能性更为密个与胚胎干细胞多能性更为密切相关的基因：切相关的基因：Oct4Oct4、Sox2Sox2、c-Mycc-Myc和和Klf4Klf4；证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源证实了分化的细胞
42、可以通过少数几个因子的外源导入而被重编程到具有多能性的状态。导入而被重编程到具有多能性的状态。将它们导入到小鼠胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维将它们导入到小鼠胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞，成功地将其细胞，成功地将其重编程重编程为具有胚胎干细胞多能性的为具有胚胎干细胞多能性的细胞，称之为细胞，称之为诱导多能干细胞诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS cell)。（二）（二）诱导产生的多功能性干细胞技术诱导产生的多功能性干细胞技术基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12461.Oct3/4Oct-4，也称，也称Oct-3，属于，属于POU转录因子家
43、族的一员。转录因子家族的一员。是哺乳动物胚胎发育的一个关键的调控因子。是哺乳动物胚胎发育的一个关键的调控因子。是全能性的标志；是全能性的标志；能够促使能够促使ICM形形成、维持胚胎干细成、维持胚胎干细胞未分化前状态，胞未分化前状态，并促进其增殖。并促进其增殖。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12472.SOX2基因基因 SOX2 SOX2基因是编码转录基因是编码转录因子的主控基因（因子的主控基因（master master genesgenes）家族的一个成员。）家族的一个成员。转录因子是些与转录因子是些与DNADNA结结合并调节其他基因表达的合并调节其他基因表达的蛋白质。蛋白质。
44、基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12483.癌症基因癌症基因c-MYC 癌症基因癌症基因c-MYCc-MYC，是一，是一种最容易过渡表现于人类种最容易过渡表现于人类的致癌基因，的致癌基因，它对某些成体干细胞它对某些成体干细胞的自我更新起一定的作用，的自我更新起一定的作用，并可以抑制并可以抑制ESES细胞的分化。细胞的分化。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12494.Klf4 Krueppel-like factor 4，KLF4上皮锌指转录上皮锌指转录因子因子Klf4(旧称旧称GKLF)调节体外细胞的增生调节体外细胞的增生与分化与分化。基因操作与医学(3_LMJ)202
45、2-10-1250诱导式多能性干细胞实验流程式诱导式多能性干细胞实验流程式基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1251制定治疗用制定治疗用iPSiPS实验流程实验流程基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1252 2006年年11月月20日日，日本京都大学的山中伸弥，日本京都大学的山中伸弥(Shinya Yamanaka)在在Cell杂志上发表重量级杂志上发表重量级论文，宣布他们用基因改造的手段，将人类体细论文，宣布他们用基因改造的手段，将人类体细胞改造成了类胚胎干细胞，其功能上几乎可以和胞改造成了类胚胎干细胞，其功能上几乎可以和胚胎干细胞相媲美。胚胎干细胞相媲美。基因操作与医学
46、(3_LMJ)2022-10-1253 同是同是20072007年年1111月月2020日，美国威斯日，美国威斯康 星 大 学 詹 姆康 星 大 学 詹 姆斯斯汤姆森的研究汤姆森的研究小组在小组在ScienceScience杂志发表体细胞转杂志发表体细胞转变成变成“诱导性多能诱导性多能干细胞干细胞”(iPS(iPS细胞细胞)的成果。的成果。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1254Junying YU,James A.Thomson.Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells.Science
47、,2007,318(5858):1917-1920 这位在美国研究的中这位在美国研究的中国科学家国科学家俞君英俞君英博士，出博士，出生于浙江诸暨，生于浙江诸暨，19971997年毕年毕业于北京大学，赴美国美业于北京大学，赴美国美国宾夕法尼亚大学留学。国宾夕法尼亚大学留学。20032003年进威斯康星大学詹年进威斯康星大学詹姆斯姆斯汤姆森实验室进行汤姆森实验室进行研究工作。研究工作。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-12552012年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖 京都大学物质京都大学物质-细胞统合系统据点细胞统合系统据点iPS细胞研究中细胞研究中心主任山中伸弥、英国发育生
48、物学家约翰心主任山中伸弥、英国发育生物学家约翰-戈登因在戈登因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献而获奖。细胞核重新编程研究领域的杰出贡献而获奖。所谓细胞核重编所谓细胞核重编程即将成年体细胞重程即将成年体细胞重新诱导回早期干细胞新诱导回早期干细胞状态，以用于形成各状态，以用于形成各种类型的细胞，应用种类型的细胞，应用于临床医学。于临床医学。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1256山中伸弥简介：山中伸弥简介：山中伸弥，山中伸弥，19621962年出生于日本大阪府，日本医年出生于日本大阪府，日本医学家，诱导多功能干细胞学家，诱导多功能干细胞(iPScell)创始人之一。京创始人之一。京都
49、大学再生医科研究所干细胞生物系教授，美国加都大学再生医科研究所干细胞生物系教授，美国加利福尼亚州旧金山心血管疾病研究所高级研究员。利福尼亚州旧金山心血管疾病研究所高级研究员。约翰约翰-戈登简介：戈登简介：约翰约翰-伯特兰伯特兰-戈登，戈登，7979岁，岁，19331933年年1010月月2 2日出日出生，英国发育生物学家。他主要以在细胞核移植与生，英国发育生物学家。他主要以在细胞核移植与克隆方面的先驱性研究而知名。克隆方面的先驱性研究而知名。20092009年戈登与日本年戈登与日本医学家山中伸弥一同获得拉斯克基础医学奖，医学家山中伸弥一同获得拉斯克基础医学奖，20122012年与山中伸弥一同获诺贝尔奖生理学或医学奖。年与山中伸弥一同获诺贝尔奖生理学或医学奖。基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1257 2.2.简述简述显微注射法建立转基因鼠技术路线显微注射法建立转基因鼠技术路线。思考题：思考题：3.3.简述获得简述获得2012年诺贝尔生理学或医学奖的年诺贝尔生理学或医学奖的诱导式多能性干细胞技术的原理诱导式多能性干细胞技术的原理？1.1.基因操作技术在医学方面的应用主要包括基因操作技术在医学方面的应用主要包括？基因操作与医学(3_LMJ)2022-10-1258
