教培用遗传病的诊断修改课件.ppt

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1、遗传病的诊断修改 例如:假肥大型肌营养不良(例如:假肥大型肌营养不良(DMDDMD)约有)约有1/31/3的病例为新的基因突变引起的。一般认为的病例为新的基因突变引起的。一般认为是由于患者母亲卵子形成过程中是由于患者母亲卵子形成过程中X X染色体上染色体上DMDDMD基因突变所致。基因突变所致。对系谱的分析要注意区别对系谱的分析要注意区别:1.1.孟德尔遗传病孟德尔遗传病 包括包括ADAD遗传病、遗传病、ARAR遗传病、遗传病、XDXD遗传病、遗传病、XRXR遗传遗传病、病、YLYL疾病等。疾病等。系谱分析对这类疾病的分析非常有用,分析时系谱分析对这类疾病的分析非常有用,分析时要考虑到某些疾病

2、的遗传异质性、不规则外显、外要考虑到某些疾病的遗传异质性、不规则外显、外显不全和延迟显性等情况,可能会造成一些临床假显不全和延迟显性等情况,可能会造成一些临床假象,由于遗传的异质性可能将不同的遗传病误认为象,由于遗传的异质性可能将不同的遗传病误认为同一种遗传病进行分析。同一种遗传病进行分析。1.父系印记基因父系印记基因:来自父系的等位基因的表达被抑制来自父系的等位基因的表达被抑制 来自母系的等位基因表达来自母系的等位基因表达(mono-allelic)2.母系印记基因母系印记基因:来自母系的等位基因的表达被抑制来自母系的等位基因的表达被抑制 来自父系的等位基因表达来自父系的等位基因表达(mon

3、o-allelic)基因印记基因印记 三、细胞遗传学检查三、细胞遗传学检查 (三)染色体原位杂交(三)染色体原位杂交 四、生物化学检查四、生物化学检查 单基因遗传病往往是由于基因突变导致酶单基因遗传病往往是由于基因突变导致酶和蛋白质的改变或缺如,使一些器官的发育和和蛋白质的改变或缺如,使一些器官的发育和正常的代谢发生改变,并在临床上表现出一系正常的代谢发生改变,并在临床上表现出一系列症状。列症状。因此,酶和蛋白质的定性和定量分析可反因此,酶和蛋白质的定性和定量分析可反映基因结构的改变,是诊断单基因病的主要方映基因结构的改变,是诊断单基因病的主要方法之一,由于主要采用生化手段故称之为生物法之一,

4、由于主要采用生化手段故称之为生物化学检查。化学检查。一、产前诊断的适应征一、产前诊断的适应征二、产前诊断的方法二、产前诊断的方法 仪器诊断仪器诊断 包括:包括:X X线检查线检查 超声波检查超声波检查 胎儿镜检查胎儿镜检查 细胞学方法(染色体检查;染色质检查)细胞学方法(染色体检查;染色质检查)生化方法(蛋白质或酶检查;代谢产物检查)生化方法(蛋白质或酶检查;代谢产物检查)分子生物学方法(基因分析)分子生物学方法(基因分析)利用限制酶酶切技术、分子杂交技术、利用限制酶酶切技术、分子杂交技术、PCRPCR技术技术等分子生物学手段,对羊水细胞、绒毛或其他胎儿组等分子生物学手段,对羊水细胞、绒毛或其

5、他胎儿组织中提取的织中提取的DNADNA进行基因诊断。进行基因诊断。三、产前诊断的标本及采集技术三、产前诊断的标本及采集技术可用于检测的标本:可用于检测的标本:羊水上清液、羊水细胞羊水上清液、羊水细胞 绒毛绒毛 脐带血、孕妇外周血中胎儿细胞脐带血、孕妇外周血中胎儿细胞 孕妇血清和尿液孕妇血清和尿液 受精卵、胚胎组织受精卵、胚胎组织 羊膜穿刺术羊膜穿刺术(amniocentesisamniocentesis)羊膜穿刺术一般在妊娠羊膜穿刺术一般在妊娠16161818周时进行。因周时进行。因为此时羊水量多、胎儿浮动,穿刺时容易进针,为此时羊水量多、胎儿浮动,穿刺时容易进针,且不易伤及胎儿。取材最好是

6、在且不易伤及胎儿。取材最好是在B B超监视下进行。超监视下进行。绒毛吸取术绒毛吸取术 脐带穿刺术脐带穿刺术(cordocentesiscordocentesis)脐带穿刺术可在脐带穿刺术可在B B超监视下进行。用一细针超监视下进行。用一细针经孕妇腹壁进入胎儿的脐带,抽取胎儿脐静脉血。经孕妇腹壁进入胎儿的脐带,抽取胎儿脐静脉血。一般在孕中期(妊娠一般在孕中期(妊娠1818周)进行。周)进行。脐血可作染色体或血液学各种检查,亦可用脐血可作染色体或血液学各种检查,亦可用于因羊水细胞培养失败、于因羊水细胞培养失败、DNADNA分析无法诊断而能分析无法诊断而能用胎儿血浆或血细胞进行生化检测的疾病、或在用

7、胎儿血浆或血细胞进行生化检测的疾病、或在错过绒毛和羊水取样时机时进行。错过绒毛和羊水取样时机时进行。孕妇外周血分离胎儿细胞分离孕妇外周血分离胎儿细胞分离 孕妇外周血分离胎儿细胞是一项非创伤性产孕妇外周血分离胎儿细胞是一项非创伤性产前诊断技术,并易于被孕妇接受。孕妇外周血中前诊断技术,并易于被孕妇接受。孕妇外周血中的胎儿细胞至少有的胎儿细胞至少有3 3种,即滋养叶细胞、有核红种,即滋养叶细胞、有核红细胞和淋巴细胞。细胞和淋巴细胞。目前许多学者都致力于解决胎儿细胞的识别、目前许多学者都致力于解决胎儿细胞的识别、富集和如何排除母血的富集和如何排除母血的“污染污染”等。此方法将以等。此方法将以简便、经

8、济的特点在遗传病的预防中发挥作用。简便、经济的特点在遗传病的预防中发挥作用。植入前诊断是利用微操作技术和植入前诊断是利用微操作技术和DNADNA扩增技扩增技术对胚泡植入前进行检测。术对胚泡植入前进行检测。植入前遗传学诊断植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGDpreimplantation genetic diagnosis,PGD)是指用分子或细胞是指用分子或细胞遗传学技术对体外受精遗传学技术对体外受精的胚胎进行遗传学诊断,的胚胎进行遗传学诊断,确定正常后再将胚胎植确定正常后再将胚胎植入子宫。入子宫。获得植入前胚胎的主要方法:获得植入前胚胎

9、的主要方法:子宫冲洗子宫冲洗 体外授精体外授精 植入前诊断的基本技术:植入前诊断的基本技术:(1 1)胚胎组织微活检:胚胎组织微活检:目前多采用在目前多采用在6 68 8个细胞期,通过显微操个细胞期,通过显微操作技术取出作技术取出1 12 2个细胞进行染色体或基因的检个细胞进行染色体或基因的检查。查。(2 2)PCRPCR技术:技术:单细胞单细胞PCRPCR技术主要用于单基因遗传病的诊技术主要用于单基因遗传病的诊断。采用引物延伸预扩增技术,以随机引物对断。采用引物延伸预扩增技术,以随机引物对单个细胞单个细胞,使单个细胞,使单个细胞的多位点分析成为可能。荧光的多位点分析成为可能。荧光PCRPCR

10、也是常用的技也是常用的技术。术。(3 3)FISHFISH技术:技术:该技术利用荧光标记的特定探针与固定在该技术利用荧光标记的特定探针与固定在玻片上的卵裂球细胞核进行杂交,在显微镜下玻片上的卵裂球细胞核进行杂交,在显微镜下鉴定鉴定。第四节第四节 基因诊断基因诊断 (gene diagnosisgene diagnosis)脐带血、孕妇外周血中胎儿细胞来发展十分迅速的大规模、PKU家系PAH基因STR连锁分析DMD基因缺失的多重PCR系谱分析对这类疾病的分析非常有用,分析时要考虑到某些疾病的遗传异质性、不规则外显、外显不全和延迟显性等情况,可能会造成一些临床假象,由于遗传的异质性可能将不同的遗传

11、病误认为同一种遗传病进行分析。Klinefelter综合征植入前诊断是利用微操作技术和DNA扩增技术对胚泡植入前进行检测。ASO HybridizationNormal probeRFLP、VNTR、SSCP、AMPFLP等技术均可用于连锁分析。一般在孕中期(妊娠18周)进行。此外还包括反应底物、中间产物或终产物和受体的结合能力检查。Western印迹杂交(molecular hybridization)产前诊断又称宫内诊断(intrauterine diagnosis)是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作出准确的诊断。(一)基因诊断的基本技术(一)基因诊断的基本技术 分子杂交

12、技术分子杂交技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)技术技术 DNADNA序列测定技术序列测定技术 基因芯片技术基因芯片技术 1.1.分子杂交技术分子杂交技术 (molecular hybridizationmolecular hybridization)原理:双链原理:双链DNADNA在加热到一定温度以上或在在加热到一定温度以上或在碱性溶液中会变性成为两条单链,互补的两条碱性溶液中会变性成为两条单链,互补的两条DNADNA单链在一定条件下结合成为双链。即能够进单链在一定条件下结合成为双链。即能够进行杂交。这种结合是特异的,即严格按照碱基行杂交。这种结合是特异的,即严格按照碱基互

13、补的原则进行,它不仅能在互补的原则进行,它不仅能在DNADNA和和DNADNA之间进之间进行,也能在行,也能在DNADNA和和RNARNA之间进行。之间进行。因此因此 ,当一段已知基因的核酸序列作为探,当一段已知基因的核酸序列作为探针,与变性后的单链针,与变性后的单链DNADNA接触时,如果两者的碱接触时,如果两者的碱基完全配对,它们即互补地结合成双链,从而基完全配对,它们即互补地结合成双链,从而表明被测基因组表明被测基因组DNADNA中含有已知的基因序列。中含有已知的基因序列。基因探针基因探针(probe):):是一段带有标记的,与待测基因有关的是一段带有标记的,与待测基因有关的核苷酸序列。

14、核苷酸序列。探针探针 基因组探针基因组探针(genomic probe)cDNA cDNA探针探针(cDNA probe)寡核苷酸探针寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)杂交方法:杂交方法:斑点杂交斑点杂交 Southern Southern杂交杂交 Northern Northern杂交杂交 Western Western印迹杂交印迹杂交 原位杂交原位杂交 寡核苷酸探针杂交寡核苷酸探针杂交 2.2.聚合酶链反应聚合酶链反应 (polymerase chain reactionpolymerase chain reaction,PCRPCR)聚合酶链反应技术是在体外迅速的

15、选择扩增聚合酶链反应技术是在体外迅速的选择扩增特定的靶特定的靶DNADNA的方法。又称体外的方法。又称体外DNADNA克隆技术。克隆技术。(1 1)按靶)按靶DNADNA片段的片段的5 5和和3 3端的碱基顺序各合端的碱基顺序各合成两条引物(长约成两条引物(长约2020个碱基的寡核苷酸);个碱基的寡核苷酸);(2 2)将待测)将待测DNADNA变性后,加入四种单核苷变性后,加入四种单核苷 (dNTPdNTP),),引物和耐热引物和耐热DNADNA聚合酶(聚合酶(Taq Taq 酶);酶);(3 3)反应液进)反应液进行热循环,每一周行热循环,每一周期经过变性(期经过变性(92929595),)

16、,(40406060)和)和(65657272)三个阶段产生倍增三个阶段产生倍增的的DNADNA。一般进行一般进行20204040个周期。个周期。Maxan Maxan和和GilbertGilbert首先建立了化学方法,首先建立了化学方法,SangerSanger建立了建立了DNADNA测序的酶学方法。测序的酶学方法。最新的最新的DNADNA自动测序法以不同荧光色素标自动测序法以不同荧光色素标记的四种不同脱氧核苷酸为原料进行酶促合成记的四种不同脱氧核苷酸为原料进行酶促合成反应,经过凝胶电泳分离,应用激光分析及计反应,经过凝胶电泳分离,应用激光分析及计算机处理就能直接读出碱基顺序。极大地推进算机

17、处理就能直接读出碱基顺序。极大地推进了生命科学的发展和人类基因组计划的进程,了生命科学的发展和人类基因组计划的进程,而且测序的长度可以达到而且测序的长度可以达到1000bp1000bp以上。以上。DNADNA测序(测序(DNA Sequencing)是检测未知突变是检测未知突变和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。基因芯片技术是近年基因芯片技术是近年来发展十分迅速的大规模、来发展十分迅速的大规模、高通量分子检测技术。其高通量分子检测技术。其基本原理是核酸杂交,其基本过程是将许多基本原理是核酸杂交,其基本过程是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探

18、针,特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针,有规律地排列固定于支持物上,形成矩阵点。有规律地排列固定于支持物上,形成矩阵点。现在的技术可以做到在现在的技术可以做到在1cm1cm2 2上排列成千上万上排列成千上万个个“点点”。4.4.基因芯片技术基因芯片技术(gene chip)(gene chip)样品样品DNA/RNADNA/RNA通过通过PCRPCR扩增、体外转录等技术扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子,然后按碱基配对原理进行掺入荧光标记分子,然后按碱基配对原理进行杂交,再通过荧光检测系统等杂交,再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描,并配对芯片进行扫描,并配以计算机系统对每一探以计算机系统对

19、每一探针上的荧光信号做出比针上的荧光信号做出比较和检测,得出所要的较和检测,得出所要的信息。信息。(二)基因诊断的途经(二)基因诊断的途经 1.1.直接诊断直接诊断 检测突变基因检测突变基因 直接诊断是直接检测致病突变的基因。它直接诊断是直接检测致病突变的基因。它通常使用基因本身或紧邻的通常使用基因本身或紧邻的DNADNA序列作为探针,序列作为探针,或通过或通过PCRPCR扩增产物,以探查基因无突变、缺失扩增产物,以探查基因无突变、缺失等异常及其性质,这称为直接基因诊断,它适等异常及其性质,这称为直接基因诊断,它适用已知基因异常的疾病。用已知基因异常的疾病。当致病基因的某种突变类型与发病有直当

20、致病基因的某种突变类型与发病有直接的因果关系接的因果关系,或者对致病基因以及分子机或者对致病基因以及分子机制已完全了解制已完全了解,或者对致病基因以及分子机或者对致病基因以及分子机制部分了解但已知其中规律制部分了解但已知其中规律,可应用此途径。可应用此途径。2.2.间接诊断间接诊断 基因连锁分析基因连锁分析 当致病基因虽然已知但其异常尚属未知或当致病基因虽然已知但其异常尚属未知或突变类型较多时;或致病基因本身尚属未知时,突变类型较多时;或致病基因本身尚属未知时,但被检测基因有紧密连锁的但被检测基因有紧密连锁的DNADNA多态标记,可以多态标记,可以通过对受检者及其家系进行连锁分析,以推断通过对

21、受检者及其家系进行连锁分析,以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。前者是否获得了带有致病基因的染色体。连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNADNA多态性位,特别是基因突变部位或紧邻的多多态性位,特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。态性位点作为标记。RFLPRFLP、VNTRVNTR、SSCPSSCP、AMPAMPFLPFLP等技术均可用于连锁分析。等技术均可用于连锁分析。(三)基因诊断的方法选择:(三)基因诊断的方法选择:各种遗传病的基因异常是不同的,同一遗各种遗传病的基因异常是不同的,同一遗传病也可以有不同的基因异常,但这些异常大传病也可

22、以有不同的基因异常,但这些异常大体可分为基因缺失和突变两大类型。根据对基体可分为基因缺失和突变两大类型。根据对基因异常类型的了解,可以采用不同的诊断方法。因异常类型的了解,可以采用不同的诊断方法。Mutation probe如果能在杂合子个体生育之前或出现症状之前就作出诊断,可以避免他将致病基因传递给后代,减少遗传病的发病率。荧光PCR也是常用的技术。2夫妇之一有染色体数目或结构异常者;该方法特别适用于分子病、先天性代谢缺陷、免疫缺陷等遗传病的检查。(3)适应性强,诊断范围广,因基因探针可为任何来源、任何种类,其探针序列可为未知或已知,待检测的目的基因可为一个特定基因或基因组合。(pre-sy

23、mptomatic diagnosis)PAH基因Sph切点 Sph酶对PKU的RFLP分析也须询问清楚,记录在系谱中。(1)基因组印记植入前遗传学诊断(4)羊水细胞、绒毛细胞、进入母体循环的胎儿细胞。如果能在杂合子个体生育之前或出现症状之前就作出诊断,可以避免他将致病基因传递给后代,减少遗传病的发病率。PCR的原理:(symptomatic diagnosis)cDNA探针(cDNA probe)(chorionic villus aspiration sampling,CVS)52外显子区段缺失;子宫冲洗 遗传的基因诊断方法遗传的基因诊断方法基因异常基因异常 方法方法 探针、引物或限制酶探

24、针、引物或限制酶基因缺失基因缺失 基因组基因组DNADNA印迹杂交印迹杂交 缺失基因的探针缺失基因的探针 PCRPCR扩增扩增 引物包括缺失或在缺失部位内引物包括缺失或在缺失部位内点突变点突变 RFLPRFLP分析分析 突变导致其切点消失的限制酶突变导致其切点消失的限制酶 ASO ASO杂交杂交 正常和异常的正常和异常的ASOASO探针探针 PCRPCR产物的多态性分析产物的多态性分析 引物包括突变部位引物包括突变部位 (RFLPRFLP、SSCPSSCP、DGGEDGGE)基因已知基因已知 基因内或旁侧序列多态性基因内或旁侧序列多态性 基因内或旁基因内或旁但异常不明但异常不明 (RFLPRF

25、LP、SSCPSSCP、AMP-FLPAMP-FLP)侧序列探针或引物侧序列探针或引物 连锁分析连锁分析 基因未知基因未知 与疾病连锁的多态性,与疾病连锁的多态性,与疾病连锁的多态与疾病连锁的多态 如如SSCPSSCP、AMP-FLPAMP-FLP连锁分析,连锁分析,位点探针或引物位点探针或引物 RFLPRFLP位点单体型连锁分析位点单体型连锁分析 (三)基因诊断在遗传病诊断中的应用(三)基因诊断在遗传病诊断中的应用 1.1.对单基因病的基因诊断对单基因病的基因诊断 (1 1)点突变型遗传病的基因诊断点突变型遗传病的基因诊断 Normal probeMutation probe(acatala

26、semia)acatalasemia)是一种常染色体隐性遗传病,患者过氧化氢酶活是一种常染色体隐性遗传病,患者过氧化氢酶活性只有正常人的性只有正常人的0.2%0.2%0.4%0.4%,杂合体血液中过氧化氢,杂合体血液中过氧化氢酶活性则处于中间水平。过氧化氢酶基因由酶活性则处于中间水平。过氧化氢酶基因由1313个外显个外显子和子和1212个内含子组成。个内含子组成。应用应用32P32P标记标记PCRPCR反应中底物反应中底物方法,扩增第方法,扩增第4 4个外显子和内个外显子和内含子附近的含子附近的203bp203bp片段,应用片段,应用SSCPSSCP法可清楚地判断患者和法可清楚地判断患者和杂合

27、体。杂合体。aa/aa aa/-aa/a-a-/-/-14kb10kb10kb 4kbBamH IBamH I左侧:左侧:1616号染色体上携有数目不同的基因号染色体上携有数目不同的基因右侧:右侧:a a基因探针杂交的结果基因探针杂交的结果1)-地贫基因缺失的诊断地贫基因缺失的诊断正常正常贫血贫血症状症状携带携带者者HbH(2 2)基因缺失型遗传病的诊断)基因缺失型遗传病的诊断2)DMD2)DMDBMDBMD的缺失型诊断:的缺失型诊断:以苯丙酮尿症以苯丙酮尿症(PKU)(PKU)的基因诊断为例。的基因诊断为例。PAHPAH基因基因SphSph切点切点 SphSph酶对酶对PKUPKU的的RFL

28、PRFLP分析分析 示意图示意图 A.A.系谱;图系谱;图 一个一个PKUPKU家系的家系的 DMD家系家系单体型单体型分析图解分析图解PKU,AR1 21 2 35.6 Kb5.2 Kb4.2 Kb4.0 KbHind Sph11.0 Kb 9.7 Kb 7.0 KbPKUPKU家系家系PAHPAH基因基因 2.2.多基因遗传病的基因诊断多基因遗传病的基因诊断 人类基因组多态性是多基因病基因诊断的人类基因组多态性是多基因病基因诊断的基础,易感基因多态性的检测能帮助我们理解基础,易感基因多态性的检测能帮助我们理解多基因病发生的机制,有助于对疾病的诊断和多基因病发生的机制,有助于对疾病的诊断和分

29、类。分类。目前已经发现一些多基因病相关基因,如目前已经发现一些多基因病相关基因,如载脂蛋白载脂蛋白E E基因(基因(ApoEApoE)的多态性与阿尔茨海默)的多态性与阿尔茨海默病(病(ADAD)有高度相关性,血管紧张肽转换酶基)有高度相关性,血管紧张肽转换酶基因的多态性与原发性高血压和心肌梗死高度相因的多态性与原发性高血压和心肌梗死高度相关。关。rasras基因突变的检测可采用基因突变的检测可采用PCR-ASOPCR-ASO方法进行,方法进行,已知已知rasras基因突变的热点在基因突变的热点在1212、1313及及6161密码子。密码子。目前常用目前常用PCRPCR法进行检测法进行检测p p

30、5353突变的热点是外显突变的热点是外显子子5 58 8,一般可先选用外显子,一般可先选用外显子5 58 8的引物进行扩增,的引物进行扩增,其后再进行突变位点的详尽分析,甚至测序。另一其后再进行突变位点的详尽分析,甚至测序。另一初步检测初步检测p p5353基因突变的方法为基因突变的方法为PCR-SSCPPCR-SSCP,然后测序。,然后测序。(四)基因诊断的(四)基因诊断的 1.1.现症患者诊断:争取有效、针对性治疗。现症患者诊断:争取有效、针对性治疗。2.2.产前诊断:意义更为重要,预防遗传病产前诊断:意义更为重要,预防遗传病患儿的出生。患儿的出生。未来的基因诊断主要发展方向:未来的基因诊断主要发展方向:在囊胚在囊胚8 8个细胞期,个细胞期,通过对其中一个细胞的染色体核型分折和原位杂通过对其中一个细胞的染色体核型分折和原位杂交,从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段;交,从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段;。(五)疾病基因诊断的展(五)疾病基因诊断的展望望

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