1、细胞和基因治疗细胞和基因治疗1.细胞治疗的方法细胞和基因治疗2细胞和基因治疗3细胞和基因治疗4细胞和基因治疗5细胞和基因治疗6 基因治疗基因治疗 一、基因治疗的概念及遵循原则 二、基因治疗的程序 三、基因治疗的策略 四、基因治疗的临床应用 五、基因治疗的问题与前景细胞和基因治疗7细胞和基因治疗8细胞和基因治疗9细胞和基因治疗10基因治疗的概念 定义：向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片断，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。出于伦理、安全性和技术性的考虑，现在多是针对体细胞的治疗。基因治疗常采取：(1)基因置换(gene replacement)(2)
2、基因修正(gene correction)(3)基因修饰(gene augmentation)(4)基因失活(gene inactivation)细胞和基因治疗11基因置换 基因置换(gene replacement)：是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。但操作难度大，有伦理学问题。细胞和基因治疗12基因修正 基因修正(gene correction)是指将致病基因的突变碱基序列得以纠正，而正常序列部分予以保留，使突变的致病基因恢复正常功能。即使致病基因的突变序列纠正为正常序列（用碱基点突变技术）。细胞和基因治疗13 定点突变 基因打靶（基因打靶（gene
3、targeting）又称同源重组技）又称同源重组技术。术。利用外源基因序列与靶细胞内染色体上利用外源基因序列与靶细胞内染色体上同源基因序列间的重组，将外源基因定点整同源基因序列间的重组，将外源基因定点整合到靶细胞基因组上的某一确定位点合到靶细胞基因组上的某一确定位点,来定点来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因和基因组的功能。的个体内来研究基因和基因组的功能。细胞和基因治疗14 基因敲除基因敲除knock-out:使基因组中某个使基因组中某个/某几某几个基因或基因的顺时元件产生缺陷，从而个基因或基因的顺时元件产生缺陷，从而在突变体内
4、丧失正常的功能，来探测这些在突变体内丧失正常的功能，来探测这些基因或元件原来在体内的功能。基因或元件原来在体内的功能。基因敲入基因敲入knock-in：在个体的基因组中定：在个体的基因组中定点加入了某个点加入了某个/某几个基因或基因的顺时元某几个基因或基因的顺时元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺时元件在体内的功能，或用该基因因或顺时元件在体内的功能，或用该基因揭示相邻基因的表达规律等。揭示相邻基因的表达规律等。细胞和基因治疗15基因修饰 基因修饰(gene augmentation)则是指将目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可修饰和
5、改变缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。细胞和基因治疗16基因失活 基因失活(gene inactivation)：应用反义技术(antisense technology)特异封闭某些基因的表达，以达到抑制或阻止某些有害基因的表达。SiRNA的基因干扰可造成靶基因（异常基因）的失活（或沉默）。细胞和基因治疗17基因治疗遵循的原则 1治疗的疾病应是指目前治疗方法难以阻止疾病发展的严重疾病。2遗传性疾病应是属于染色体“隐性”遗传的疾病，即指来自双亲的二条染色体上同一基因位点都发生改变的疾病，只要通过导入同一正常基因即可纠正缺陷。3能治疗疾病的正常基因已经被克隆，并能表达有功能的产物。4基因治疗用
6、的基因在体内表达无需精确调控，表达产物过多不会产生危害。5注入体内带有外源基因的治疗细胞，应能自然消减去除。细胞和基因治疗18二、基因治疗的程序(一一)目的基因的准备目的基因的准备 (二二)受体细胞受体细胞(靶细胞靶细胞)的选择和培养的选择和培养。(三三)载体的选择载体的选择 (四四)目的基因导入靶细胞的基因转移方法目的基因导入靶细胞的基因转移方法 细胞和基因治疗19目的基因导入靶细胞目的基因导入靶细胞的基因转移方法的基因转移方法 1基因转移的物理法 2基因转移的化学法 3基因转移的融合法 4基因转移的颗粒轰击技术 5基因转移的病毒载体法细胞和基因治疗201基因转移的物理法细胞和基因治疗212
7、基因转移的化学法(1)DNA磷酸钙共沉淀法细胞和基因治疗22Transfection of DNA by calcium phosphate coprecipitation 基因加氯化钙再加入Hepes形成DNA-磷酸钙沉淀颗粒，被细胞吞入。细胞和基因治疗232 DEAE葡聚糖法 基因加DEAE-dextron，形成复合物，被细胞吞入或先用DEAE处理细胞再加DNA，而后被吞入。细胞和基因治疗243 染色体介导法 收集分裂中期染色体，用磷酸钙共沉淀法导入。细胞和基因治疗254 聚阳离子DMSO转染技术 先用DMSO处理细胞（改变通透性），再加入聚阳离子处理的DNA（增加细胞表面吸附能力）细胞和
8、基因治疗263基因转移的融合法 1 细胞融合法 PEG/仙台病毒使供/受细胞融合。细胞和基因治疗272 脂质体介导法 脂质体包被基因DNA后，加入PEG预处理的受体细胞，使细胞融合。细胞和基因治疗283 原生质体融合法 将目的基因质粒重组菌制成感受态，在溶菌酶作用下，释放原生质体，再加入原先用PEG处理的受体细胞，发生原生质体与受体细胞融合。细胞和基因治疗294 微细胞核介导法 供体细胞先用秋水仙素处理，再用细胞松弛素处理（脱核），制成微核细胞，再加PEG处理的受体细胞，再进行细胞融合。细胞和基因治疗30目的基因的准备目的基因的准备 其表达产物已证明有活性，功能确切，在启动子下游可表达，有标记
9、基因筛选，监控重组体。细胞和基因治疗31受体细胞的选择和培养受体细胞的选择和培养 易取材，易培养，基因易导入，对载体敏感，可培养传代，寿命相对较长。能达足够量，如疾病细胞，造血细胞、基质细胞、上皮、成纤维、内皮细胞等。细胞和基因治疗32载体的选择载体的选择1.质粒载体既具有动物（人）细胞表达元件，又具有细菌质粒相关元件。2.病毒载体：1.重组病毒载体：基因重组病毒可直接感染细胞导入基因 2.重组质粒型病毒载体：在细菌中扩增质粒，体外包装形成假病毒，感染靶细胞，将基因导入。细胞和基因治疗334基因转移的颗粒轰击技术 基因枪法最早是由美国康基因枪法最早是由美国康奈尔大学的奈尔大学的Sanford最
10、先最先提出的。提出的。1992年，世界年，世界首例转基因小鼠就是通过首例转基因小鼠就是通过该法获得的。该法获得的。在电场作用下，基因DNA的金属颗粒发生高速运动，使DNA导入细胞中。它与颗粒大小、电场的电压有关。细胞和基因治疗345.基因转移的病毒载体法 不同组织细胞和目的基因选用不同的病毒载体 不同的病毒载体选用不同扩增方式、敏感细胞或包装细胞 不同的病毒载体有不同的扩增、包装、感染、整合/游离的表达方式，如表13-1细胞和基因治疗35特定组织细胞可考虑的主要基因转移方法和途径游离淋巴细胞(ex vivo)逆转录病毒载体，基因枪，电穿孔肺组织腺病毒载体，气溶胶骨骼肌内组织裸DNA直接注射，基
11、因枪脑组织单纯疮疹病毒载体动脉管壁组织逆转录病毒转染内皮细胞(ex VIVO)通过脂质体或气囊导管回输肝组织逆转录病毒，直接注射(腹膜内注射，感染宫内动物)或部分肝切除后门静脉内(或肝实质内)注射 DNA复合物ASGP受体结合，基因枪。乳腺组织逆转录病毒载体（乳头管注射）皮肤组织基因枪，电穿孔细胞和基因治疗36四、基因治疗的临床应用（一）遗传性疾病的基因治疗（一）遗传性疾病的基因治疗（二）（二）肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗 （三）（三）抗病毒的基因治疗抗病毒的基因治疗细胞和基因治疗37细胞和基因治疗38（二）肿瘤的基因治疗（二）肿瘤的基因治疗 1目的基因的选择和治疗策略 2基因治疗方法 3细胞
12、因子的基因治疗 4提高机体抗肿瘤免疫力的基因治疗 细胞和基因治疗39三、基因治疗的策略细胞和基因治疗401目的基因的选择和治疗策略 肿瘤的基因治疗是以正常或野生型基因取代不正常基因或阻止异常基因的表达，以达到抑制或阻止、甚至逆转肿瘤细胞恶性表现之目的。常选用的目的基因有：增强机体细胞免疫功能，促进杀肿瘤和抑制肿瘤细胞生长的免疫调节和抗肿瘤作用的细胞因子基因如IL-2、IFN和集落刺激因子（CSF）及MHC的HLA-B7，HLA-DR基因。抑癌基因，如P53，WT-1和Rb三种基因，原癌基因的反义DNA及RNA和SiRNA基因治疗的策略。细胞和基因治疗412基因治疗方法（1）抑癌基因转移的基因治
13、疗（2）反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法 （3）药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用 （4）癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗如打破原先的肿瘤免疫的耐受，建立肿瘤特异免疫 （5）多重耐药性基因转移的肿瘤基因治疗细胞和基因治疗42（1）抑癌基因转移的基因治疗 基因导入肿瘤或其他细胞后其表达产物可抑制肿瘤及肿瘤细胞的恶性增生、血管形成等，甚至使恶性肿瘤细胞发生逆转，成为正常细胞。目前研究和应用较多的抑癌基因包括P53、WT-1、Rb、Ango和Endo等基因。细胞和基因治疗43（2）反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法 为了抑制肿瘤细胞中癌基因的过高表达，可根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义寡核苷酸，来抑制 癌基
14、因的表达（因反义寡核苷酸能与癌基因核酸中的正链的特定顺序互补与结合形成双链体）。反义寡核苷酸有以下几种：（1）反义RNA（2）具核酶（ribozyme）活性的反义RNA（3）脱氧寡聚核苷酸（oligodeo xyribonucleotides,ODN）（4）肽核酸（peitide nucleic acids,PNAS）细胞和基因治疗44反义RNA技术 反义RNA又是一种与mRNA互补的RNA分子，它是双链DNA中无义链转录的RNA，因此肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译部位就会被相应的反义RNA互补结合形成RNA/RNA双链体，进而阻止核糖体与mRNA结合，或阻止核糖体沿mRNA上移，以抑
15、制mRNA的翻译，起到了抑制癌基因过高表达癌蛋白的效果。反义RNA技术是抑制基因表达的一种干涉性基因治疗，以阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体mRNA的成熟，属基因失活疗法。细胞和基因治疗46具核酶活性的反义RNA 新技术、新思路，有较好的应用前景 在反义RNA研究的基础上，现又设计出具核酶（ribogyme）活性的反义RNA，它既能与mRNA互补结合阻止mRNA的翻译，同时反义RNA上带有锤头状结构基因能对靶序列（mRNA）进行特异性切割，建立了核酶基因治疗新技术，这种核酶反义RNA可反复使用以降解mRNA，其抑癌效应明显高于反义RNA。细胞和基因治疗47反基因技术（antige
16、ne）定义:是以脱氧寡聚核苷酸与双链DNA分子序列特异性结合形成三链DNA,从而在转录水平上调控基因表达的一种基因治疗策略。在转录和翻译水平阻断某些异常的基因的表达，以阻断癌细胞内的异常信号传导，使癌细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡。把三链DNA称为“能够攻击病毒和癌细胞而不损害健康组织的新型基因药物。反基因技术的关键？细胞和基因治疗48肽核酸（peptide nucleic acids,PNAS）目前可通过计算机分析DNA结构，以多肽骨架结构取代ODN中的糖-磷酸骨架，并成功地合成了该分子，它保留了ODN与DNA的高度亲和力，因此能与靶基因形成三螺旋结构，尽管此项技术目前只是处于实验研究阶
17、段，还有一些技术性问题尚待解决，但应用潜力极大。细胞和基因治疗49（3）药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用 药物自杀基因的作用机理 药物自杀基因的种类 药物自杀基因作用的底物-GCV/ACV 药物自杀基因靶向转移的特异性 药物自杀基因的临床应用前景 细胞和基因治疗50药物自杀基因的作用机理 自杀基因即通过转基因操作将某种代谢酶基因导入肿瘤细胞,表达的酶可以将无毒的化合物(前药物)转变成毒性药物,选择性的杀伤肿瘤细胞。HSV-tk基因和胞嘧啶脱氨酶基因(CD基因)等。另外，此类基因更可以通过“旁观者效应”杀伤未导入基因的邻近分裂细胞，扩大其杀伤效应。美国NIH已批准HSV-TK基因转染疗法试用于
18、脑瘤等的临床治疗，唯一被正式批准的肿瘤基因治疗试验。细胞和基因治疗513细胞因子的基因治疗 将细胞因子基因导入细胞，使其在局部持续分泌一定量的细胞因子。通过细胞因子表达后，一方面促进肿瘤表达特异抗原并诱发宿主抗肿瘤CTL反应;另一方面增强CTL和其他抗癌效应细胞作用。目前采用的细胞因子基因有干扰素、白细胞介素，肿瘤坏死因子，集落刺激因子等相关基因，导入免疫细胞，肿瘤和非肿瘤细胞中来实施人体的基因治疗。细胞和基因治疗524提高机体抗肿瘤免疫力的基因治疗 细胞因子的基因治疗，是提高机体抗肿瘤免疫力的较好的基因治疗方案，但肿瘤细胞有的不表达肿瘤特异性抗原，因而不能被免疫T细胞识别，有的虽能表达特异性
19、抗原，但缺少MHC抗原表达，又使T细胞难以进行限制性识别，因而T细胞不能被激活，使肿瘤细胞避免了机体的免疫监视。把病毒基因或抗原基因转移到肿瘤细胞中以增强肿瘤细胞的异质性，这种转基因的肿瘤细胞等于是引起肿瘤免疫应答的“瘤苗”，有利于T细胞产生共刺激信号，行使对肿瘤细胞的免疫应答，增强机体抗肿瘤免疫力。细胞和基因治疗53（三）抗病毒的基因治疗（三）抗病毒的基因治疗 主要集中在治疗艾滋病方面，抗病毒的基因治疗策略与抗肿瘤基因治疗大致相同，主要是采用基因修饰和基因失活的治疗策略，具体方案为：阻止病毒复制策略、使感染HIV细胞死亡的方法、降解策略。细胞和基因治疗54Regulation of Gene
20、 Activity in Eukaryotes 细胞和基因治疗55DNARNAproteinBiological activityGene copy numberPromoter activitymRNA stabilityRibosome binding siteCodon usageProtein stabilityMany host-dependent factors细胞和基因治疗56Posttranslational Modifications and the Regulation of Protein Stability Posttranslational Modifications
21、proteinacetylationmethylationglycosylation phosphorylation细胞和基因治疗57五、基因治疗的问题与前景五、基因治疗的问题与前景 前景广阔，但问题许多。1.伦理学问题 2.安全性问题 3.技术性问题 4.商品化问题 5.疗效问题细胞和基因治疗58细胞和基因治疗59 联合国教科文组织通过的国际人类基因数据宣言提出：在人类基因数据的采集工作中要遵循自愿原则，被采集基因数据者必须事先得到充分的信息并能自由决定是否同意；在处理人类基因数据时要尊重人的隐私权，不能向第三方透露个人信息；在保存人类基因工程数据时，要恰当保护人权和基本自由；在应用人类基因数据时，要保证恰当的用途，并做到利益共享。细胞和基因治疗60
