1、 减毒活疫苗减毒活疫苗1第一个用于人体的减毒活疫苗第一个用于人体的减毒活疫苗 1902年，从患结核病的牛乳房里分离得到年，从患结核病的牛乳房里分离得到一株牛型结核杆菌一株牛型结核杆菌；Calmette和和Guerin将此菌接种于将此菌接种于5%甘油胆汁甘油胆汁马铃薯培养基，马铃薯培养基，进行传代培养；进行传代培养；每隔每隔2-3周传代一次，经过周传代一次，经过230余代，历时余代，历时13年，终于制备出年，终于制备出减毒活疫苗减毒活疫苗卡介苗卡介苗(bacille Calmette-Guerin，BCG)。2第一节第一节 减毒活疫苗的原理与减毒活疫苗的原理与现状现状3一、一、减毒活疫苗的原理减
2、毒活疫苗的原理 减毒活疫苗减毒活疫苗 模拟模拟自然发生的感染后免疫过程。自然发生的感染后免疫过程。全身性感染全身性感染（病毒性病毒性/细菌性感染细菌性感染）临床感染临床感染或或亚临床感染亚临床感染(隐性感染隐性感染)持久性的持久性的免疫力免疫力临临床床现现象象41.定定 义义减毒活疫苗减毒活疫苗 通过不同的方法手段通过不同的方法手段 使使病原体的病原体的毒力毒力(致病性致病性)减弱减弱或或丧失丧失后后 获得的一种获得的一种 的疫苗制品的疫苗制品。由完整的微生物组成由完整的微生物组成52.减毒活疫苗减毒活疫苗的特点的特点 能能引发机体感染引发机体感染、但但不发生临床症状不发生临床症状 其免疫原性
3、其免疫原性足以足以能刺激机体的免疫系统能刺激机体的免疫系统、产生针对该病原体的免疫反应产生针对该病原体的免疫反应 在以后暴露于该病原体时，能在以后暴露于该病原体时，能保护机体保护机体不不患病或减轻临床过程。患病或减轻临床过程。6二、二、减毒活疫苗的使用减毒活疫苗的使用和研究和研究现状现状1.使用现状使用现状 有的已完成历史任务而退役有的已完成历史任务而退役 牛痘苗牛痘苗 有的已经并正在继续发挥其良好的防病作用有的已经并正在继续发挥其良好的防病作用 脊髓灰质炎、麻疹、甲型肝炎减毒活疫苗脊髓灰质炎、麻疹、甲型肝炎减毒活疫苗 有的在长期使用后又面临新的挑战有的在长期使用后又面临新的挑战 卡介苗卡介苗
4、 有的在我国使用时间不长，尚待积累功绩有的在我国使用时间不长，尚待积累功绩 水痘减毒活疫苗水痘减毒活疫苗72.2.传统减毒活疫苗的局限与不足传统减毒活疫苗的局限与不足 无法无法或或很难很难用传统技术研制疫苗用传统技术研制疫苗 不能培养或难以培养的病原体不能培养或难以培养的病原体 有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体 保护效果差、副反应大或使用不方便保护效果差、副反应大或使用不方便解决办法：解决办法：使用基因工程技术对其进使用基因工程技术对其进行改造或取而代之行改造或取而代之83.国内外使用的减毒活疫苗一览表国内外使用的减毒活疫苗一览表分类分类名称名称接种途径接种
5、途径国内使用国内使用国外使用国外使用病毒疫苗病毒疫苗甲型肝炎减毒活疫苗甲型肝炎减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十麻疹减毒活疫苗麻疹减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十十十腮腺炎减毒活疫苗腮腺炎减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十十十黄热减毒活疫苗黄热减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十十十脊髓灰质炎减毒活疫苗脊髓灰质炎减毒活疫苗口服口服十十十十乙型脑炎活疫苗乙型脑炎活疫苗皮下注射皮下注射十十风疹减毒活疫苗风疹减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十十十水痘减毒活疫苗水痘减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十十十登革热减毒活疫苗登革热减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十流感减毒活疫苗流感减毒活疫苗喷雾喷雾十十腺病毒减毒活疫苗腺病毒减毒活疫苗
6、肌内注射肌内注射十十细菌疫苗细菌疫苗炭疽减毒活疫苗炭疽减毒活疫苗皮上划痕皮上划痕十十十十布氏菌减毒活疫苗布氏菌减毒活疫苗皮上划痕皮上划痕十十十十卡介苗卡介苗皮内注射皮内注射十十十十伤寒减毒活疫苗伤寒减毒活疫苗口服口服十十霍乱减毒活疫苗霍乱减毒活疫苗口服口服十十鼠疫减毒活疫苗鼠疫减毒活疫苗皮上划痕皮上划痕 十十十十9三、三、减毒活疫苗的研究策略减毒活疫苗的研究策略 选择标准的疫苗株选择标准的疫苗株;新的新的抗原结构抗原结构能诱导能诱导广泛广泛的中和抗体的中和抗体;诱导在诱导在多多样主要组织相容复合体样主要组织相容复合体(major histocompatibility complex，MHC)背
7、景人群背景人群的多位点的的多位点的CTL应答应答;直接和间接地诱导直接和间接地诱导传播途径传播途径的黏膜免疫应的黏膜免疫应答答101.病原体病原体的的培养培养 如何如何减毒减毒？体外细胞培养体外细胞培养低温培养传代以产生冷适应株低温培养传代以产生冷适应株在特定温度下选育温度敏感株在特定温度下选育温度敏感株 动物体内分段或连续传代动物体内分段或连续传代111.病原体病原体的的培养培养 如何如何筛选筛选？蚀斑法挑选蚀斑法挑选（产生产生细胞病变效应细胞病变效应的病毒的病毒）同一病毒同一病毒：蚀斑较大的蚀斑较大的：毒力相对强毒力相对强 蚀斑小的蚀斑小的：毒力较弱毒力较弱 其减毒性在人体中其减毒性在人体
8、中必须必须是是稳定稳定的的 减毒减毒与与免疫原性之间免疫原性之间的的平衡平衡 减毒适度减毒适度：保证人体使用安全保证人体使用安全 良好免疫原性良好免疫原性：足以诱生特异性免疫应答足以诱生特异性免疫应答致细胞病变效应致细胞病变效应(cytopathogenic effect，CPE)培养的单层细胞培养的单层细胞、接种病毒后接种病毒后导致细胞的萎缩、脱落等病变的导致细胞的萎缩、脱落等病变的现象。现象。12第一代减毒变异株第一代减毒变异株12-1-7原代地鼠肾细胞原代地鼠肾细胞(PHK)连续传代连续传代：100代代SA14SA14-14-2/PDK例：例：乙型脑炎减毒活疫苗乙型脑炎减毒活疫苗SA14
9、-14-2株株乳鼠体乳鼠体内传代内传代SA14-14-2/PHK蚀斑克隆蚀斑克隆病毒株病毒株SA14-5-3PHK细胞细胞性状不稳定性状不稳定神经毒力返祖神经毒力返祖减毒过度，免减毒过度，免疫原性不足疫原性不足PHK细胞细胞恢复一定的免恢复一定的免疫原性疫原性蚀斑克隆蚀斑克隆原代狗肾细原代狗肾细胞胞(PDK)传传9代代减毒减毒与与免疫原免疫原性性达到平衡达到平衡132.减毒的策略减毒的策略传统传统方法：方法：细胞传代细胞传代 动物传代动物传代 蚀斑挑选蚀斑挑选 化学诱变化学诱变 营养突变等营养突变等现代方法：现代方法：应用基因工程技术应用基因工程技术，删除致病基因删除致病基因 病原体病原体减毒
10、更彻底减毒更彻底 遗传性能遗传性能更稳定更稳定 安全性和免疫原性安全性和免疫原性更平更平衡。衡。14四、四、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略1.基因缺基因缺失失活疫苗活疫苗(gene deleted live vaccine)将将与毒力有关的基因或基因片段与毒力有关的基因或基因片段删除，从删除，从而获得缺失突变毒株而获得缺失突变毒株优点优点：突变性状明确突变性状明确 稳定、不易发生毒力返祖稳定、不易发生毒力返祖15四、四、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略1.基因缺基因缺失失活疫苗活疫苗(gene deleted live vaccine)DNA病
11、毒病毒 去除毒力基因的去除毒力基因的腺病毒腺病毒，可用作减毒活疫苗株，可用作减毒活疫苗株，也可作为载体疫苗的病毒载体。，也可作为载体疫苗的病毒载体。RNA病毒病毒16四、四、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略2.遗传重组疫苗遗传重组疫苗(genetic recombinant vaccine)通过强通过强、弱毒株共同感染细胞弱毒株共同感染细胞，二者，二者之间之间进行基因片段的交换进行基因片段的交换，而获得的减毒活疫而获得的减毒活疫苗。苗。特点：特点：很大的很大的盲目性盲目性，致使筛选特定的遗传重组病毒比，致使筛选特定的遗传重组病毒比较困难。较困难。17四、四、基因工程减毒
12、活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略2.遗传重组疫苗遗传重组疫苗(genetic recombinant vaccine)反向遗传技术反向遗传技术的发展，可以对分节段的的发展，可以对分节段的RNA病毒进行病毒进行定向重配定向重配，提高重配效率提高重配效率。研究研究热点：热点：甲型流感病毒、轮状病毒和汉坦病毒等减毒活甲型流感病毒、轮状病毒和汉坦病毒等减毒活疫苗株。疫苗株。183.载体疫苗载体疫苗(vector vaccine)利用非致病微生物作为载体利用非致病微生物作为载体、递呈外源抗递呈外源抗原的一种减毒疫苗原的一种减毒疫苗。将将外源抗原外源抗原的的基因插入到载体微生物基因基因插入到载
13、体微生物基因组中，用组中，用这种这种表达外源抗原的微生物作为表达外源抗原的微生物作为疫苗疫苗。四、四、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略19四、四、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略 病毒载体疫苗病毒载体疫苗 痘苗病毒痘苗病毒 腺病毒腺病毒 麻麻疹疹病毒病毒 脊髓灰质炎病毒等脊髓灰质炎病毒等 细菌载体疫苗细菌载体疫苗 产单核细胞李斯特菌产单核细胞李斯特菌 沙门菌沙门菌 霍乱弧菌霍乱弧菌 志贺菌志贺菌 卡介苗卡介苗 小肠耶尔森菌小肠耶尔森菌 炭疽杆菌炭疽杆菌 戈登菌属戈登菌属 乳杆菌属乳杆菌属 葡萄球菌属等葡萄球菌属等载体疫苗载体疫苗(vector v
14、accine)成本低成本低适适于于群体免疫群体免疫20五、五、减毒活疫苗研究面临的问题减毒活疫苗研究面临的问题 1.安全性安全性 成功或比较成功的预防性疫苗成功或比较成功的预防性疫苗 牛痘苗、脊髓灰质炎、麻疹牛痘苗、脊髓灰质炎、麻疹、甲型肝炎、乙型甲型肝炎、乙型脑炎等减毒活疫苗脑炎等减毒活疫苗 不太成功的疫苗：不太成功的疫苗：卡介苗卡介苗 半个多世纪、半个多世纪、40余亿人群使用余亿人群使用 对肺结核的对肺结核的免疫保护效果免疫保护效果：差异甚大差异甚大(0-80%)迄今尚没有一个国家或地区有消灭结核的可能迄今尚没有一个国家或地区有消灭结核的可能性性改造研究改造研究是热点是热点21五、五、减毒
15、活疫苗研究面临的问题减毒活疫苗研究面临的问题 2.安全性和免疫原安全性和免疫原性之性之间的协调间的协调难题难题 Ty21a口服伤寒减毒活疫苗口服伤寒减毒活疫苗 最最成功成功的营养缺陷型突变的营养缺陷型突变营养缺陷型突变营养缺陷型突变人结核菌人结核菌H37Rv 亮氨酸缺陷株亮氨酸缺陷株残余毒力残余毒力指数过高指数过高22五、五、减毒活疫苗研究面临的问题减毒活疫苗研究面临的问题 2.安全性和免疫原安全性和免疫原性之性之间的协调间的协调难题难题霍乱减毒活疫苗霍乱减毒活疫苗：基因缺失株基因缺失株CVD112：保护率保护率：84%6名志愿者中名志愿者中：引起引起3人人轻度腹泻轻度腹泻 CVD-103 H
16、gR株株：对对不同人群不同人群诱导诱导 抗体应答悬殊抗体应答悬殊 免疫原性免疫原性不恒定不恒定23五、五、减毒活疫苗研究面临的问题减毒活疫苗研究面临的问题 3.载体疫苗载体疫苗研究中存在的问题研究中存在的问题载体微生物蛋白的过量表达载体微生物蛋白的过量表达，严重干扰欲表达抗，严重干扰欲表达抗原诱导机体免疫应答原诱导机体免疫应答;非复制型载体微生物非复制型载体微生物（如禽如禽痘痘病毒病毒）的）的减弱或消减弱或消失，失，导致导致目的目的抗原表达量降低抗原表达量降低，影响疫苗免疫原影响疫苗免疫原性性;目的抗原微生物和载体微生物目的抗原微生物和载体微生物感染途径感染途径不一定相不一定相同同，而致使目的
17、抗原不能经自然感染途径免疫，而致使目的抗原不能经自然感染途径免疫，从而影响免疫效果。从而影响免疫效果。24第二节第二节 减毒活疫苗设计与制备减毒活疫苗设计与制备的技术要求的技术要求25一、减毒活疫苗一、减毒活疫苗的的设计要求设计要求设计减毒活疫苗菌株或毒株设计减毒活疫苗菌株或毒株，要，要根据根据生物制生物制品的用途、使用范围、使用方式、生产过品的用途、使用范围、使用方式、生产过程和生产条件程和生产条件等因素来决定，设计时应等因素来决定，设计时应注注意以下问题：意以下问题：安全性安全性免疫原性免疫原性遗传稳定性遗传稳定性生产适应性生产适应性261.安全性安全性残余毒力残余毒力 残余毒力高残余毒力
18、高：免疫原性免疫原性：临床反应临床反应：残余毒力低残余毒力低：免疫原性免疫原性：临床反应临床反应：所选用的菌、毒种必须在减毒性能和免疫所选用的菌、毒种必须在减毒性能和免疫原性之间达到原性之间达到平衡平衡好好大大差差小小271.安全性安全性致癌性致癌性 菌、毒种及代谢菌、毒种及代谢物质物质：不应有致癌作用不应有致癌作用;传代细胞系传代细胞系：在在规定代次内使规定代次内使用，有效用，有效去去除细除细胞胞DNA，残余，残余DNA需需达达标标;诱变及筛选菌诱变及筛选菌/毒株毒株：不用致癌性的药物不用致癌性的药物;载体疫苗载体疫苗：载体是无毒或减毒载体是无毒或减毒的的外源基因插入时，外源基因插入时，不应
19、引起毒力的返不应引起毒力的返祖。祖。282.良好的免疫原性良好的免疫原性 能促使机体产生能促使机体产生：高效价的保护性抗体高效价的保护性抗体黏膜免疫黏膜免疫细胞介导免疫细胞介导免疫并具有良好的并具有良好的免疫持久性免疫持久性293.遗传稳定性遗传稳定性弱毒株弱毒株的来源？的来源？天然弱毒天然弱毒 采用物理、化学和生物学方法将毒力较强的菌毒采用物理、化学和生物学方法将毒力较强的菌毒株株诱变诱变为弱毒株为弱毒株 只有选择只有选择突变遗传性能稳定突变遗传性能稳定的菌毒株，才能最的菌毒株，才能最大限度地大限度地防止防止其使用过程中其使用过程中毒力返祖毒力返祖的可能。的可能。304.生产适应性生产适应性
20、 易于培养易于培养 便于规模化生产便于规模化生产 有利于生产有利于生产工艺流程工艺流程的可操作性和的可操作性和简化简化 有利于保证产品的有利于保证产品的产量和质量产量和质量。31二、减毒活疫苗制备技术要求二、减毒活疫苗制备技术要求 1.基本要求基本要求设施与生产质量管理设施与生产质量管理中国药品生产质量管理中国药品生产质量管理规范规范原、辅料原、辅料:中华人民共和国药典中华人民共和国药典、中国生物、中国生物制品主要原辅材料质控标准制品主要原辅材料质控标准纯化水和注射用水纯化水和注射用水：中华人民共和国药典中华人民共和国药典 生产用器具生产用器具:必须清洗干净必须清洗干净、灭菌处理。灭菌处理。生
21、产及检定用动物生产及检定用动物:鸡胚细胞的来源鸡群鸡胚细胞的来源鸡群：SPF级级提供肾脏的家兔、狲猴提供肾脏的家兔、狲猴：隔离检疫合格隔离检疫合格小鼠、地鼠、豚鼠小鼠、地鼠、豚鼠：清洁级清洁级32二、减毒活疫苗制备技术要求二、减毒活疫苗制备技术要求 2.菌、毒种菌、毒种 国家药品管理局国家药品管理局批准批准 由由国家药品检定机构国家药品检定机构或或国家药品管理局国家药品管理局所所委托的单位委托的单位保存、检定及分发。保存、检定及分发。33二、减毒活疫苗制备技术要求二、减毒活疫苗制备技术要求 菌、毒种菌、毒种的的三级管理三级管理：定期全面检定定期全面检定 原始种子批原始种子批 应验明其记录、历史
22、、来源和生物学特性。应验明其记录、历史、来源和生物学特性。主种子批主种子批 从原始种子批传出、扩增后冻干或深低温保存的。从原始种子批传出、扩增后冻干或深低温保存的。工作种子批工作种子批 从主种子批制备从主种子批制备，用于生产，用于生产。主种子批和工作种子批在主种子批和工作种子批在规定代次内规定代次内的生物学的生物学特性应与原始种子批一致特性应与原始种子批一致343.细菌性细菌性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求(1)培养基的制备培养基的制备 菌种用菌种用培养基培养基 疫苗生产用疫苗生产用培养基培养基 检定用检定用培养基等培养基等(2)菌种培养菌种培养不同细菌不同细菌，要求不同：，要求
23、不同：培养基培养基 培养温度培养温度 培养时间培养时间 菌落形态菌落形态、颜色等颜色等严格按照中国生物制品规程严格按照中国生物制品规程353.细菌性细菌性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求(3)原液制备原液制备 液体培养基液体培养基：收集菌膜，经洗涤、离心、压干收集菌膜，经洗涤、离心、压干等不同处理步骤后，加等不同处理步骤后，加 适量保护液制成所需浓适量保护液制成所需浓度的原液。度的原液。固体培养基固体培养基：将将菌苔刮入保护液，或用保护液菌苔刮入保护液，或用保护液洗下菌苔制备原液。洗下菌苔制备原液。(4)分装、包装。分装、包装。严格按照中国生物制品规程严格按照中国生物制品规程363
24、.细菌性细菌性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求(5)检定检定 对对菌种、原液、半成品和成品菌种、原液、半成品和成品进行检定进行检定 保证疫苗的保证疫苗的安全性和免疫原性安全性和免疫原性等质量标准等质量标准符合符合中国生物制品规程中国生物制品规程严格按照中国生物制品规程严格按照中国生物制品规程37检定检定什么？什么？纯菌试验纯菌试验:生长物做涂片镜检，不得有杂菌。生长物做涂片镜检，不得有杂菌。噬菌体特异性试验噬菌体特异性试验:特异噬菌体应能完全裂解待检细菌，培养后应特异噬菌体应能完全裂解待检细菌，培养后应无无细菌生长。细菌生长。菌落、菌形检查菌落、菌形检查:应具有典型的菌落特征应具有
25、典型的菌落特征 涂片镜检涂片镜检：培养典型形态培养典型形态 特殊染色法特殊染色法：形态学鉴别形态学鉴别38检定检定内容内容活菌数测定活菌数测定:一定温度一定温度、时间培后，单位体积的时间培后，单位体积的活活菌数菌数必须必须在规定范围内。在规定范围内。浓度测定浓度测定:按按中国细菌浊度标准中国细菌浊度标准测定浓度。测定浓度。毒力试验毒力试验:一定量的菌种培养物分别注射小白鼠或豚鼠，一定量的菌种培养物分别注射小白鼠或豚鼠，要求要求：实验动物存活实验动物存活 体重增加体重增加39检定检定内容内容效力或免疫力试验效力或免疫力试验:制备菌液，注射小鼠、豚鼠等实验动物制备菌液，注射小鼠、豚鼠等实验动物 一
26、般免疫两次一般免疫两次 末次免疫后末次免疫后，用用野型株野型株进行攻击进行攻击 一般应保护一般应保护50%80%的动物存活。的动物存活。各制品的合格指标不同，应按规程进行判定。各制品的合格指标不同，应按规程进行判定。404.病毒性病毒性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求(1)生产细胞生产细胞 适用于病毒性疫苗适用于病毒性疫苗生产生产/检定检定的细胞的细胞有：有：二倍体细胞二倍体细胞 传代细胞传代细胞 原代细胞原代细胞41 人二倍体细胞株人二倍体细胞株 来源来源:正常人胎肺或其他组织正常人胎肺或其他组织 需进行全面需进行全面检定检定 建立的细胞株建立的细胞株的的审批审批：新生物制品审批
27、办法新生物制品审批办法 建株资料建株资料：所用胎儿的所用胎儿的胎龄胎龄和和性别性别，终止，终止妊娠妊娠的原因的原因;胎儿胎儿父母父母的年龄、职业及健康状况，胎儿父及母的年龄、职业及健康状况，胎儿父及母系系三代三代应无明显遗传缺陷疾病历史应无明显遗传缺陷疾病历史;原始原始组织种类组织种类，原始细胞培养的细胞数量与生长，原始细胞培养的细胞数量与生长情况情况;细胞培养细胞培养的方法、历史、生长特征和寿命的世代的方法、历史、生长特征和寿命的世代数数;细胞的细胞的生长液生长液成分。成分。42人二倍体细胞株人二倍体细胞株的的建株建株 染色体检查染色体检查：每每8-12世代作一次世代作一次 至少应随机取至少
28、应随机取1000个分裂中期细胞，进行个分裂中期细胞，进行染色体染色体数目、形态和结构检查数目、形态和结构检查;至少选择至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，做出个分裂中期细胞进行显微照相，做出核型分析核型分析;粗数粗数500个分裂中期细胞，检查个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率多倍体的发生率;每次染色体检查每次染色体检查标本片应长期保存标本片应长期保存，以备复查，以备复查;细菌、真菌、支原体及病毒检查细菌、真菌、支原体及病毒检查 致肿瘤性检查致肿瘤性检查43传代细胞系传代细胞系 由人或动物肿瘤组织或正常组织传代转化由人或动物肿瘤组织或正常组织传代转化而来，可悬浮培养或用载体培养，能大规而来，
29、可悬浮培养或用载体培养，能大规模生产模生产;可无限传代可无限传代，但到一定代次后，致，但到一定代次后，致肿瘤性肿瘤性会增强会增强，所以对生产用的传代细胞系应进，所以对生产用的传代细胞系应进行严格检查。行严格检查。44传代细胞系传代细胞系的相关资料的相关资料 需得到国家药品监督管理局的批准，并提需得到国家药品监督管理局的批准，并提供供有关资料有关资料:a.细胞系来源，细胞系来源，供者供者的种属、年龄、性别和健的种属、年龄、性别和健康状况的描述康状况的描述;b.细胞传代培养方法、生长特征、传代数，用细胞传代培养方法、生长特征、传代数，用于生产的最高限制代数，所用生长液以及传于生产的最高限制代数，所
30、用生长液以及传代史等描述代史等描述;c.初步确定可能存在的外源因子检查结果初步确定可能存在的外源因子检查结果;45传代细胞系传代细胞系的相关资料的相关资料d.细胞系的生长类型及形态学特征、细胞鉴别细胞系的生长类型及形态学特征、细胞鉴别的特殊标志、遗传特征的特殊标志、遗传特征(如如HLA、DNA指纹图指纹图谱谱);e.提供细胞系用于预定目的的资料提供细胞系用于预定目的的资料;f.细胞系的生产用限制代次和超过该代次细胞系的生产用限制代次和超过该代次10代以代以上的生物学特征，要做出说明。上的生物学特征，要做出说明。46原代细胞原代细胞 来源来源：猴肾、鸡胚、地鼠肾、沙鼠肾、家兔肾、狗肾和猴肾、鸡胚
31、、地鼠肾、沙鼠肾、家兔肾、狗肾和鹌鹑鹌鹑胚，以及其他组织等。胚，以及其他组织等。正常组织正常组织经经消化消化后、后、进行进行细胞细胞培养。培养。只限于只限于原始或少数几代原始或少数几代(一般在一般在5代代)以内使用，以以内使用，以生物学性状不发生改变生物学性状不发生改变为原则。为原则。47原代细胞原代细胞的使用注意事项的使用注意事项a.在接种病毒或用于生产前，应进行在接种病毒或用于生产前，应进行外观和镜下检外观和镜下检查查，应无任何可疑、异常和病变，应无任何可疑、异常和病变。b.每批细胞培养留取每批细胞培养留取5%-10%（至少留有至少留有500ml）悬悬液，不接种病毒，至少观察液，不接种病毒
32、，至少观察14天，并做天，并做细菌、真细菌、真菌和支原体检查菌和支原体检查。48原代细胞原代细胞的使用注意事项的使用注意事项c.原代细胞来源的原代细胞来源的动物必须健康动物必须健康，尽量使用，尽量使用无无特定特定病原体病原体(SPF)动物动物d.对拟订用于生产的动物种群，应定期检查有无对拟订用于生产的动物种群，应定期检查有无相相关病毒抗体关病毒抗体，应严格筛选。，应严格筛选。e.用于细胞制备的用于细胞制备的动物剖检动物剖检应正常，取留的器官组应正常，取留的器官组织亦应正常，如有异常，不能用于制备细胞。织亦应正常，如有异常，不能用于制备细胞。494.病毒性病毒性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制
33、备技术要求(2)生产细胞的三级管理生产细胞的三级管理 原始细胞库原始细胞库 通过检定通过检定证明证明（适合于生物制品生产和检适合于生物制品生产和检定定）的）的原始细胞群体原始细胞群体，按一定量均匀分装，按一定量均匀分装于安瓿，于液氮或于安瓿，于液氮或-100以下以下冻存备用冻存备用。504.病毒性病毒性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求(2)生产细胞的三级管理生产细胞的三级管理 主细胞库主细胞库 取原始细胞种子，通过细胞传代，增殖到一定取原始细胞种子，通过细胞传代，增殖到一定数量，将数量，将所有的细胞均匀混合成一批所有的细胞均匀混合成一批，定量分，定量分装于安瓶，于液氮或装于安瓶，于
34、液氮或-100以下冻存备用。以下冻存备用。目的：目的：主细胞库主细胞库的的细胞细胞通通过过全面检定全面检定后后，建立工建立工作细胞库作细胞库。514.病毒性病毒性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求(2)生产细胞的三级管理生产细胞的三级管理 工作细胞库工作细胞库 细胞由主细胞库传代扩增而来，冻存时细胞的传细胞由主细胞库传代扩增而来，冻存时细胞的传代水平需代水平需确保确保细胞复苏后细胞复苏后、传代增殖的细胞数量传代增殖的细胞数量能能满足生产一批或一个亚批产品满足生产一批或一个亚批产品。传代水平必须在该细胞用于生产限制传代水平必须在该细胞用于生产限制最高代次之内最高代次之内。524.病毒性
35、病毒性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求(2)生产细胞的三级管理生产细胞的三级管理 生产用细胞生产用细胞 取冻存的工作细胞库中一个或多个安瓶，取冻存的工作细胞库中一个或多个安瓶，混合混合后培养，后培养，传一定代次后供生产制品使用。传一定代次后供生产制品使用。传传代次代次不得超过不得超过该细胞可用于生产的该细胞可用于生产的最高限制最高限制代次代次。剩余的生产用剩余的生产用细胞，细胞，不再冻存不再冻存和和再用于生产再用于生产。534.病毒性病毒性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求(2)生产细胞的三级管理生产细胞的三级管理 体外培养细胞龄计算体外培养细胞龄计算 一定稀释倍数进行传
36、代，每传一次为一代一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代 根据根据每个细胞系的每个细胞系的实践经验数据实践经验数据，确定确定生产使生产使用细胞最后用细胞最后限制代次限制代次 生产用细胞龄限制在生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的细胞寿命期限的2/3以内以内。544.病毒性病毒性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求(3)生产程序生产程序 细胞培养细胞培养 离体细胞离体细胞的的病毒敏感谱广病毒敏感谱广而而易被病毒感染易被病毒感染，可，可提供大面积微生物繁殖的基质以提供大面积微生物繁殖的基质以保证产量保证产量。在生产过程中在生产过程中：不得使用青霉素不得使用青霉素或其他或其他-内酰内酰胺胺类抗生素
37、类抗生素55(3)生产程序生产程序病毒培养病毒培养 将适量病毒接种到细胞中将适量病毒接种到细胞中（感染复制数感染复制数），），在在合适的温度合适的温度及及时间时间内培养病毒内培养病毒 致细胞病变致细胞病变(CPE）病毒病毒 脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒 可可参考参考CPE程度程度在培养限定时间内终止培养在培养限定时间内终止培养;不产生细胞病变的病毒不产生细胞病变的病毒 甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒：在规定培养时间内终止培养。在规定培养时间内终止培养。4.病毒性病毒性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求56(3)生产程序生产程序病毒收获及释放病毒收获及释放 经一定培养时间
38、达经一定培养时间达病毒的增殖高峰期病毒的增殖高峰期，即应终，即应终止培养收获病毒止培养收获病毒；用研磨、冻融、超声波等处理以用研磨、冻融、超声波等处理以释放病毒释放病毒。半成品制备、糖丸加工、分装、包装半成品制备、糖丸加工、分装、包装 按规程进行。按规程进行。57(4)检检 定定病毒病毒的的鉴别试验鉴别试验 用一定量的病毒用一定量的病毒特异性高价血清特异性高价血清或有中和抗体特或有中和抗体特性的单克隆抗体，与性的单克隆抗体，与一定量的病毒一定量的病毒混合混合，置，置37中和一定时间后接种细胞培养，以最适温度培养中和一定时间后接种细胞培养，以最适温度培养一定时间后判定结果一定时间后判定结果：病毒
39、应完全被中和病毒应完全被中和蚀斑法蚀斑法、病变法病变法、ELISA法法个别制品也用个别制品也用小鼠脑内接种小鼠脑内接种来来判定结果。判定结果。58病毒病毒的的鉴别试验鉴别试验-蚀斑法蚀斑法病毒病毒特异性高价血清特异性高价血清有中和抗体特性的单有中和抗体特性的单克隆抗体克隆抗体接种接种细胞细胞病病毒毒蚀斑蚀斑细胞细胞接种接种培养培养不产生不产生蚀斑蚀斑59(4)检检 定定无无菌试验菌试验 按生物制品无菌试验规程进行。按生物制品无菌试验规程进行。病毒滴定病毒滴定 样品作样品作系列稀释系列稀释，至少取，至少取3个稀释度分别接种个稀释度分别接种细胞，在最适温度培养一定时间判定结果。细胞，在最适温度培养
40、一定时间判定结果。蚀斑法、病变法或蚀斑法、病变法或ELISA法以及动物试验法以及动物试验60(4)检检 定定外源因子检查外源因子检查病毒外源因子病毒外源因子对照细胞外源因子对照细胞外源因子 每批每批生产用细胞生产用细胞应留取一定量作为应留取一定量作为对照细对照细胞胞（不接种病毒不接种病毒），与接种病毒的细胞用，与接种病毒的细胞用相同的细胞维持液相同的细胞维持液，在相同条件下培养后，在相同条件下培养后进行外源因子检查进行外源因子检查61(4)检检 定定免疫原性检查免疫原性检查 用用主种子批主种子批制成制成疫苗疫苗 常规常规接种接种易感者易感者 检测抗体：检测抗体：免疫前和免疫后免疫前和免疫后4-
41、6周周 阳转率阳转率：不低于规程要求不低于规程要求 人数人数：一般一般不少于不少于30人人。个别制品个别制品：也可以小鼠免疫、攻击试验检也可以小鼠免疫、攻击试验检查其免疫原性。查其免疫原性。62(4)检检 定定 热稳定性试验热稳定性试验疫苗成品在疫苗成品在37放一定时间后放一定时间后，测其，测其病毒滴度病毒滴度，其病毒滴度下降不得大于规程规定。其病毒滴度下降不得大于规程规定。63第第三三节节 减毒活疫苗的减毒活疫苗的综合评价综合评价 64一、减毒活疫苗的优缺点 优点：优点：诱导诱导体液免疫体液免疫和和细胞免疫细胞免疫两种免疫反应两种免疫反应 有的制品有的制品：通过自然感染途径接种，通过自然感染
42、途径接种，还还可以诱可以诱导导出出黏膜免疫黏膜免疫，使机体获得较广泛的免疫保护。使机体获得较广泛的免疫保护。使用的是活的微生物，可在机体内使用的是活的微生物，可在机体内长时间长时间起作用起作用、而而诱导较强的免疫反应诱导较强的免疫反应。活的微生物有再增殖的特性，理论上活的微生物有再增殖的特性，理论上只需只需接种一次接种一次，即可以达到满意的免疫效果。，即可以达到满意的免疫效果。65一、减毒活疫苗的优缺点 优点：优点：可能引起水平传播，扩大免疫效果，增强可能引起水平传播，扩大免疫效果，增强群体免疫屏障群体免疫屏障；无无需添加佐剂需添加佐剂；生产工艺一般不需要浓缩纯化生产工艺一般不需要浓缩纯化；价
43、格低廉。价格低廉。66一、减毒活疫苗的优缺点 缺点：缺点：一般减毒活疫苗均保留一定一般减毒活疫苗均保留一定残余毒力残余毒力，对，对一些个体一些个体（如如免疫缺陷者免疫缺陷者）可能可能诱发严重诱发严重疾病疾病。由于种种原因由于种种原因（如基因修饰等如基因修饰等），减毒活，减毒活疫苗有可能出现疫苗有可能出现毒力返祖毒力返祖现象。现象。是活微生物制剂，可能造成环境污染是活微生物制剂，可能造成环境污染、而而引发交叉感染等。引发交叉感染等。67一、减毒活疫苗的优缺点 缺点：缺点：缺损颗粒可能干扰疫苗的免疫效果。缺损颗粒可能干扰疫苗的免疫效果。产品的分析评估较为困难。产品的分析评估较为困难。保存、运输等条
44、件要求较高保存、运输等条件要求较高，如需冷链等。如需冷链等。68二、减毒活疫苗二、减毒活疫苗使用策略使用策略的评估的评估 1.免疫程序免疫程序 理论上理论上:活微生物在体内的再增殖特性活微生物在体内的再增殖特性：单剂免疫方案单剂免疫方案 实际实际上：上：单剂免疫单剂免疫：往往达不到理想保护效果往往达不到理想保护效果 因为：因为：传统减毒活疫苗往往传统减毒活疫苗往往减毒减毒又又减减免疫原性免疫原性 新型疫苗新型疫苗（非复制型微生物载体疫苗非复制型微生物载体疫苗等）等）所表达的抗原量也往往偏低所表达的抗原量也往往偏低691.免疫程序免疫程序 脊髓灰质炎减毒活疫苗脊髓灰质炎减毒活疫苗（1960-）单
45、价、双价单价、双价、三价剂型三价剂型 1、2、3、4剂免疫方案剂免疫方案 目前方案：目前方案：三价疫苗三价疫苗4剂免疫剂免疫（1986）首次免疫首次免疫：2月龄月龄 间隔间隔4-6周周：再连续免疫再连续免疫2次次 4岁岁：加强免疫加强免疫1次。次。70脊髓灰质炎减毒活疫苗脊髓灰质炎减毒活疫苗不同免疫程序不同免疫程序比较比较三价疫苗单剂免疫三价疫苗单剂免疫三价疫苗三价疫苗4剂免疫剂免疫抗体阳转率抗体阳转率70%-90%95%-100%中和抗体水平中和抗体水平+本疫苗已使我国本土消灭了由野型株引起的脊髓灰质炎本疫苗已使我国本土消灭了由野型株引起的脊髓灰质炎71甲型肝炎减毒活疫苗甲型肝炎减毒活疫苗
46、免疫效果免疫效果比较比较:诱导的抗体反应诱导的抗体反应与剂量正相关与剂量正相关 两针免疫接种方案两针免疫接种方案：受到日益广泛的受到日益广泛的重视重视和研讨。和研讨。第一针免疫第一针免疫后后4-8周周加强免疫加强免疫抗体阳转率抗体阳转率80%-100%95%-100%抗体滴度抗体滴度偏低偏低提高提高抗体持续时间延长抗体持续时间延长721.免疫程序免疫程序 应根据对疫苗保护效果及其持应根据对疫苗保护效果及其持久性的要求来久性的要求来制订并完善制订并完善732.免疫途径免疫途径 自然感染自然感染：绝大部分病原体通过绝大部分病原体通过黏膜黏膜入侵机体入侵机体 减毒活疫苗的免疫接种减毒活疫苗的免疫接种
47、：大多数采用大多数采用非肠道途径非肠道途径(如皮下注射、皮上划痕如皮下注射、皮上划痕)74非肠道途径非肠道途径免疫接种免疫接种途径的途径的缺点缺点 免疫诱导免疫诱导位点不定向位点不定向 产生的免疫反应仅为系统免疫产生的免疫反应仅为系统免疫、缺乏局部缺乏局部应答应答;免疫接种人员需要培训免疫接种人员需要培训，需使用接种器材，需使用接种器材，不仅造成不仅造成给药成本较高给药成本较高，且有，且有潜在交叉污潜在交叉污染可能染可能;接种时引起的局部疼痛以及其后的局部反接种时引起的局部疼痛以及其后的局部反应往往应往往不易被免疫对象所接受不易被免疫对象所接受75自然感染途径自然感染途径免疫接种免疫接种 脊髓
48、灰质炎减毒活疫苗脊髓灰质炎减毒活疫苗（口服口服）取得了非常成功的个体和群体免疫保护效果。取得了非常成功的个体和群体免疫保护效果。黏膜途径免疫黏膜途径免疫：受到日益重视和深入研究受到日益重视和深入研究消化道消化道 呼吸道呼吸道 泌尿生殖道泌尿生殖道黏膜某处受抗原刺激的免疫黏膜某处受抗原刺激的免疫活性细胞会在活性细胞会在其他其他黏膜部黏膜部位产生相应的特异免疫反应位产生相应的特异免疫反应76黏膜免疫黏膜免疫的的优势优势:发挥黏膜发挥黏膜第一屏障作用第一屏障作用，阻止病原体入侵，阻止病原体入侵甚至在局部清除甚至在局部清除;诱导包括诱导包括局部局部和和系统应答系统应答在内的全面免疫在内的全面免疫保护效
49、果保护效果;免疫方便，副反应小，安全性好，易被免免疫方便，副反应小，安全性好，易被免疫对象接受疫对象接受;给药成本低，疫苗制备成本也低。给药成本低，疫苗制备成本也低。773.母体免疫母体免疫(maternal immunization)传统：传统：孕妇孕妇是是免疫接种的免疫接种的禁忌者禁忌者 近近20年年：“孕妇免疫孕妇免疫”新动向新动向 作用作用:提高妇女提高妇女怀孕期的健康水平怀孕期的健康水平（预防（预防急性传染病急性传染病)母体母体抗体抗体可通过胎盘、乳汁等垂直可通过胎盘、乳汁等垂直传递传递给胎儿给胎儿和新生儿，使其在出生后的一段时间具备抵抗和新生儿，使其在出生后的一段时间具备抵抗外来微
50、生物侵犯和预防疾病的能力。外来微生物侵犯和预防疾病的能力。78孕妇免疫孕妇免疫用疫苗用疫苗 十余种十余种疫苗疫苗试验试验：如破伤风类毒素，乙肝、如破伤风类毒素，乙肝、流感和脊髓灰质炎疫苗等。流感和脊髓灰质炎疫苗等。流感疫苗流感疫苗 母体母体：流感抗体升高流感抗体升高 新生儿新生儿：得到被动免疫保护得到被动免疫保护 美国疾病控制和预防中心推荐美国疾病控制和预防中心推荐：在流感高发季在流感高发季节，孕妇在节，孕妇在怀孕期第怀孕期第4个月以后个月以后可以使用。可以使用。79母体免疫需要母体免疫需要逐步、慎重逐步、慎重地开展地开展 有利的有利的母体免疫母体免疫：呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒(RSV)引
