1、分光光度计的使用分光光度计的使用 分光光度计：指能够从含有各种波长的混合分光光度计：指能够从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器。仪器。紫外分光光度计紫外分光光度计:200:200400nm400nm 可见光分光光度计可见光分光光度计:400:400760nm760nm 红外分光光度计红外分光光度计:760nm:760nm 全波段分光光度计全波段分光光度计 掌握掌握722722分光光度计的正确使用方法分光光度计的正确使用方法 熟悉分光光度计的原理、结构和波长检测方熟悉分光光度计的原理、结构和波长检测方法法 了解紫外分光光度计和可见分
2、光光度计物质了解紫外分光光度计和可见分光光度计物质检测的特点检测的特点目目 的的 要要 求求准直准直透镜透镜放大器放大器光源光源反射镜反射镜狭缝狭缝保护保护玻璃玻璃棱镜棱镜比色池比色池聚光透镜聚光透镜光电管暗盒光电管暗盒光电管光电管光光门门聚光聚光透镜透镜仪器光学系统仪器光学系统 光源：光源：可见光区：钨灯，卤钨灯可见光区：钨灯，卤钨灯(320(320 2500 nm)2500 nm)紫外区：紫外区：氢灯，氘灯氢灯，氘灯(180(180 375 nm)375 nm)光源光源 单色器单色器 吸收池吸收池 检测器检测器 显示系统显示系统仪器的基本结构仪器的基本结构 单色器：单色器：光源的光由此进入
3、单色器；：光源的光由此进入单色器；：将复合光分解成单色光，棱镜或光栅；：将复合光分解成单色光，棱镜或光栅；透镜或反射镜使入射光成为平行光束；透镜或反射镜使入射光成为平行光束；：单色光聚焦至出射狭缝；：单色光聚焦至出射狭缝；依据不同波长光通过棱镜时折射率不同依据不同波长光通过棱镜时折射率不同 玻璃玻璃350 350 3200 nm,3200 nm,石英石英185 185 4000 nm4000 nm入射狭缝入射狭缝 准直镜准直镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜 出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 500400棱镜单色器的结构原理示意图棱镜单色器的结构原理示意图在镀铝的玻璃表面刻有
4、数量很大的在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等等宽度等间距宽度等间距条痕条痕(600(600、12001200、24002400条条/mm)/mm)。M M1 1M M2 2出出射射狭狭缝缝光屏光屏透透镜镜平面透平面透射光栅射光栅光栅衍射示意图光栅衍射示意图原理：原理：利用光通过光栅利用光通过光栅时发生衍射和干时发生衍射和干涉现象而分光涉现象而分光.光栅光栅:波长范围宽波长范围宽,色散均匀色散均匀,分辨性能好分辨性能好,使用方便使用方便 吸收池：吸收池：玻璃玻璃(G)(G)能吸收能吸收UVUV光，光，仅适用于可见光区。仅适用于可见光区。石英石英(Q)(Q)吸收紫外光，吸收紫外光，适用于紫外和可见光
5、区。适用于紫外和可见光区。要求：匹配性（对光的吸收要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）。和反射应一致）。直流放大器直流放大器h 光敏阴极光敏阴极阳极阳极90V直流电源直流电源高电阻高电阻光电管检测示意图光电管检测示意图把光信号转换为电信号的装置，又称为光电转换把光信号转换为电信号的装置，又称为光电转换器（光电管、光电倍增管、光电二极管阵列器（光电管、光电倍增管、光电二极管阵列）。）。紫外紫外-可见分光光度计，是依据物质在不同可见分光光度计，是依据物质在不同光区吸收光谱的特性，根据光吸收定律即朗伯光区吸收光谱的特性，根据光吸收定律即朗伯-比尔定律，对物质进行定性鉴别和定量分析的比尔定律，对物质
6、进行定性鉴别和定量分析的仪器。仪器。A=kLcA A 吸光度吸光度(absorbance)(absorbance)L L 介质厚度介质厚度(length/cm)(length/cm)c c 浓度浓度(concentration)(concentration)K K 吸光系数吸光系数(absorptivity)(absorptivity)工作原理工作原理朗伯朗伯-比尔定律的适用条件：比尔定律的适用条件：入射光为单色光。入射光为单色光。溶液是稀溶液。溶液是稀溶液。适用于分子吸收和原子吸收。适用于分子吸收和原子吸收。:表达了物质对单色光的吸收程表达了物质对单色光的吸收程度与溶液浓度和液层厚度之间的定
7、量关系度与溶液浓度和液层厚度之间的定量关系.根据下述公式求得浓度根据下述公式求得浓度.测定测定管的吸光度值测定测定管的吸光度值找出该溶液的找出该溶液的 测定方法（摩尔吸光系数法）测定方法（摩尔吸光系数法）c=A/kL根据下述公式求得浓度根据下述公式求得浓度.同时测定标准管和测定管的吸光度值同时测定标准管和测定管的吸光度值找出该溶液的找出该溶液的 测定方法（标准管法）测定方法（标准管法）标准管的吸光度值标准管的吸光度值标准管的浓度标准管的浓度值值测定管的吸光度值测定管的吸光度值测定管的浓度值测定管的浓度值=0 1 2 3 0 1 2 3 4 4 C C(mg/ml)(mg/ml)A A 。*0.
8、80.80.60.60.40.40.20.20 0求得浓度求得浓度.做做工作曲线工作曲线.找出该溶液的找出该溶液的 测定方法（标准曲线法）测定方法（标准曲线法）722722分光光度计分光光度计 镨钕滤光片镨钕滤光片 实实 验验 器器 材材一、一、722722分光光度计的正确使用分光光度计的正确使用1.1.接通电源，打开仪器开关，预热接通电源，打开仪器开关，预热25min25min；2.2.打开样品室盖，将装参比溶液的比色皿放入打开样品室盖，将装参比溶液的比色皿放入比色皿架中比色皿架中,在测定波长将透射比在测定波长将透射比T T调到调到0%0%。关闭样品室盖，将透射比关闭样品室盖，将透射比T T
9、调到调到100%100%。操作步骤操作步骤3.3.重复重复3 3次打开、合上比色皿暗盒盖，反复调整次打开、合上比色皿暗盒盖，反复调整透射率透射率“0 0”和和“100100”，选择，选择A A测量方式。测量方式。4.4.将装有待测溶液的比色皿放入比色皿架中将装有待测溶液的比色皿放入比色皿架中,盖盖上比色盖暗盒，推入光路，读出吸光度。上比色盖暗盒，推入光路，读出吸光度。5.5.每次改变一次波长进行测量时，必须重新校正每次改变一次波长进行测量时，必须重新校正透光率透光率“0 0”和和“100100”.波长检测时使用镨钕滤光片来做标准。本波长检测时使用镨钕滤光片来做标准。本仪器镨钕滤光片是粉红色的，
10、实际波长为仪器镨钕滤光片是粉红色的，实际波长为529nm529nm、741nm741nm。将镨钕滤光片装到仪器的比色。将镨钕滤光片装到仪器的比色皿座中，空白为空气，待仪器稳定后进行以下皿座中，空白为空气，待仪器稳定后进行以下步骤：步骤：操作步骤操作步骤一、一、722722分光光度计波长检测分光光度计波长检测 1.1.打开比色皿盖子，调节透射比为打开比色皿盖子，调节透射比为“0 0”；2.2.将比色皿盖合上，使光电管受光，将透射比调将比色皿盖合上，使光电管受光，将透射比调 “100100”，反复反复3 3次调整次调整透光率透光率“0 0”和和 “100100”；3.3.将镨钕滤光片置于光路中，然
11、后根据表将镨钕滤光片置于光路中，然后根据表12-112-1、12-212-2完成测试；完成测试；4.4.每变一次波长必须重新校对每变一次波长必须重新校对“0 0”和和 “100100”，找出找出 透射比最小的波长即最大吸收波长。透射比最小的波长即最大吸收波长。1 1开机预热后才能使用开机预热后才能使用 ；2 2测试过程每次改变波长必须调测试过程每次改变波长必须调0 0和调和调100%100%；3.3.镨钕滤光片要保持干净；镨钕滤光片要保持干净；4.4.镨钕滤光片摆放好位置，保证光垂直通镨钕滤光片摆放好位置，保证光垂直通过。过。注注 意意 事事 项项 怎样校准波长？在怎样校准波长？在529nm529nm左右左右分别测出透射比是为了说明什么？分别测出透射比是为了说明什么？
