1、酵母遗传医学知识酵母菌概况酵母菌概况 酵母菌是一类单细胞真菌，并非系统演化分类酵母菌是一类单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。的单元。目前已知有目前已知有10001000多种酵母，根据酵母菌产生孢多种酵母，根据酵母菌产生孢子子(子囊孢子和担孢子子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类：的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌子囊菌和担子菌；不形成孢子；不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌不完全真菌，或者叫，或者叫“假酵母假酵母”。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌主要的生长
2、环境是潮湿或液态环境，有些酵母菌菌主要的生长环境是潮湿或液态环境，有些酵母菌也会生存在生物体内。也会生存在生物体内。19961996年完成了酿酒酵母的全基因组测序，是真年完成了酿酒酵母的全基因组测序，是真核生物中第一个被测序的生物。核生物中第一个被测序的生物。2酵母遗传医学知识酵母作为模式生物的作用酵母作为模式生物的作用 酵母作为高等真核生物特别是人类基因组研究酵母作为高等真核生物特别是人类基因组研究的模式生物，其最直接的作用体现在生物信息学的模式生物，其最直接的作用体现在生物信息学领域。领域。当人们发现了一个功能未知的人类新基因时，当人们发现了一个功能未知的人类新基因时，可以迅速地到任何一个
3、酵母基因组数据库中检索可以迅速地到任何一个酵母基因组数据库中检索与之同源的功能已知的酵母基因，并获得其功能与之同源的功能已知的酵母基因，并获得其功能方面的相关信息，从而加快对该人类基因的功能方面的相关信息，从而加快对该人类基因的功能研究。研究。研究发现，有许多涉及遗传性疾病的基因均与研究发现，有许多涉及遗传性疾病的基因均与酵母基因具有很高的同源性，研究这些基因编码酵母基因具有很高的同源性，研究这些基因编码的蛋白质的生理功能以及它们与其它蛋白质之间的蛋白质的生理功能以及它们与其它蛋白质之间的相互作用将有助于加深对这些遗传性疾病的了的相互作用将有助于加深对这些遗传性疾病的了解。解。3酵母遗传医学知
4、识主要内容主要内容n一、酵母菌的基因组和染色体n二、酵母线粒体基因组及其遗传n三、酵母菌中的质粒n四、酵母基因表达的调控n五、接合型基因及其基因型转换n六、酵母菌的载体系统4酵母遗传医学知识第一节酵母菌的基因组和染色体第一节酵母菌的基因组和染色体一一.酵母菌的基因组酵母菌的基因组 酵母中编码酵母中编码RNARNA或蛋白质的大约或蛋白质的大约26002600个基因。个基因。通过对通过对酿酒酵母酿酒酵母的完整基因组测序，发现在的完整基因组测序，发现在12068kb12068kb的全基因组序列中有的全基因组序列中有58855885个编码专一性蛋个编码专一性蛋白质的开放阅读框（白质的开放阅读框（ORF
5、ORF）。这意味着在酵母基因组）。这意味着在酵母基因组中平均每隔中平均每隔2kb2kb就存在一个编码蛋白质的基因，即整就存在一个编码蛋白质的基因，即整个基因组有个基因组有7272的核苷酸顺序由开放阅读框组成。的核苷酸顺序由开放阅读框组成。这说明酵母基因比其它高等真核生物基因排列紧这说明酵母基因比其它高等真核生物基因排列紧密。密。5酵母遗传医学知识1.1.核小体：核小体：DNADNA和组蛋白（和组蛋白（H2AH2A、H2BH2B、H3H3和和H4H4）酿酒酵母中无酿酒酵母中无H1H1（有丝分裂中维持染色质的高度超螺旋）（有丝分裂中维持染色质的高度超螺旋）2.2.着丝粒（着丝粒（centromer
6、ecentromere）:点着丝粒和区域着丝粒点着丝粒和区域着丝粒3.3.端粒端粒(telomere)(telomere)：末端重复序列和蛋白质末端重复序列和蛋白质4.4.复制起点：复制起点：控制控制DNADNA复制起始的一段复制起始的一段DNADNA序列序列ARSARS ARS ARS若克隆到质粒中，可使质粒若克隆到质粒中，可使质粒DNADNA在酵母中自主复制。在酵母中自主复制。1 1）ARSARS的结构的结构 A A：ACSACS在所有的在所有的ARSARS都完全相同或相似都完全相同或相似 ARS BARS B：ACSACS的的3 3末端末端 C C：ACSACS的的5 5末端，富含末端，
7、富含ATAT，C C之间无同源性，无共有序列之间无同源性，无共有序列 二二.酵母菌的染色体酵母菌的染色体6酵母遗传医学知识（2）ARS-结合蛋白：可能起始酿酒酵母的复制。起始识别复合物（ORC）：与A、B区结合，可能使复制起始蛋白。Abf1p与蛋白结合可提高复制效率。（3）ARS启动染色体复制的活性 有些ARS在原染色体上无自主复制活性，而克隆到质粒中则具有活性？正在研究中。7酵母遗传医学知识第二节酵母线粒体基因组及其遗传第二节酵母线粒体基因组及其遗传n线粒体是真核细胞重要的代谢中心之一。线粒体是真核细胞重要的代谢中心之一。n其其DNADNA（mtDNAmtDNA）编码自身所需的）编码自身所需
8、的rRNArRNA、tRNAtRNA以一些蛋白质如细胞色素和以一些蛋白质如细胞色素和ATPATP酶等。酶等。n1.1.呼吸缺陷突变株三类：呼吸缺陷突变株三类：分离性小菌落：染色体上基因发生了突变分离性小菌落：染色体上基因发生了突变 中性小菌落：完全丢失了线粒体中性小菌落：完全丢失了线粒体DNADNA 抑制性小菌落：丢失了部分线粒体抑制性小菌落：丢失了部分线粒体DNADNA8酵母遗传医学知识接合子基因营救接合子基因营救:野生型野生型细胞能为缺陷的小菌落基细胞能为缺陷的小菌落基因组提供有功能的蛋白翻因组提供有功能的蛋白翻译系统，那么它们杂交产译系统，那么它们杂交产生的接合子就能够表达该生的接合子就
9、能够表达该小菌落基因组携带的基因。小菌落基因组携带的基因。特点：特点：1)1)大多数大多数mtDNAmtDNA（线粒体（线粒体DNADNA）中无重复核苷酸序）中无重复核苷酸序列列重要特点重要特点 2)2)半自主性半自主性2.2.酵母线粒体基因组的物理图谱及其特性酵母线粒体基因组的物理图谱及其特性图779酵母遗传医学知识第三节第三节 酵母菌中的质粒酵母菌中的质粒n1.2m1.2m质粒：双链、环状质粒：双链、环状DNADNA、5050100100个拷个拷贝，不赋予宿主细胞遗传表型，属于隐蔽质贝，不赋予宿主细胞遗传表型，属于隐蔽质粒。粒。n最显著的特点最显著的特点：两个反向重复顺序（：两个反向重复顺
10、序（IR IR），），其上有其上有FRTFRT（专一性重组位点），它们被一（专一性重组位点），它们被一个较大的单一区（约个较大的单一区（约2.7kb2.7kb）和一个较小的单）和一个较小的单一区（约一区（约2.3kb2.3kb）隔开。）隔开。FRTFRT重组产生两种构重组产生两种构型的质粒，即型的质粒，即A A型和型和B B型。型。10酵母遗传医学知识2.2.嗜杀现象嗜杀现象 19631963年，年，BevanBevan和和MakowerMakower发现酿酒酵母中某些发现酿酒酵母中某些菌株可产生毒素而杀死其他酵母的现象。菌株可产生毒素而杀死其他酵母的现象。嗜杀株（嗜杀株（killerkill
11、er）：产生毒素的菌株：产生毒素的菌株 敏感株敏感株：对毒素敏感的菌株：对毒素敏感的菌株 中性株中性株：既不产毒素又不敏感的菌株：既不产毒素又不敏感的菌株 该特性由两种具有自我复制能力的细胞遗传因该特性由两种具有自我复制能力的细胞遗传因子子-双链线状双链线状RNA(dsRNA)RNA(dsRNA)决定的，它们通常以决定的，它们通常以蛋蛋白质外壳包裹着的粒子状态白质外壳包裹着的粒子状态存在于细胞之中，存在于细胞之中，不具不具有体外侵染的特性有体外侵染的特性。也称为类病毒颗粒（。也称为类病毒颗粒（virus-virus-like particlelike particle）.分类：分类：L-dsR
12、NA:L-dsRNA:编码自身和编码自身和M M型的蛋白外壳和型的蛋白外壳和RNARNA聚合酶聚合酶 M-dsRNAM-dsRNA：编码杀伤毒素蛋白，分泌到细胞外。：编码杀伤毒素蛋白，分泌到细胞外。11酵母遗传医学知识12酵母遗传医学知识第四节 酵母基因表达的调控*真核基因调控分两类真核基因调控分两类:n1、瞬间调控（可逆性控制）、瞬间调控（可逆性控制）n2、发育调控（不可逆性控制）、发育调控（不可逆性控制）13酵母遗传医学知识n一一.酵母基因的启动子元件酵母基因的启动子元件n所有启动子都包括所有启动子都包括3 3个个基本的基本的DNADNA序列元序列元件（顺式作用元件）：件（顺式作用元件）：
13、1 1）上游激活序列）上游激活序列(UAS)(UAS)2 2）TATATATA元件元件3 3）转录起始位点，有些酵母基因的启动子）转录起始位点，有些酵母基因的启动子还含有沉默子还含有沉默子。14酵母遗传医学知识n2.酵母的转录调控因子n(1)TATA区结合蛋白 成环假说n(2)GAL4转录因子和gal基因的表达调控15酵母遗传医学知识n(3)GCN4(3)GCN4转录调控因子转录调控因子n(4)HAP1(4)HAP1、HAP2HAP2和和HAP3HAP3n(5)1(5)1、22和和a1a1调节蛋白调节蛋白16酵母遗传医学知识第五节 接合型基因及其基因型转换n1.酿酒酵母 的生活史17酵母遗传医
14、学知识酵母的同宗配合和异宗配合酵母的同宗配合和异宗配合18酵母遗传医学知识2.2.酿酒酵母细胞分裂的遗传调酿酒酵母细胞分裂的遗传调控控n减数分裂减数分裂n有丝分裂有丝分裂19酵母遗传医学知识（1 1）a a和和单倍体细胞单倍体细胞20酵母遗传医学知识(2)(2)接合信息素信号的传递接合信息素信号的传递21酵母遗传医学知识（3)3)接合型基因接合型基因MATMAT在接合过在接合过程中的调控程中的调控22酵母遗传医学知识3.3.接合型基因的转换接合型基因的转换n某些酵母有转换交配型的能力，即从某些酵母有转换交配型的能力，即从 a a 型变成型变成为为 型，或从型，或从 型转变为型转变为 a a 型
15、。这些品系带型。这些品系带有显性等位基因有显性等位基因 HO HO 并频繁地改变它们的交配并频繁地改变它们的交配型（常常每代改变一次），带有隐性等位基因型（常常每代改变一次），带有隐性等位基因 ho ho 的品系有一个稳定的交配型，其交配型改的品系有一个稳定的交配型，其交配型改变的频率仅约变的频率仅约 10 10-6-6 。转换的存在表明所有的细。转换的存在表明所有的细胞都含有胞都含有 MATa MATa 和和 MAT MAT 型的潜在信息，型的潜在信息，MAT MAT 和和 MATa MATa 同在一条染色体上，同在一条染色体上，。23酵母遗传医学知识(1)酵母接合酵母接合型基因的转换型基因
16、的转换24酵母遗传医学知识（1 1）酵母接合型基因的转换）酵母接合型基因的转换n 酵母交配型转换的暗箱模型（酵母交配型转换的暗箱模型（cassette cassette model model），提出），提出 MAT MAT 是活性暗盒（是活性暗盒（active active cassette cassette），可以是），可以是 型，也可以是型，也可以是 a a 型型。HML HML 和和 HMR HMR 是沉默暗盒（是沉默暗盒（silent silent cassettes cassettes），都不能表达。通常），都不能表达。通常 HML HML 带带有有 暗盒，而暗盒，而 HMR HM
17、R 带有带有 a a 暗盒，所有的暗盒，所有的暗盒都带有编码交配型的信息，但只有暗盒都带有编码交配型的信息，但只有 MAT MAT 可以表达。当活性暗盒信息被沉默可以表达。当活性暗盒信息被沉默暗盒信息所取代时就发生了交配型转换暗盒信息所取代时就发生了交配型转换。25酵母遗传医学知识SIR基因产物关闭HML 和HMR a a基因27酵母遗传医学知识n原推则原推则 HML HML 和和 MHRa MHRa 之所以之所以“沉默沉默”是由于它们缺乏启动子，是由于它们缺乏启动子，但其实不然，因为但其实不然，因为 MAT MAT 和和 MATa MATa 特异性特异性 mRNA mRNA 的转录是在的转录
18、是在 Y Y 片段的内部起始的，而沉默暗盒和片段的内部起始的，而沉默暗盒和 MAT MAT 暗盒中的暗盒中的 Y Y 序列是相同序列是相同的，必定具有相同的启动子。差不多在同一时期遗传学家们发现的，必定具有相同的启动子。差不多在同一时期遗传学家们发现了了 4 4 个不连锁的沉默信息调节基因个不连锁的沉默信息调节基因 SIR SIR（silent information silent information regulator regulator）1 1、2 2、3 3 和和 4 4，这些基因产物共同起反式作用（它，这些基因产物共同起反式作用（它们并不在同一条的染色体上）来阻止沉默暗盒中的基因表
19、达。若们并不在同一条的染色体上）来阻止沉默暗盒中的基因表达。若这这 4 4 个个 SIR SIR 基因中任何一个基因失去作用的话，那么基因中任何一个基因失去作用的话，那么 HML HML 和和 HMRa HMRa 基因同样可转录。为了寻找基因同样可转录。为了寻找 SIR SIR 产物的作用位点，首先通产物的作用位点，首先通过体外诱变在过体外诱变在 HMRa HMRa 和和 HMR HMR 中产生缺失，然后利用中产生缺失，然后利用 DNA DNA 转化转化的方法将缺失的的方法将缺失的 DNAs DNAs 插入合适的酵母菌株中看看是否能表达，插入合适的酵母菌株中看看是否能表达，从而确定从而确定 S
20、IR SIR 蛋白结合位点。蛋白结合位点。28酵母遗传医学知识n3 E L E L 和和 E R E R 位点缺失突变分析表明在各个位点缺失突变分析表明在各个 HML HML 和和 HMR HMR 的上游具有阻遏它们表达的位点的上游具有阻遏它们表达的位点，此靶位点有时称为，此靶位点有时称为 E E 沉默子和沉默子和 I I 沉默子，或沉默子，或 E L E L（near HML near HML）和）和 E R E R（near HMR near HMR）。控）。控制位点具有制位点具有 2 2 个特点：个特点：它们具有负的增强它们具有负的增强子的作用，它们能对远隔子的作用，它们能对远隔 2 2
21、 5Kb 5Kb 的启动子发的启动子发挥作用，而且没有方向性，所以它们被称为沉挥作用，而且没有方向性，所以它们被称为沉默子（默子（silencers silencers）；）；它们和可能具有复制起它们和可能具有复制起点作用的点作用的 ASR ASR 序列相联序列相联 。29酵母遗传医学知识MATa MATa 和和 MAT MAT 基因编码调节蛋白基因编码调节蛋白30酵母遗传医学知识n 细胞含有很多的细胞含有很多的“-特异性蛋白特异性蛋白”，而而 a 细胞含有一套细胞含有一套“a-特异性蛋白特异性蛋白”。nMAT 座位的基本功能是控制外激素和受座位的基本功能是控制外激素和受体基因以及其他和交配有
22、关基因的表达体基因以及其他和交配有关基因的表达，每种类型的座位编码一些调节蛋白。，每种类型的座位编码一些调节蛋白。MAT 编码两种调节蛋白：编码两种调节蛋白：1 和和 2nMATa 只编码一种调节蛋白只编码一种调节蛋白 a1。31酵母遗传医学知识n在二倍体中在二倍体中 2 2 蛋白蛋白仍可合成，其功能仍可合成，其功能是：是：阻遏阻遏 a-a-交交配型特异基因群的配型特异基因群的表达；表达；和和 a1 a1 相相互合作来阻遏互合作来阻遏 1 1 的的及及 hsg hsg 的表达。的表达。1 1 不能合成就无法诱不能合成就无法诱导导 -交配型特异基交配型特异基因群的表达。因群的表达。hsg hsg
23、 基因的阻遏就不能基因的阻遏就不能合成阻遏减数分裂合成阻遏减数分裂和孢子形成的蛋白和孢子形成的蛋白，使二倍体特异基，使二倍体特异基因群得到表达，从因群得到表达，从而可以进行减数分而可以进行减数分裂及孢子形成。裂及孢子形成。32酵母遗传医学知识（2 2）接合型转换机理）接合型转换机理n转换过程中受体位点（转换过程中受体位点（MAT MAT）被转变成）被转变成供体型的序列（供体型的序列（HML HML 和和 HMR HMR）。）。MAT MAT 的突变可阻止交配型转换鉴别出转换所的突变可阻止交配型转换鉴别出转换所需的位点。通过需的位点。通过 HML HML 或或 HMR HMR 中的缺失中的缺失突
24、变发现了这个转变过程具有单向性的突变发现了这个转变过程具有单向性的特点。特点。33酵母遗传医学知识34酵母遗传医学知识第六节第六节 酵母菌的载体系统酵母菌的载体系统n1.1.克隆载体克隆载体n（1 1）酵母整合型载体）酵母整合型载体n（2 2）酵母附加体质粒载体（）酵母附加体质粒载体（YEp)YEp)35酵母遗传医学知识（2 2）酵母附加体质粒载体（）酵母附加体质粒载体（YEp)YEp)36酵母遗传医学知识n3.酵母菌酵母菌复制载体复制载体n4.4.酵母着丝粒载体酵母着丝粒载体n5.5.酵母的人工染色体（酵母的人工染色体（YAC)YAC)37酵母遗传医学知识 载体首先被载体首先被BamHIBa
25、mHI和和SnaBISnaBI酶酶切将分子切成三块，切将分子切成三块，BamHIBamHI片段被去掉，剩下两个臂，片段被去掉，剩下两个臂，每一臂都已每一臂都已TELTEL作为末端，另作为末端，另一端是一端是SnaBISnaBI位点。克隆的位点。克隆的DNADNA必须是平端必须是平端(SnaBI(SnaBI也是也是一个平端酶，识别序列是一个平端酶，识别序列是TACGTA)TACGTA)被连接在两个臂的被连接在两个臂的中间就产生了人工染色体。中间就产生了人工染色体。利用原生质转化法将人工染利用原生质转化法将人工染色体引入酵母。受体酵母是色体引入酵母。受体酵母是利用一个双营养缺陷体利用一个双营养缺陷
26、体trp1-trp1-ura3ura3，载体上含有互补基因，载体上含有互补基因作为选择标记。转化后于基作为选择标记。转化后于基本培养基上培养，只有含有本培养基上培养，只有含有人工染色体的细胞可以正常人工染色体的细胞可以正常生长。含有两个左臂或者两生长。含有两个左臂或者两个右臂的染色体都不能正常个右臂的染色体都不能正常生长，因为其中一个选择标生长，因为其中一个选择标记基因丢失，插入片段的鉴记基因丢失，插入片段的鉴定可以通过定可以通过SUP4SUP4基因的插入基因的插入失活，白色的克隆是重组子失活，白色的克隆是重组子，红色的不是。，红色的不是。38酵母遗传医学知识YACYAC载体的使用：载体的使用
27、：n 一些哺乳动物的基因大于一些哺乳动物的基因大于100kb100kb超过了大肠杆菌载超过了大肠杆菌载体系统的承受范围，但正好在体系统的承受范围，但正好在YACYAC载体的范围之内。载体的范围之内。研究发现，在某些情况下，研究发现，在某些情况下，YACsYACs可以在哺乳动物中表可以在哺乳动物中表达，因此可以在基因存在的生物中研究基因的功能。达，因此可以在基因存在的生物中研究基因的功能。YACsYACs在构建基因文库中非常重要，最高容量的大在构建基因文库中非常重要，最高容量的大肠杆菌质粒可以插入肠杆菌质粒可以插入300kb300kb的片断，对于人的基因文库的片断，对于人的基因文库需要需要300
28、0030000个克隆，而个克隆，而YACsYACs可以克隆可以克隆600kb600kb的片段，一的片段，一些类型可以携带些类型可以携带1400kb1400kb片段，可以使人类基因文库的片段，可以使人类基因文库的克隆数降至克隆数降至65006500个。虽然，个。虽然，”mega-YACs”mega-YACs”存在着不稳存在着不稳定性，克隆的定性，克隆的DNADNA片段可以被重新排列。但是，片段可以被重新排列。但是，YACsYACs在大规模的测序中是非常有用的。在大规模的测序中是非常有用的。39酵母遗传医学知识n二、酵母的表达载体二、酵母的表达载体n三、酵母的分泌载体三、酵母的分泌载体40酵母遗传医学知识
