1、肿瘤基因治疗的基本策略和常用方法（优选）肿瘤基因治疗的基本策略和常用方法v2.基因治疗基因治疗 指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。v3.什么是肿瘤基因治疗什么是肿瘤基因治疗 基因治疗的经典概念指通过外源基因导人人体以纠正内在的基因缺陷的疗法。肿瘤基因治疗不再局限于“纠正基因缺陷”，系指将外源的正常基因导人人体，达到直接或间接抑制或杀伤肿瘤细胞的目的。基因是生命之本，是生物得以
2、保持其连续性和稳定性的物质基础。随着对恶性肿瘤发生发展分子机制研究的不断深人，出于对肿瘤是一种基因病的认识，加之恶性肿瘤的发病率和病死率较高，这使得恶性肿瘤的基因治疗成为近年来基因治疗研究的主要内容和热点。v4.与基因治疗有关几个概念与基因治疗有关几个概念 a.基因毒癌发生发展的第一步是活化致癌物，改变细胞内的DNA，导致原癌基因的移位及扩增，这些特殊基因的翻译，使带有这些异常基因细胞的某些特性得以专一表达，一个特殊的化学物对一系列细胞有诱变及DNA修复作用者，称为基因毒。目前人类已知的致癌物均为基因毒。b.原癌基因(前癌基因)细胞癌基因存在于细胞基因组内，激活前的细胞癌基因称为原癌基因(前癌
3、基因)，一旦原癌基因激活成癌基因便会引起细胞癌变，癌基因激活后，通过其表达产物改变细胞生长和分化规律，诱发细胞癌变。细胞癌基因被激活的途径很多，如启动子插人，基因重排和扩增，基因点突变和DNA分子中去甲基化等。c.抑癌基因正常细胞中存在抑制肿瘤发生的基因，称为抑癌基因。抑癌基因的存在从最初的一个发现中得到证实，即一个肿瘤细胞和一个正常细胞融合成的杂交细胞，往往不具有细胞表型，即使两种不同的肿瘤细胞杂交，也可能是非肿瘤性的，只有正常的亲代失去某些基因之后，其子代才会发生肿瘤。后来，通过限制性内切酶片段长度多态分析及分子克隆技术的研究证实，正常细胞中有一类对细胞增殖起负性调节作用的基因，如大肠癌中
4、的p53基因，视网膜母细胞瘤和骨肉瘤中的Rb基因。这两种基因也是目前被确认并研究最为深人的抑癌基因。如将正常的Rb基因转人骨肉瘤细胞，Rb基因表达增高，细胞分裂几乎完全抑制，将Rb基因转人前列腺细胞，对正常细胞的生长无影响，但抑制了细胞的癌变，所 以当这一类的抑癌基因发生丢失，失活或变异时，就会促进细胞恶变。二.采用基因治疗肿瘤的基本策略v 目前国内外恶性肿瘤基因治疗基本策略包括 1.免疫性基因治疗v 2.病因性基因治疗v 3.溶瘤腺病毒基因治疗v 4.自杀基因治疗等1.免疫性基因治疗va.免疫性基因治疗的对象免疫性基因治疗的对象:v在肿瘤发生发展过程中，免疫系统发育未完在肿瘤发生发展过程中，
5、免疫系统发育未完善（善（34岁）和免疫机能衰退（老年人的细胞免疫和岁）和免疫机能衰退（老年人的细胞免疫和体液免疫功能均衰退）而出现两个肿瘤发生的年龄体液免疫功能均衰退）而出现两个肿瘤发生的年龄高峰期。高峰期。v胸腺发育不良（胸腺发育不良（Digeoges）综合症或咽）综合症或咽囊综合症是因胸腺发育不良而导致细胞免疫系统停囊综合症是因胸腺发育不良而导致细胞免疫系统停留在未分化阶段，这类患儿兼有细胞免疫缺陷和体留在未分化阶段，这类患儿兼有细胞免疫缺陷和体液免疫缺陷的共济失调，恶性肿瘤的发生率高达液免疫缺陷的共济失调，恶性肿瘤的发生率高达10%。由此说明细胞免疫和体液免疫功能的正由此说明细胞免疫和体
6、液免疫功能的正常或活性增强在抗恶性肿瘤的发生中是不可缺少的。常或活性增强在抗恶性肿瘤的发生中是不可缺少的。基因治疗的经典概念指通过外源基因导人人体以纠正内在的基因缺陷的疗法。能扩展至邻迈肿瘤细胞，作用范围广泛；基因是生命之本，是生物得以保持其连续性和稳定性的物质基础。采用编码特异抗原的基因直接注入人体，通过其在机体内的表达从而激发机体对编码抗原的免疫反应。能分泌细胞因子的转基因肿瘤细胞具有肿瘤疫苗作用，成为新型的肿瘤“疫苗”。研究发现，旁观者效应产生与自杀基因的种类、肿瘤细胞的类型及数量有关。针对抑癌基因治疗 替代或恢复由于缺失或突变而丢失的抑癌基因（Tumor suppressor gene
7、）的正常功能是肿瘤病因性治疗的手段而被世人所公认。研究发现在肿瘤发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可源于抗原递全细胞（APC）不能提供足够的共刺激信号（如B7）或者机体免疫因子分泌不足，在免疫性基因治疗中通过以下三种方法纠正机体免疫的耐受状态。将某些细胞因子（如IL2、TNFa等）的基因转染到机体免疫细胞（如TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞）中，大幅度提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力。自杀基因疗法中酶和前药应用癌胚抗原（CEA）制备的DNA疫苗在实验中显示出一定效果，研究的前景可观，进入临床药
8、理实验只是时间问题而毋庸置疑。研究发现，旁观者效应产生与自杀基因的种类、肿瘤细胞的类型及数量有关。选择性IgA缺乏患者血浆中IgA极低，而IgG、IgM与细胞免疫正常，组织中缺乏分泌IgA的浆细胞，约10%发生胃癌。当IgM缺乏时，约有8%患者发生恶性肿瘤以及淋巴网状恶性疾病。研究发现当患者免疫球蛋白很低，抗体产生受到严重影响时，临床上病人除了反复发生化脓性感染外，其患者发生恶性肿瘤率为810%，常见类型为淋巴网状系统肿瘤（56%）和胃肠道上皮癌（26%）。WiskottAldrich综合症（严重混合型免疫缺陷综合症）以血小板减少出血，反复感染为临床特征，早期细胞免疫完善，随之淋巴细胞减少，体
9、外淋转反应缺乏，病儿很少活过青春期，约810%发生淋巴网状系统肿瘤。原癌基因(前癌基因)细胞癌基因存在于细胞基因组内，激活前的细胞癌基因称为原癌基因(前癌基因)，一旦原癌基因激活成癌基因便会引起细胞癌变，癌基因激活后，通过其表达产物改变细胞生长和分化规律，诱发细胞癌变。研究发现在肿瘤发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可源于抗原递全细胞（APC）不能提供足够的共刺激信号（如B7）或者机体免疫因子分泌不足，在免疫性基因治疗中通过以下三种方法纠正机体免疫的耐受状态。目前人类已知的致癌物均为基因毒。胸腺发育不良（
10、Digeoges）综合症或咽囊综合症是因胸腺发育不良而导致细胞免疫系统停留在未分化阶段，这类患儿兼有细胞免疫缺陷和体液免疫缺陷的共济失调，恶性肿瘤的发生率高达10%。应用癌胚抗原（CEA）制备的DNA疫苗在实验中显示出一定效果，研究的前景可观，进入临床药理实验只是时间问题而毋庸置疑。后来，通过限制性内切酶片段长度多态分析及分子克隆技术的研究证实，正常细胞中有一类对细胞增殖起负性调节作用的基因，如大肠癌中的p53基因，视网膜母细胞瘤和骨肉瘤中的Rb基因。基因毒癌发生发展的第一步是活化致癌物，改变细胞内的DNA，导致原癌基因的移位及扩增，这些特殊基因的翻译，使带有这些异常基因细胞的某些特性得以专一
11、表达，一个特殊的化学物对一系列细胞有诱变及DNA修复作用者，称为基因毒。自杀基因疗法中酶和前药能分泌细胞因子的转基因肿瘤细胞具有肿瘤疫苗作用，成为新型的肿瘤“疫苗”。胸腺发育不良（Digeoges）综合症或咽囊综合症是因胸腺发育不良而导致细胞免疫系统停留在未分化阶段，这类患儿兼有细胞免疫缺陷和体液免疫缺陷的共济失调，恶性肿瘤的发生率高达10%。抑癌基因的存在从最初的一个发现中得到证实，即一个肿瘤细胞和一个正常细胞融合成的杂交细胞，往往不具有细胞表型，即使两种不同的肿瘤细胞杂交，也可能是非肿瘤性的，只有正常的亲代失去某些基因之后，其子代才会发生肿瘤。研究发现，旁观者效应产生与自杀基因的种类、肿瘤
12、细胞的类型及数量有关。v 1.2免疫性基因治疗的方法免疫性基因治疗的方法 研究发现在肿瘤发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可源于抗原递全细胞（APC）不能提供足够的共刺激信号（如B7）或者机体免疫因子分泌不足，在免疫性基因治疗中通过以下三种方法纠正机体免疫的耐受状态。肿瘤细胞存在功能性MHCI类抗原和共刺激信号表达不足，将一些与免疫识别有关的基因（如HLA、B7等）转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者体内;或者表达HLAB7的病毒载体或质粒DNA与脂质复合物直接注射到瘤体内，以大幅度增强肿瘤细
13、胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应而提高宿主的免疫监视功能和对肿瘤细胞的攻击能力，达到治愈率的提高具有积极作用。研究发现在肿瘤发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可源于抗原递全细胞（APC）不能提供足够的共刺激信号（如B7）或者机体免疫因子分泌不足，在免疫性基因治疗中通过以下三种方法纠正机体免疫的耐受状态。研究发现，旁观者效应产生与自杀基因的种类、肿瘤细胞的类型及数量有关。针对抑癌基因治疗 替代或恢复由于缺失或突变而丢失的抑癌基因（Tumor suppressor gene）的正常功能是肿瘤病因
14、性治疗的手段而被世人所公认。胸腺发育不良（Digeoges）综合症或咽囊综合症是因胸腺发育不良而导致细胞免疫系统停留在未分化阶段，这类患儿兼有细胞免疫缺陷和体液免疫缺陷的共济失调，恶性肿瘤的发生率高达10%。2 免疫性基因治疗的方法细胞癌基因被激活的途径很多，如启动子插人，基因重排和扩增，基因点突变和DNA分子中去甲基化等。采用编码特异抗原的基因直接注入人体，通过其在机体内的表达从而激发机体对编码抗原的免疫反应。v a.将某些细胞因子（如IL2、TNFa等）的基因转染到机体免疫细胞（如TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞）中，大幅度提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力。v 使用细胞因子的基
15、因治疗在一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次应用，副作用严重等缺点，疗效有较大幅度提高。可以这样认为肿瘤免疫细胞因子基因治疗的开展，为恶性肿瘤患者带来生的希望，其疗效的稳定，治疗的简单、安全，已成为肿瘤免疫基因治疗研究的最常用方法而独树一帜，前景是令业内人士振奋的。v b.肿瘤细胞存在功能性MHCI类抗原和共刺激信号表达不足，将一些与免疫识别有关的基因（如HLA、B7等）转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者体内;或者表达HLAB7的病毒载体或质粒DNA与脂质复合物直接注射到瘤体内，以大幅度增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应而提高宿主的免疫监视功能和对肿瘤
16、细胞的攻击能力，达到治愈率的提高具有积极作用。vc.制备肿瘤制备肿瘤KNA疫苗疫苗 采用编码特异抗原的基因直接注入人体，通过其在机体内的表达从而激发机体对编码抗原的免疫反应。应用癌胚抗原（CEA）制备的DNA疫苗在实验中显示出一定效果，研究的前景可观，进入临床药理实验只是时间问题而毋庸置疑。2 恶性肿瘤的病因性基因治疗 肿瘤病因性基因治疗主要针对癌基因和抑癌基因，其治疗策略是抑制、阻断癌基因的表达或替代，恢复抑癌基因的功能。从而达到治疗肿瘤的目的。v a.针对癌基因治疗 采用反义寡核苷酸、核酸、三链结构寡核苷酸（Triplexforming oligonucleotides，TFO）抑制肿瘤细
17、胞的基因转录，抑制癌基因的表达将有可能使肿瘤的基因表达调控回复到正常并使细胞重新分化或者诱发其凋亡（Apoptosis）。由于转条是遗传信息放大的过程，因此对癌基因的表达抑制来说更为有效，其治疗前景是极为乐观的。v b.针对抑癌基因治疗针对抑癌基因治疗 替代或恢复由于缺失或突变而丢失的抑癌基因（Tumor suppressor gene）的正常功能是肿瘤病因性治疗的手段而被世人所公认。利用抑癌基因治疗肿瘤，在体外的实验和实验治疗学中取得较好的疗效；但在体内由于肿瘤体积较大；内环境又十分复杂，基因转移率限制等因素的干扰，抑癌基因治疗的确切疗效不尽人意值得进一步研究。3 溶瘤腺病毒基因治疗 v a
18、.溶瘤腺病毒的特点具有复制性，因此所需病毒颗粒较小；能扩展至邻迈肿瘤细胞，作用范围广泛；溶瘤腺病毒可产生溶瘤和抗肿瘤免疫反应；溶瘤腺病毒由于能够复制故存在着不安全因素（转移、扩散、活化）对肿瘤患者造成损害而失去可控性应引起注意和警惕。v b.溶瘤腺病毒的主要分类利用肿瘤特异表达的调控序例的表达黑色素瘤表达酪氨酸酶，肝细胞癌表达甲胎蛋白（AFP），结直肠癌表达癌胚抗原（CEF）从而控制病毒复制。利用肿瘤细胞生物学特性，如腺病毒复制时抵抗宿主细胞凋亡可能相关的EIB55K蛋白发生变异或缺失时，病毒复制的宿主细胞就会发生凋亡，从而使复制不能完成。代表为E1B55K剔除的d11520（onyx015）
19、腺病毒，它能够在抑癌基因P53缺陷的肿瘤细胞中复制，从而达到裂鲜肿瘤细胞，同时又不损伤正常细胞的目的其特异的选择性十分明显。值得期待的是D11520和TH101病毒已进入III期临床试验。这时于癌症的预防的作用将产生深远的影响。4 自杀基因治疗 v一些来自病毒或细菌的基因具有一些特殊的功能，其表达产物可将原先对哺乳动物细胞无毒的或毒性极低的前药（Prodrug）转换成毒性产物，导致这些细胞的凋亡。这类基因即称为“自杀基因”（Suicide gene）由于自杀基因表达的产物多是能够将前药代谢为毒性产物的酶，故又称为“前药转换酶基因”或“药物敏感基因”。根据细胞自杀机制，将自杀基因作为治疗性目的基
20、因应用于肿瘤治疗的研究称为肿瘤的自杀基因方式。在临床实践中设计肿瘤细胞特异性自杀机制的基因治疗方案对肿瘤治疗具有重大的实际应用价值。v a.自杀基因疗法中酶和前药自杀基因疗法中酶和前药 v b.自杀基因的特异性控制v 要高效及特异性表达肿瘤自杀基因对肿瘤细胞的作用，自杀基因必须局现于肿瘤细胞以选择性杀伤肿瘤细胞。一是利用免疫脂质体，受体介导法进行定向基因转移或直接瘤内注射。二是利用肿瘤细胞生物学特性，通过逆转录病毒介导HSVTK基因（I型单纯疱疹病毒胸腺激酶）选择性治疗脑肿瘤。三是利用肿瘤特异表达的调控序例，如酪氨酸酶、甲胳蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA），在自杀基因的上游安插特异的转条调节
21、序例，可以实现自杀基因的特异表达，从而克服传统化学治疗药物作选择性问题和较为严重的细胞毒问题，使肿瘤治疗有较大幅度的进展。vc.旁观者效应（旁观者效应（Bystandereffect）用外源性自杀基因转染肿瘤细胞后，未能转染的肿瘤细胞可因邻近的少数肿瘤细胞携带有自杀基因而被前体药物杀伤。研究发现，旁观者效应产生与自杀基因的种类、肿瘤细胞的类型及数量有关。TK/GCV系统的旁观者效应是比较明显和突出的。三.常采用的基因治疗方法va.基因修饰肿瘤细胞基因修饰肿瘤细胞“疫苗疫苗”疗法疗法v将某些细胞因子基因如将某些细胞因子基因如IL2、IL4、TNF、INF、GMCSF等转染肿瘤细胞，可使肿瘤细胞表
22、等转染肿瘤细胞，可使肿瘤细胞表达活性细胞因子。转染细胞因子基因的肿瘤细胞基达活性细胞因子。转染细胞因子基因的肿瘤细胞基体内致瘤性丧失，耐动物预接肿这种转基因肿瘤细体内致瘤性丧失，耐动物预接肿这种转基因肿瘤细胞后，该动物对再接种的同种肿瘤有抵抗作用。能胞后，该动物对再接种的同种肿瘤有抵抗作用。能分泌细胞因子的转基因肿瘤细胞具有肿瘤疫苗作用，分泌细胞因子的转基因肿瘤细胞具有肿瘤疫苗作用，成为新型的肿瘤成为新型的肿瘤“疫苗疫苗”。这种肿瘤疫苗的作用机。这种肿瘤疫苗的作用机制是由于细胞因子表达后，一方面促进肿瘤表达特制是由于细胞因子表达后，一方面促进肿瘤表达特异抗原并诱发宿异抗原并诱发宿主抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞主抗肿瘤细胞毒性淋巴细胞(CTL)反应反应;另一方面分泌的细胞因子增强另一方面分泌的细胞因子增强CTL和其他抗癌和其他抗癌效应细胞的作用。效应细胞的作用。
