1、卫生细菌学检验卫生细菌学检验第五章第五章 大肠菌群的测定大肠菌群的测定 一、定义及范围一、定义及范围 大肠菌群（大肠菌群（coliform groupcoliform group或或coliform bacteriacoliform bacteria）:在在3737度能发酵乳糖，在度能发酵乳糖，在2424小时内产酸产气的需氧或兼性厌氧的革小时内产酸产气的需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。兰氏阴性无芽孢杆菌。n包括大肠埃希菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属包括大肠埃希菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属的一部分及沙门菌属的的一部分及沙门菌属的亚属（发酵乳糖）组成。亚属（发酵乳糖）组
2、成。n通常大肠埃希菌对靛基质、甲基红、通常大肠埃希菌对靛基质、甲基红、V-PV-P、枸椽酸盐利用四个枸椽酸盐利用四个生化反应分别为生化反应分别为“+-+-”，称为典型大肠杆菌，其它类的称，称为典型大肠杆菌，其它类的称为非典型大肠杆菌。为非典型大肠杆菌。第一节第一节 大肠菌群测定的卫生学意义大肠菌群测定的卫生学意义二、测定的意义二、测定的意义n18921892年，沙尔丁格提出将大肠菌群作为水质粪便污染年，沙尔丁格提出将大肠菌群作为水质粪便污染的的指示菌指示菌（indicative bacteriaindicative bacteria）n成人粪便中大肠杆菌有成人粪便中大肠杆菌有10108 8-1
3、0-109 9个个/g/g。n适用于各种类型水的分析；适用于各种类型水的分析；n是存在于肠道中的特有菌；是存在于肠道中的特有菌；n当肠道病原体存在的同时当肠道病原体存在的同时大肠菌群大肠菌群也存在；也存在；n大肠菌群比最难对付的肠道病原体存活时间更长，大肠菌群比最难对付的肠道病原体存活时间更长，对外环境的抵抗力大于等于致病菌；对外环境的抵抗力大于等于致病菌；n进入水中不再繁殖；进入水中不再繁殖；n检验方法具有很强的特异性和高度敏感性检验方法具有很强的特异性和高度敏感性n检验方法简便，易于操作、检出和计数检验方法简便，易于操作、检出和计数n对人类无害对人类无害n指示菌的水平与被粪便污染程度有某些
4、直接的联系指示菌的水平与被粪便污染程度有某些直接的联系1.大肠菌群作为指示菌的特性大肠菌群作为指示菌的特性 国际上如瑞士、瑞典等国以大肠菌群作为药品、食品、国际上如瑞士、瑞典等国以大肠菌群作为药品、食品、饮水等的卫生指示菌。饮水等的卫生指示菌。以以100100mLmL水检样内允许含有的大肠菌群的实际数值，以水检样内允许含有的大肠菌群的实际数值，以最大机率数（最大机率数（most probable number,MPNmost probable number,MPN）来表示。来表示。其它粪便污染指示菌其它粪便污染指示菌分支杆菌、拟杆菌、乳酸菌、梭状芽孢杆菌、粪链球菌分支杆菌、拟杆菌、乳酸菌、梭状
5、芽孢杆菌、粪链球菌克雷伯菌、变形杆菌、副大肠杆菌克雷伯菌、变形杆菌、副大肠杆菌2.不足之处不足之处n饮用水在含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行；n在一定条件下能在水中繁殖；n在外界环境中，有的沙门菌比大肠菌群更有耐受力。3.意义意义n控制肠道传染病的发生和流行n反映检样受粪便污染的程度n反映在生产各环节的卫生状况n具有广泛的卫生学意义检样检样稀释稀释乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管不产气不产气阴性阴性报告报告产气产气EMB、远腾氏等远腾氏等革兰氏染色革兰氏染色阴性阴性报告报告革兰氏阳性革兰氏阳性革兰氏阴性无芽孢革兰氏阴性无芽孢乳糖发酵管乳糖发酵管不产气不产气产气产气阳性阳性报
6、告报告阴性阴性报告报告胆盐、或去氧胆酸钠胆盐、或去氧胆酸钠1 1、测定程序、测定程序第二节第二节 测定方法测定方法2 2.多管发酵法测定方法多管发酵法测定方法发酵试验发酵试验：在：在2 2个装有个装有5050mLmL的的3 3倍浓缩（三料）乳糖胆盐蛋白倍浓缩（三料）乳糖胆盐蛋白胨培养液（含溴钾酚紫指示剂）的大试管或烧瓶中，无菌胨培养液（含溴钾酚紫指示剂）的大试管或烧瓶中，无菌操作加水样操作加水样100100mL.mL.在在1010支装有支装有5 5mLmL的三料乳糖胆盐发酵管的三料乳糖胆盐发酵管中（内有倒置小管），以无菌操作各加水样中（内有倒置小管），以无菌操作各加水样1010mL,mL,摇匀
7、后，摇匀后，3737度培养度培养2424小时。小时。平板分离平板分离：将产酸产气及只产酸的发酵管，接种于伊红美蓝：将产酸产气及只产酸的发酵管，接种于伊红美蓝（紫黑色有金属光泽）或远滕氏（淡粉红色）、麦康凯（紫黑色有金属光泽）或远滕氏（淡粉红色）、麦康凯（玫瑰红色）琼脂平板上，（玫瑰红色）琼脂平板上，35-3735-37度培养度培养2424小时。小时。证实试验证实试验：将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌菌落接种于单料乳：将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌菌落接种于单料乳糖发酵管中，糖发酵管中，35-37 35-37度培养度培养2424小时，产酸产气，即证实有小时，产酸产气，即证实有大肠菌群存在。大肠菌群存在。水
8、源水水源水严重污染水：严重污染水：1 1，0.1,0.01,0.0010.1,0.01,0.001mLmL中度污染水：中度污染水：1010，1 1，0.1,0.010.1,0.01mLmL轻度污染水：轻度污染水：100100，1010，1 1，0.10.1mLmL大肠菌群变异不大的水源水：大肠菌群变异不大的水源水：1010mL10mL10份份 接种量接种量1 1mLmL及及1 1mLmL以内用单料乳糖胆盐以内用单料乳糖胆盐发酵管，接种量在发酵管，接种量在1 1mLmL以上者，应保证接种以上者，应保证接种后发酵管中的总液体为单料培养液。后发酵管中的总液体为单料培养液。大肠菌群检索表（饮用水）大肠
9、菌群检索表（饮用水）阳性管数阳性管数每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数备注备注012接种水样总量接种水样总量300mL(100mL 2 份，份，10mL 10份份)034111381827132731118384142452518307062236927274312083151161936602301040692303.注意事项注意事项n乳糖发酵试验乳糖发酵试验分离培养分离培养证实试验三步中，初发酵与证证实试验三步中，初发酵与证实试验可能相差较大。实试验可能相差较大。n抑菌剂如胆盐等对大肠菌群中的某些菌株会有抑制作用。抑菌剂如胆盐等对大肠菌群中的某些菌株会有抑制作用。猪、牛、羊的胆盐效果
10、较好，去氧胆酸钠对结果影响较大，猪、牛、羊的胆盐效果较好，去氧胆酸钠对结果影响较大，胆盐剂量以胆盐剂量以0.5%0.5%较适宜。较适宜。n挑选菌落时，挑选菌落时，EMBEMB平板上，紫色菌落检出率较高，红色、粉平板上，紫色菌落检出率较高，红色、粉色较低；无典型菌落时，宜多挑选。色较低；无典型菌落时，宜多挑选。n有些在初发酵时产酸无气的，复发酵时却为阳性，用手轻有些在初发酵时产酸无气的，复发酵时却为阳性，用手轻拍管壁，观察有无气泡上浮。拍管壁，观察有无气泡上浮。1.薄膜集菌法薄膜集菌法 薄膜集菌薄膜集菌：取供试液：取供试液333333mLmL，以无菌薄膜过以无菌薄膜过滤，将细菌截留在薄膜上。滤，
11、将细菌截留在薄膜上。培养检查培养检查：将上述集菌的薄膜面向上平贴在：将上述集菌的薄膜面向上平贴在品红亚硫酸钠琼脂平板上，品红亚硫酸钠琼脂平板上，35-3735-37培养培养2424h h，如有红色发酵乳糖的革兰氏阴性无芽孢杆菌如有红色发酵乳糖的革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落，再做乳糖发酵试验。的菌落，再做乳糖发酵试验。发酵试验发酵试验：接种于乳糖蛋白胨半固体培养基：接种于乳糖蛋白胨半固体培养基上，上，37 637 6h-8hh-8h，产气者为阳性。产气者为阳性。第三节第三节 快速检测方法快速检测方法滤膜技术的优缺点滤膜技术的优缺点n优点：重复性好，经常可能只需单一步骤，可在不同培养基之间进行转移，
12、可处理大量水样，增加了分析的灵敏度，节省时间，较MPN法成本低。n缺点：高混浊度的水限制了取样的体积，背景细菌量较多，导致过度生长，金属和酚能够吸附到滤膜上，抑制了微生物生长。2.Coli ID检测法检测法n含有两种显色物质，可以直接识别大肠菌（含有两种显色物质，可以直接识别大肠菌（coliforms）群和鉴群和鉴定大肠杆菌（定大肠杆菌（Escherichia coli）,而不需附加任何试剂。抑制了而不需附加任何试剂。抑制了革兰氏阳性菌和酵母菌，菌落颜色变化的敏感性完全适合食品革兰氏阳性菌和酵母菌，菌落颜色变化的敏感性完全适合食品微生物检验。红色菌落为大肠杆菌。蓝色菌落为其它大肠菌群。微生物检
13、验。红色菌落为大肠杆菌。蓝色菌落为其它大肠菌群。3.TTC3.TTC（氯化三苯四氮唑）显色快速法氯化三苯四氮唑）显色快速法（1）TTC乳糖培养基制备乳糖培养基制备2%2%乳糖发酵管：乳糖、蛋白胨、水乳糖发酵管：乳糖、蛋白胨、水TTCTTC培养液：蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、十二烷基磺酸钠、水培养液：蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、十二烷基磺酸钠、水以无菌操作进行分装。以无菌操作进行分装。（2 2）三料）三料TTC乳糖培养基乳糖培养基n接种：接种接种：接种1 1、0.10.1、0.010.01mLmL各三管于中，若接种量为各三管于中，若接种量为1010mLmL，则则用三料用三料TTCTTC乳糖培养基
14、。乳糖培养基。n培养：培养：35-3718-2435-3718-24h h。n结果判定：观察有无红色及产气。结果判定：观察有无红色及产气。（3）注意事项n产气观察要全面，小管是否堵塞，可轻拍n有颜色的检样稀释10倍后再接种n蛋白胨的质量要好n十二烷基磺酸钠可用洗衣粉替代4 DC4 DC（去氧胆酸钠）半固体试管快速法去氧胆酸钠）半固体试管快速法n制备制备DCDC培养基（绿色）：将配方中各固体成培养基（绿色）：将配方中各固体成分加热溶于水后，调分加热溶于水后，调pH7.2pH7.2，加入指示剂和加入指示剂和DCDC溶液，煮沸溶液，煮沸3 3minmin备用。备用。n接种：先加样品，后注入培养基，充
15、分混匀接种：先加样品，后注入培养基，充分混匀后，凝固后，后，凝固后，3718-243718-24h h。n结果判定：桔红色，有气泡产生或琼脂裂，结果判定：桔红色，有气泡产生或琼脂裂，为阳性，绿色则为阴性。为阳性，绿色则为阴性。5.5.纸片快速法纸片快速法n制备培养基：营养成分溶解并调完酸碱度后，加入制备培养基：营养成分溶解并调完酸碱度后，加入指示剂溴甲酚紫，灭菌后加入指示剂溴甲酚紫，灭菌后加入TTCTTC溶液。将新中华定溶液。将新中华定性滤纸切成规定大小，灭菌后备用。将制好的培养性滤纸切成规定大小，灭菌后备用。将制好的培养基浸渍纸片，基浸渍纸片，4040烘干，备用。烘干，备用。n接种：取各稀释
16、度涂布于纸片上，接种：取各稀释度涂布于纸片上，37153715h h后观察结后观察结果。果。n结果判定：纸片上出现紫红色菌落，周围有黄圈者结果判定：纸片上出现紫红色菌落，周围有黄圈者为阳性。为阳性。第四节第四节 耐热大肠菌群的测定耐热大肠菌群的测定1 1 耐热大肠菌群的定义耐热大肠菌群的定义n大肠菌群的细菌在自然环境中存在时，逐渐适应大肠菌群的细菌在自然环境中存在时，逐渐适应2525 ，在，在3737培养仍可生长，但将温度升至培养仍可生长，但将温度升至44.544.5时，则不再生长。时，则不再生长。n而直接来自人、畜粪便中的大肠菌群，不仅在而直接来自人、畜粪便中的大肠菌群，不仅在3737正常生
17、长，正常生长，在在44.544.5也可继续生长，称为粪大肠菌群也可继续生长，称为粪大肠菌群（faecal faecal coliformcoliform）；）；最近主张采用最近主张采用“耐热大肠菌群耐热大肠菌群”（thermotolerant coliform bacteriathermotolerant coliform bacteria）。）。n定义：定义：在在44-4544-45能发酵乳糖的革兰氏阴性无芽孢杆菌，包括能发酵乳糖的革兰氏阴性无芽孢杆菌，包括大肠埃希菌属、肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。大肠埃希菌属、肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。n耐热大肠菌群在卫生学上具有更大的意义，
18、它在人耐热大肠菌群在卫生学上具有更大的意义，它在人粪中占大肠菌群数的粪中占大肠菌群数的96.4%96.4%。n耐热大肠菌群在自然界中不生长，除非在具有丰富耐热大肠菌群在自然界中不生长，除非在具有丰富营养、温度在营养、温度在1313以上，无余氯的水中生长，也可以上，无余氯的水中生长，也可在工业污水、腐烂植物及土壤中发现。在工业污水、腐烂植物及土壤中发现。n如果大肠菌群和耐热大肠菌群均高，多为近期污染；如果大肠菌群和耐热大肠菌群均高，多为近期污染；如果大肠菌群数高，而耐热大肠菌群低，则多为远如果大肠菌群数高，而耐热大肠菌群低，则多为远期污染。期污染。2.检测的意义n乳糖发酵试验：药品检样乳糖发酵试验：药品检样1010mLmL接种于双料胆盐接种于双料胆盐乳糖发酵管，乳糖发酵管，44.544.5培养培养2424h h，发酵产气者，发酵产气者，进行确证实验。不产气者，报告为阴性。进行确证实验。不产气者，报告为阴性。n确证试验：取产气的乳糖胆盐发酵管培养物划确证试验：取产气的乳糖胆盐发酵管培养物划线于线于EMBEMB等琼脂平板上，置于等琼脂平板上，置于44.544.5培养培养18-18-2424h h，凡平板上有典型菌落生长，则证实为耐凡平板上有典型菌落生长，则证实为耐热大肠菌群阳性。热大肠菌群阳性。3.3.耐热大肠菌群的检查方法耐热大肠菌群的检查方法
