1、实验二实验二 马马 立立 克克 氏氏 病病琼琼 脂脂 扩扩 散散 实实 验验 鸡马立克氏病是由鸡马立克氏病是由鸡 马 立 克 氏 病 病 毒鸡 马 立 克 氏 病 病 毒（MDVMDV）引起的鸡的一种）引起的鸡的一种肿瘤性传染病。临床上以肿瘤性传染病。临床上以消瘦、麻痹、皮肤和内脏消瘦、麻痹、皮肤和内脏出现肿瘤为主要特征。可出现肿瘤为主要特征。可造成严重的经济损失，是造成严重的经济损失，是世 界 养 鸡 业 的 主 要 疾世 界 养 鸡 业 的 主 要 疾病之一。病之一。鸡马立克氏病引起的劈叉姿势 流行病学 临床症状 病理组织学检查 病毒分离鉴定 血清学试验:琼脂扩散实验(OIE推荐的替代试验
2、方法)马立克氏病诊断主要根据马立克氏病诊断主要根据 酶联免疫吸附实验AGP可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓抗原检测和1月龄以上鸡血清抗体检测。目的要求 了解琼脂扩散试验进行疾病诊断的操作和结果判定方法 仪器与材料 器材：琼脂打孔器、微量移液器或带胶乳头滴管、平皿等。试剂：马立克氏病标准抗原、标准阳性血清和标准阴性血清。实验类型 单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散双向双扩散 利用可溶性抗原和抗体在半固体凝胶中进行相向扩散反应，当抗原抗体分子相遇并达到适当比例时，就会互相结合、凝集，在两孔之间比例最合适的位置上出现白色沉淀带，从而判定相应的抗体和抗原。可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽
3、髓抗原检测和1月龄以上鸡血清抗体检测。实验原理实验原理 实验原理实验原理 A.琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移；B.合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀；C.沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自由运动；D.沉淀带一经形成，就像一道特异性的屏障一样，继续扩散而来的相同的抗原抗体，只能是沉淀带加浓加厚，而不能再向外扩散，但对其他抗原抗体系统则无屏障作用。沉淀线的特征与位置：1 抗原、抗体的特异性和浓度 2 抗原、抗体分子的大小 3 扩散率 实验原理实验原理 a.如抗原抗体的浓度基本平衡时，此沉淀带的位置主要决定 于两者的扩散系数。b.如果抗原过多，则沉淀带向抗体偏移，反之亦然。实验原理实验原
4、理 实验原理实验原理 抗原分子量抗原分子量 抗体分子量抗体分子量抗原分子量抗原分子量=抗体分子量抗体分子量抗原分子量抗原分子量 抗体分子量抗体分子量c.1%琼脂粉琼脂粉 封底封底 1万硫柳汞万硫柳汞水浴加热融化水浴加热融化实验步骤实验步骤琼脂平板制备琼脂平板制备 鸡群马立克氏病感染情况的监测通常采用琼脂扩散试验，检测对象包括：血清中马立克氏病病毒特异抗体或感染鸡羽髓中马立克氏病病毒抗原。其操作方法如下：1琼脂糖平板制备 用0.01M pH7.4的PBS配制1琼脂糖溶液，水浴加温充分溶化后，加入培养皿，制成厚度约23mm厚的琼脂糖凝胶板；置于室温下冷却凝固后，用7孔（梅花孔）打孔器准确打孔，加热
5、封底。实验步骤实验步骤 2检测血清抗体时，中央孔内滴加马立克氏病病毒标准琼扩抗原，周边孔滴加待检血清，但至少一孔加阳性血清，抗原和血清的加入量以加满而不溢出为度。样品加毕后，将琼脂平皿加盖后平放于加盖的湿盒内，37温箱中孵育824h，观察并记录结果。测定抗体效价时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血清最大稀释度为抗体效价。实验步骤实验步骤 3检测抗原时，中央孔加马立克氏病标准阳性血清，周边1、4孔加马立克氏病标准琼扩抗原，周边2、3、5、6孔加待检羽髓浸液，即在试管内加入12滴PBS然后将羽髓在其中挤压而成。加样后将琼脂平皿置湿盒内，于37温箱孵育，824h内观察结果。实验步骤实验步骤 1、切勿剧
6、烈振荡融化后的琼脂糖，防止气泡的出现。2、反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假 阴性、不出现或不清楚。3、加样时，注意不要产生气泡，以加满为度。4、每加完不同的样后要更换枪头，以免造成污染。注意事项注意事项实验步骤实验步骤抗原检测抗原检测Ab+Ag+32Ag+65检测检测羽髓抗原羽髓抗原2，3，5，6孔分别孔分别加入倍比稀释的加入倍比稀释的待检羽髓浸液待检羽髓浸液Ag+432165检测检测待检血清待检血清15孔分别加入倍比稀释的孔分别加入倍比稀释的待测效待测效价的血清，价的血清，6孔加孔加PBS抗体检测抗体检测 当被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已知抗原孔的沉淀线互相
7、融合时判为阳性；不出现沉淀线者判为阴性 结果判定结果判定 已知抗原与阳性血清之间所产生的沉淀线末端弯向被检样品孔内侧时，则该被检样品判为弱阳性。结果判定结果判定 Ag+Ag+Ab+待检血清 被检材料可能出现两条以上沉淀线，其中一条与已知抗原和阳性血清的沉淀线融合者判为阳性。当抗原存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度，比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。标准琼扩抗原标准琼扩抗原待检羽髓浸液待检羽髓浸液 结果判定结果判定 此沉淀带的基本形式分为3种。试分析在抗原和抗体分子量相同时，以下六种情况中抗原和抗体的浓度差异以及在凝胶中的扩散率大小（用、表示）A B C D E F AgAb
