1、遗传性疾病与分子生物学诊断1遗传性疾病与分子生物学诊断2一、概述一、概述 基因基因 基因的遗传与变异基因的遗传与变异 变异的积累引起生物的多态性，生物得以发展和变异的积累引起生物的多态性，生物得以发展和进化。进化。变异通过遗传保守性传给下一代，造成遗传性疾变异通过遗传保守性传给下一代，造成遗传性疾病的发生。病的发生。人类的多数疾病与基因密切相关人类的多数疾病与基因密切相关 从基因水平探测、分析病因和疾病的发病机制，从基因水平探测、分析病因和疾病的发病机制，并采用针对性的手段矫正疾病紊乱状态，是基础并采用针对性的手段矫正疾病紊乱状态，是基础医学和临床医学新的研究方向。医学和临床医学新的研究方向。
2、遗传性疾病与分子生物学诊断3基因变异致病可分为两种主要类型：基因变异致病可分为两种主要类型：内源基因的变异内源基因的变异外源基因的入侵外源基因的入侵遗传性疾病与分子生物学诊断4内源基因的变异：内源基因的变异：由于先天遗传背景的差异和后天内、由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类基因结构及其表达的各个环节都外环境的影响，人类基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，而导致疾病。可能发生异常，而导致疾病。表达异常表达异常 基因结构突变基因结构突变遗传性疾病与分子生物学诊断5表达异常：表达异常：有些内源基因（如原癌基因）的表达异常则可能导有些内源基因（如原癌基因）的表达异常则可能导致细胞
3、增生失控而发生肿瘤或其他类型紊乱。致细胞增生失控而发生肿瘤或其他类型紊乱。基因结构突变：基因结构突变：点突变、缺失或插入突变、染色体易位、基因点突变、缺失或插入突变、染色体易位、基因重排，基因扩增等。重排，基因扩增等。突变若发生在生殖细胞，可能引起各种遗传性疾病；突变若发生在生殖细胞，可能引起各种遗传性疾病；若发生在体细胞，则可导致肿瘤、心血管疾病等。若发生在体细胞，则可导致肿瘤、心血管疾病等。遗传性疾病与分子生物学诊断6 外源基因的入侵：外源基因的入侵：如各种病原体感染人体后，如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。各
4、种疾病。遗传性疾病与分子生物学诊断7 由多基因以及环境因子的相互作用引起的疾病由多基因以及环境因子的相互作用引起的疾病 兔唇（唇裂）、腭裂、脊柱裂等，其子女兔唇（唇裂）、腭裂、脊柱裂等，其子女不患病的概率很高。不患病的概率很高。遗传病仅由夫妻一方的一个缺陷基因即可发生，遗传病仅由夫妻一方的一个缺陷基因即可发生，也就是显性遗传病。也就是显性遗传病。如镰状细胞贫血是一种直接危及生命的血液病，如镰状细胞贫血是一种直接危及生命的血液病，子女发病的可能性为子女发病的可能性为25 遗传性疾病与分子生物学诊断8 蛋白质变异（分子病）蛋白质变异（分子病）病症病症 血红蛋白血红蛋白 镰状红细胞病镰状红细胞病 珠
5、蛋白珠蛋白 珠蛋白生成障碍性贫血酶变异珠蛋白生成障碍性贫血酶变异 先天性代谢缺陷先天性代谢缺陷 已糖激酶已糖激酶 已糠激酶缺乏型溶血性贫血已糠激酶缺乏型溶血性贫血 半乳糖半乳糖-1-1-磷酸尿苷转移酶磷酸尿苷转移酶 半乳糖血症半乳糖血症 酪氨酸酶酪氨酸酶 白白化病化病 磷酸化酶激酶磷酸化酶激酶 糖原糖原贮积症贮积症 -葡萄苷酸酶葡萄苷酸酶 -葡葡糖苷酸酶缺乏症糖苷酸酶缺乏症 苯丙氨酸羟化酶苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮苯丙酮尿症尿症 黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶 黄嘌黄嘌呤尿症（或痛风）呤尿症（或痛风）遗传性疾病与分子生物学诊断9二、基因诊断的概念和特点二、基因诊断的概念和特点 1 1基因诊断概念：基因诊
6、断概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。2 2、基因诊断的特点：、基因诊断的特点：以基因作为检查材料和探查目标，以基因作为检查材料和探查目标，针对性强。针对性强。分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具有很分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具有很高的特高的特异性异性。由于分子杂交和聚合酶链反应由于分子杂交和聚合酶链反应(PCR)(PCR)技术都具有放大效应，技术都具有放大效应，故诊断故诊断灵敏度很高灵敏度很高
7、。适用性强适用性强，诊断范围广。检测目标可为内源基因也可为外源，诊断范围广。检测目标可为内源基因也可为外源基因。基因。遗传性疾病与分子生物学诊断10三、基因诊断的常用技术方法三、基因诊断的常用技术方法（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交原理：原理：核酸分子杂交是指具有一定互补序列的核酸单链在核酸分子杂交是指具有一定互补序列的核酸单链在液相或固液体系中按碱基互补配对的原则缔合成异质双链液相或固液体系中按碱基互补配对的原则缔合成异质双链的过程。的过程。应用此技术可对特定应用此技术可对特定DNADNA或或RNARNA序列进行定性或定量检测。序列进行定性或定量检测。已知序列的已知序列的DNADNA或或
8、RNARNA片段（探针）片段（探针）待检测的待检测的DNADNA或或RNARNA遗传性疾病与分子生物学诊断11建立在核酸分子杂交技术基础上的常用基因诊断方法有：建立在核酸分子杂交技术基础上的常用基因诊断方法有：（1 1）限制性内切酶酶谱分析法：）限制性内切酶酶谱分析法：利用限制性内切酶和特异性利用限制性内切酶和特异性DNADNA探针来检测是否存在基探针来检测是否存在基因变异。因变异。当待测当待测DNADNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态(片段的片段的大小或多少大小或多少
9、)在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。出分析诊断。遗传性疾病与分子生物学诊断12镰状细胞贫血是镰状细胞贫血是珠蛋白基因第六个密码子发生单个碱基突变珠蛋白基因第六个密码子发生单个碱基突变(AT)，谷氨酸被缬氨酸，谷氨酸被缬氨酸取代所致。由于这一突变而使该基因内部一个取代所致。由于这一突变而使该基因内部一个Mst限制酶位点丢失。因此，将正常限制酶位点丢失。因此，将正常人和带有突变基因个体的基因组人和带有突变基因个体的基因组DNA用用Mst消化后，与消化后，与珠蛋白基因探针杂交。珠蛋白基因探针杂交。遗传性疾病与分子生物学诊断13（2 2）DNADNA限
10、制性片段长度多态性分析（限制性片段长度多态性分析（RFLPRFLP）：）：DNADNA多态性：多态性：在人类基因组中，平均约在人类基因组中，平均约200200对碱基可发生一对对碱基可发生一对变异变异(称为中性突变称为中性突变)，中性突变导致个体间核苷酸序列的差，中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。异。限制性片段长度多态性：限制性片段长度多态性：不少不少DNADNA多态性发生在限制性内切多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该酶识别位点上，酶解该DNADNA片段就会产生长度不同的片段。片段就会产生长度不同的片段。RFLPRFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致按孟德尔方式遗传，在
11、某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可用这一多态性片病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可用这一多态性片段作为一种段作为一种“遗传标志遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。病基因的携带者。遗传性疾病与分子生物学诊断14（3 3）等位基因特异寡核苷酸探针杂交法）等位基因特异寡核苷酸探针杂交法(ASO)(ASO)根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针成两种寡核苷酸探针:一种是相应于一种是相应于突变基因突变基因碱基序列的寡核苷酸碱基序列的寡核苷酸(M)(M)，一种是相应
12、于一种是相应于正常基因正常基因碱基序列的寡核苷酸碱基序列的寡核苷酸(N)(N)。遗传性疾病与分子生物学诊断15若受检者若受检者DNADNA能与能与M M杂交，而不能与杂交，而不能与N N杂交，说明杂交，说明受检者是这种突变的纯合子；受检者是这种突变的纯合子；若受检者若受检者 DNADNA既能与既能与M M结合，又能与结合，又能与N N结合，说结合，说明受检者是这种突变基因的杂合子；明受检者是这种突变基因的杂合子；若受检者若受检者 DNADNA不能与不能与M M结合，但能与结合，但能与N N结合，表结合，表明受检者不存在这种突变基因；明受检者不存在这种突变基因；患者患者DNADNA和和M M、N
13、 N均不结合，提示其缺陷基因可能均不结合，提示其缺陷基因可能是一种新的突变类型。是一种新的突变类型。遗传性疾病与分子生物学诊断16（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应（PCRPCR）PCRPCR技术采用特异性的引物，能特异性地扩增技术采用特异性的引物，能特异性地扩增出目的出目的DNADNA片段。片段。根据待测基因两端的根据待测基因两端的DNADNA顺序设计出一对引物，顺序设计出一对引物，经经PCRPCR反应将目的基因片段扩增出来，即可进反应将目的基因片段扩增出来，即可进一步分析判断致病基因的存在与否，并了解其一步分析判断致病基因的存在与否，并了解其变异的形式。变异的形式。遗传性疾病与分子生物学
14、诊断17利用利用DNADNA缺失突变区域两侧缺失突变区域两侧5“5“和和33端引物进行端引物进行PCRPCR扩扩增，再通过凝胶电泳观察扩增增，再通过凝胶电泳观察扩增DNADNA片段的大小，可诊断片段的大小，可诊断中等程度的中等程度的DNADNA片段片段(0(05 51 15 kb)5 kb)的突变；的突变；用多对用多对PCRPCR引物同时进行引物同时进行PCRPCR的的多重多重PCRPCR技术技术，可同时对，可同时对某一特定基因的不同某一特定基因的不同 DNADNA区域进行缺失诊断。区域进行缺失诊断。DNADNA指纹技术：指纹技术：检测的是基因组检测的是基因组DNADNA中存在的中存在的一类特
15、殊的数目可变串联重复多态性（一类特殊的数目可变串联重复多态性（VNTRVNTR）。）。遗传性疾病与分子生物学诊断18PCRPCR单链构象多态性分析单链构象多态性分析(SSCP)(SSCP)：PCRPCR产物变性后，产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，可分析确定致病基因的存在。位置不同，可分析确定致病基因的存在。相同长度的单链相同长度的单链DNADNA因其碱基序列不同，甚至单个碱基因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在电泳时泳不同，都可能形成不同的空间构象，从而在电泳时泳动速率不同。动速率
16、不同。遗传性疾病与分子生物学诊断19Leber遗传性神经病患者是由于线粒体遗传性神经病患者是由于线粒体DNA第第11778位碱基位碱基(GA)突变突变所致。用所致。用PCR扩增线粒体扩增线粒体DNA相应片段，再作相应片段，再作SSCP分析。分析。遗传性疾病与分子生物学诊断20PCRPCRASOASO法、法、PCRPCRSSCPSSCP法、法、PCR/RFLPPCR/RFLP法、法、PCRPCR限制酶谱法的联合应用可省去繁琐的杂交步限制酶谱法的联合应用可省去繁琐的杂交步骤，避免了放射污染，直接从电泳凝胶上即可骤，避免了放射污染，直接从电泳凝胶上即可读出结果。读出结果。遗传性疾病与分子生物学诊断2
17、1（三）基因测序（三）基因测序分离出患者的有关基因，测定出其碱基排列顺序，找出其变异所在，这分离出患者的有关基因，测定出其碱基排列顺序，找出其变异所在，这是是最为确切的基因诊断方法最为确切的基因诊断方法。基因芯片基因芯片以上检测方法以上检测方法DNADNA诊断诊断遗传性疾病与分子生物学诊断22RNARNA诊断：诊断：以以mRNAmRNA为检测对象的诊断方法为检测对象的诊断方法。RNARNA诊断通过对待测基因的转录产物进行定性、定诊断通过对待测基因的转录产物进行定性、定量分析，可确定其剪接、加工的缺陷及外显子的量分析，可确定其剪接、加工的缺陷及外显子的变异；变异；常用的方法：常用的方法：RNAR
18、NA斑点杂交斑点杂交 NorthernNorthern分析分析 定量逆转录定量逆转录PCRPCR等等遗传性疾病与分子生物学诊断23四、遗传性疾病及基因诊断四、遗传性疾病及基因诊断遗传性疾病与分子生物学诊断24case 一一2525岁地中海地区女性怀孕岁地中海地区女性怀孕1212周，首次产前检查，此次为首次妊娠，周，首次产前检查，此次为首次妊娠，主要关心胎儿发生其家族遗传的主要关心胎儿发生其家族遗传的“血液血液”疾病的风险。病人有轻度贫疾病的风险。病人有轻度贫血史，其兄弟严重贫血，需要经常输血，血史，其兄弟严重贫血，需要经常输血，1010岁时死亡。内科医生告诉岁时死亡。内科医生告诉其贫血不需要补
19、充铁，否认有任何的贫血症状。其贫血不需要补充铁，否认有任何的贫血症状。体检：符合体检：符合1212周妊娠，血红蛋白显示低血红蛋白、小红细胞贫血周妊娠，血红蛋白显示低血红蛋白、小红细胞贫血（9g/dl)9g/dl)，电泳显示血红蛋白，电泳显示血红蛋白A2A2增高（增高（4.0%4.0%）和致命性血红蛋白增高，）和致命性血红蛋白增高，符合轻度的符合轻度的地中海贫血症。绒毛膜取样检测胎儿是否受影响。地中海贫血症。绒毛膜取样检测胎儿是否受影响。遗传性疾病与分子生物学诊断25（一）血红蛋白分子病（一）血红蛋白分子病 血红蛋白异常导致的分子病血红蛋白异常导致的分子病_珠蛋白结构珠蛋白结构基因的基因的DNA
20、DNA分子结构异常所致。分子结构异常所致。血红蛋白由四种珠蛋白肽链组成，它们分别是血红蛋白由四种珠蛋白肽链组成，它们分别是、和和肽链，由它们不同的组合组成各种血肽链，由它们不同的组合组成各种血红蛋白。除红蛋白。除肽链的基因位于肽链的基因位于1616号染色体外，其号染色体外，其余余、肽链的基因连锁在肽链的基因连锁在1111号染色体。号染色体。遗传性疾病与分子生物学诊断26 正常人的血红蛋白有三种：正常人的血红蛋白有三种：（1 1）HbAHbA（2222）：由）：由2 2条条链与链与2 2条条链组成，链组成，占血红蛋白总量的占血红蛋白总量的9595以上；以上；（2 2）HbA2HbA2（2222）
21、：由）：由2 2条条链与链与2 2条条链组成，链组成，占血红蛋白总量的占血红蛋白总量的2 233 ；（3 3）HbFHbF（2222）：由）：由2 2条条链与链与2 2条条链，占链，占血红蛋白总量的血红蛋白总量的1 1左右。左右。遗传性疾病与分子生物学诊断27 分类：分类：异常血红蛋白病：异常血红蛋白病：表现为珠蛋白肽链结构改变，主要由表现为珠蛋白肽链结构改变，主要由于突变导致重要功能部位的氨基酸的置换，影响血红蛋白于突变导致重要功能部位的氨基酸的置换，影响血红蛋白溶解度，稳定性及生物学功能；溶解度，稳定性及生物学功能；地中海贫血：地中海贫血：特征是珠蛋白肽链合成速度降低，导致特征是珠蛋白肽链
22、合成速度降低，导致链和非链和非链合成不平衡，结果多余的珠蛋白链沉积在红细链合成不平衡，结果多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上改变膜通透性和硬度，导致溶血性贫血。胞膜上改变膜通透性和硬度，导致溶血性贫血。遗传性疾病与分子生物学诊断28 一类由于一类由于常染色体遗传性缺陷常染色体遗传性缺陷，引起珠蛋白链合成障，引起珠蛋白链合成障碍，使一种或几种珠蛋白数量不足或完全缺乏，从而导致碍，使一种或几种珠蛋白数量不足或完全缺乏，从而导致红细胞被溶解破坏的溶血性疾病。红细胞被溶解破坏的溶血性疾病。本病呈世界性分布，最早发现于地中海地区，最多见本病呈世界性分布，最早发现于地中海地区，最多见于地中海区域、中东地区、印
23、度以及东南亚。我国则以广于地中海区域、中东地区、印度以及东南亚。我国则以广东、广西、贵州、四川为多，尤常见于苗、瑶、黎、壮等东、广西、贵州、四川为多，尤常见于苗、瑶、黎、壮等少数民族。少数民族。地中海贫血地中海贫血遗传性疾病与分子生物学诊断29遗传方式遗传方式 地中海贫血的遗传与性别无关，男胎女胎发病机率均等。地中海贫血的遗传与性别无关，男胎女胎发病机率均等。夫妇双方若同为轻型地贫（即地贫基因携带者），怀孕夫妇双方若同为轻型地贫（即地贫基因携带者），怀孕以后，对子代的遗传几率是：以后，对子代的遗传几率是：1/41/4为正常胎儿，为正常胎儿，1/21/2为为轻型地贫（同父母一样），而轻型地贫（同
24、父母一样），而1/41/4为重型地贫患者。为重型地贫患者。遗传性疾病与分子生物学诊断30遗传性疾病与分子生物学诊断31 如第如第1616号染色体号染色体珠蛋白基因完全失效，珠蛋白基因完全失效，链合成完全缺失称链合成完全缺失称00地贫（或称地贫（或称地贫地贫1 1）尚有部分尚有部分链合成的称为链合成的称为+地贫（或称地贫（或称地贫地贫2 2）组合成的不同综合症：组合成的不同综合症：00地贫基因纯合子（地贫基因纯合子（00地地/0/0地）完全不能合成地）完全不能合成链，而合链，而合成成Hb Barts(4)Hb Barts(4)导致死胎或新生儿死亡，称为导致死胎或新生儿死亡，称为BartsBart
25、s水肿水肿胎儿胎儿；00地贫与地贫与+地贫基因双重杂合子（地贫基因双重杂合子（00地地/+/+地），只有少地），只有少量量链合成，多余的链合成，多余的链聚合为链聚合为HbH(4)HbH(4)称为称为HbHHbH病病。地贫地贫遗传性疾病与分子生物学诊断32 第第1111号染色体的号染色体的珠蛋白基因完全不能珠蛋白基因完全不能链称链称00地贫地贫 能合成部分能合成部分链的称链的称+地贫地贫00地贫基因纯合子（地贫基因纯合子（00地地/0/0地）以及地）以及00地贫地贫与与+地贫基因双重杂合子（地贫基因双重杂合子（00地地/+/+地）都表地）都表现为严重的溶血地贫的症状。现为严重的溶血地贫的症状。地
26、贫地贫遗传性疾病与分子生物学诊断33发病的分子基础发病的分子基础1)1)基因缺失：基因缺失：珠蛋白的基因缺失所致珠蛋白的基因缺失所致地贫，地贫，已发现已发现2020多种，由于缺失的基因及部位的不同多种，由于缺失的基因及部位的不同可导致不同珠蛋白链合成异常和不同类型的地可导致不同珠蛋白链合成异常和不同类型的地贫。贫。如缺失如缺失22和和11基因基因3.7Kb3.7Kb片段，称片段，称为右侧缺失型，缺失为右侧缺失型，缺失22基因及其周围区域的一基因及其周围区域的一个个4.2Kb4.2Kb片段，称为左侧缺失型。片段，称为左侧缺失型。(2(2基因排列基因排列在左，在左，11基因排列在右）。基因排列在右
27、）。遗传性疾病与分子生物学诊断342)2)单个碱基替代：单个碱基替代：分为两类分为两类生成极不稳定的异常血红蛋白：生成极不稳定的异常血红蛋白：其结果异常其结果异常链迅速降解，珠蛋白链的净生成实际上等链迅速降解，珠蛋白链的净生成实际上等于于0 0。如如Hb Indianapolis 112Hb Indianapolis 112半胱氨酸（半胱氨酸（TGTTGT）精氨酸（精氨酸（CGTCGT）;或者妨碍或者妨碍HbHb四聚体的生成，导致四聚体的生成，导致+地贫，如地贫，如Hb Quong Sze HbHb Quong Sze Hb广西，广西，125125亮氨酸（亮氨酸（CTGCTG）脯氨酸（脯氨酸（
28、CCGCCG）。遗传性疾病与分子生物学诊断35珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA前体加工缺陷：前体加工缺陷：A A、在靠近内含子的、在靠近内含子的编码区编码区若发生碱基替代，往往改变若发生碱基替代，往往改变mRNAmRNA前体分前体分子被剪接酶识别的部位，导致子被剪接酶识别的部位，导致mRNAmRNA前体加工为前体加工为mRNAmRNA的过程迟缓，的过程迟缓，甚至加工无效，甚至加工无效，如异常血红蛋白如异常血红蛋白Hb E26Hb E26谷氨酸（谷氨酸（GAGGAG）赖氨酸（赖氨酸（AAGAAG）B B、有些地中海贫血基因的碱基替代发生、有些地中海贫血基因的碱基替代发生在内含子在内含子，使，使mRN
29、AmRNA剪接加剪接加工发生缺陷，形成异常的工发生缺陷，形成异常的mRNAmRNA，导致，导致+地贫。地贫。遗传性疾病与分子生物学诊断36 3 3）移码突变：）移码突变：由于碱基的插入或缺失，造成编码由于碱基的插入或缺失，造成编码区阅读框的移位，形成不成熟的终止密码子，如区阅读框的移位，形成不成熟的终止密码子，如中国人常见的突变类型中国人常见的突变类型Codon 41/42(-Codon 41/42(-4bp),Codon 71/72(+A)4bp),Codon 71/72(+A)等，均可导致等，均可导致00地贫。地贫。4 4）无义突变：）无义突变：指正常的密码子变为终止密码子，指正常的密码子
30、变为终止密码子，肽链合成提前终止，例如肽链合成提前终止，例如Codon 17 AAGCodon 17 AAG（赖氨酸）（赖氨酸）UAGUAG（终止密码），导致（终止密码），导致00地贫。地贫。遗传性疾病与分子生物学诊断37 5 5）终止密码的突变和融合基因：）终止密码的突变和融合基因：由于终止密码突变生成肽由于终止密码突变生成肽链延长的异常血红蛋白链延长的异常血红蛋白Hb Constant Spring Hb Constant Spring 等，均表现为等，均表现为+地贫，其分子机制是因为异常地贫，其分子机制是因为异常基因转录得到的基因转录得到的mRNAmRNA不不稳定，导致稳定，导致链合成减
31、少，表现为链合成减少，表现为+地贫。地贫。减数分裂时不同珠蛋白肽链的基因之间发生不等交换，结减数分裂时不同珠蛋白肽链的基因之间发生不等交换，结果造成某一珠蛋白基因同时融合两种不同珠蛋白基因的部果造成某一珠蛋白基因同时融合两种不同珠蛋白基因的部分碱基，由此合成含有两种不同珠蛋白的氨基酸序列。分碱基，由此合成含有两种不同珠蛋白的氨基酸序列。遗传性疾病与分子生物学诊断38由基因重排引起的两种地中海贫血基因型：由基因重排引起的两种地中海贫血基因型：遗传性疾病与分子生物学诊断39临床表现临床表现最轻者：最轻者：终身不贫血，无症状终身不贫血，无症状轻者：轻者：多无自觉症状而不易察觉，常因体检时发现轻度贫血
32、多无自觉症状而不易察觉，常因体检时发现轻度贫血或家系分析时才诊断。或家系分析时才诊断。介于这两者之间的贫血患者介于这两者之间的贫血患者（临床多见）：具有低色素小红（临床多见）：具有低色素小红细胞和靶形红细胞，并有血红蛋白成分的各种改变。细胞和靶形红细胞，并有血红蛋白成分的各种改变。重型：重型：多生长发育不良，常在成年前死亡。多生长发育不良，常在成年前死亡。遗传性疾病与分子生物学诊断40临床表现临床表现BartsBarts水肿胎水肿胎：常于怀孕中期开始发病，表现为胎儿全身水肿，心脏畸：常于怀孕中期开始发病，表现为胎儿全身水肿，心脏畸形，体腔积液，胎盘巨大而水肿，多于怀孕晚期死于宫内。即使能怀形，
33、体腔积液，胎盘巨大而水肿，多于怀孕晚期死于宫内。即使能怀孕至足月，也多于出生后数分钟内死亡，而且孕妇常合并妊高征，胎孕至足月，也多于出生后数分钟内死亡，而且孕妇常合并妊高征，胎盘早剥，子痫抽搐，产时或产后大出血等产科危重并发症。盘早剥，子痫抽搐，产时或产后大出血等产科危重并发症。遗传性疾病与分子生物学诊断41临床表现临床表现血红蛋白血红蛋白H H病：病：与重型与重型地贫表现相似或贫血症状稍轻，这地贫表现相似或贫血症状稍轻，这两类地贫在胎儿期无特殊临床表现，可以怀孕至足月分娩，两类地贫在胎儿期无特殊临床表现，可以怀孕至足月分娩，出生时与正常胎儿几无分别，多于生后出生时与正常胎儿几无分别，多于生后
34、6 6个月左右开始发病。个月左右开始发病。表现为进行性溶血性贫血，血色素可低至表现为进行性溶血性贫血，血色素可低至2-4g/dl2-4g/dl，肝脾肿，肝脾肿大，脸色萎黄，苍白无力。大，脸色萎黄，苍白无力。遗传性疾病与分子生物学诊断42基因诊断基因诊断 1 1）地中海贫血地中海贫血 DNADNA诊断：诊断：应用应用珠蛋白珠蛋白DNADNA探针，藉探针，藉核酸分子杂交技术，核酸分子杂交技术，根据杂根据杂交率便能测出胎儿交率便能测出胎儿-珠蛋白基因缺失程度（用羊水细胞提取液，可作珠蛋白基因缺失程度（用羊水细胞提取液，可作产前诊断）。产前诊断）。用用DNADNA限制性内切酶谱分析技术限制性内切酶谱分
35、析技术，即用内切酶消化羊水，即用内切酶消化羊水细胞细胞DNADNA，观察酶切图谱上，观察酶切图谱上特异的特异的DNADNA片段的大小、有无，便可鉴定片段的大小、有无，便可鉴定-珠蛋白的基因缺失情况。珠蛋白的基因缺失情况。PCR+DNAPCR+DNA测序可鉴别测序可鉴别22或或11基因的缺失。基因的缺失。RNARNA诊断：诊断：RT-PCRRT-PCR技术，对技术，对-珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA含量进行定量测定，可以鉴含量进行定量测定，可以鉴别各种类型别各种类型地贫。地贫。遗传性疾病与分子生物学诊断43 2 2）地中海贫血地中海贫血 DNADNA诊断：诊断：由于基因点突变或个别碱基的丢失或由于
36、基因点突变或个别碱基的丢失或插入，这些突变往往不涉及限制性内切酶识别位插入，这些突变往往不涉及限制性内切酶识别位点，所以一般不用点，所以一般不用DNADNA点杂交（硝酸纤维膜上进行点杂交（硝酸纤维膜上进行杂交）或限制性酶谱分析。杂交）或限制性酶谱分析。遗传性疾病与分子生物学诊断44 2 2）地中海贫血地中海贫血 DNADNA诊断诊断主要应用：主要应用：PCR/ASOPCR/ASO探针法：探针法：即应用扩增即应用扩增DNADNA片段后直接与相应寡核苷酸探针片段后直接与相应寡核苷酸探针杂交即可杂交即可明确诊断突变的纯合子和杂合子明确诊断突变的纯合子和杂合子。等位基因特异扩增法：等位基因特异扩增法：
37、一种非放射性核素非内切酶的直接检测已一种非放射性核素非内切酶的直接检测已知点突变的基因分析法，尤知点突变的基因分析法，尤适用于适用于地贫高发区的筛选。地贫高发区的筛选。PCR/RFLPPCR/RFLP连锁分析法：连锁分析法：适用于适用于地贫的产前诊断地贫的产前诊断，利用，利用HgiA1HgiA1消化，消化，具多态位点的扩增具多态位点的扩增DNADNA可以被切割成可以被切割成65+45bp65+45bp两片段，然后在家庭两片段，然后在家庭进行进行RFLPRFLP分析，父母均具分析，父母均具110/65+45bp110/65+45bp，患儿，患儿110bp110bp，胎儿有，胎儿有65+45bp6
38、5+45bp则可诊断为正常。则可诊断为正常。遗传性疾病与分子生物学诊断45 2 2）地中海贫血地中海贫血 RNARNA诊断：诊断：珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA含量测定。用含量测定。用RT-PCRRT-PCR技术进技术进行行珠蛋白定量可诊断珠蛋白定量可诊断00地贫，地贫，+地贫，而且地贫，而且可检测可检测地贫杂合子。地贫杂合子。遗传性疾病与分子生物学诊断46 3 3）异常血红蛋白病）异常血红蛋白病：DNADNA诊断：诊断：HbD PunjabHbD Punjab是我国常见的异常血红蛋白病，其血是我国常见的异常血红蛋白病，其血红蛋白红蛋白链链121121位密码子由位密码子由GAAGAA（谷氨酸）（
39、谷氨酸）CAACAA（谷氨酰（谷氨酰胺），改变胺），改变EcoR1EcoR1的一个识别位点，应用的一个识别位点，应用PCRPCR的直接限制性的直接限制性酶谱分析即可诊断（正常酶谱分析即可诊断（正常40+104bp40+104bp；杂合子；杂合子144/104+144/104+40 bp40 bp；纯合子；纯合子144 bp144 bp）。）。RNARNA诊断：诊断：珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA的的RT-PCRRT-PCR直接序列测定可准确鉴定出直接序列测定可准确鉴定出基因编码区的碱基变化，进而推导出肽链中相应氨基酸的基因编码区的碱基变化，进而推导出肽链中相应氨基酸的改变。改变。遗传性疾病与分子
40、生物学诊断47二、先天性代谢缺陷病二、先天性代谢缺陷病 遗传性疾病与分子生物学诊断48（一）苯丙酮尿症（一）苯丙酮尿症 巨额的人生成本巨额的人生成本 特别烹制却难称美味的饮食特别烹制却难称美味的饮食 美食是侵害他们智力发育的毒药美食是侵害他们智力发育的毒药遗传性疾病与分子生物学诊断49 苯丙酮尿症（苯丙酮尿症（PKU）因患者尿中含大量苯丙酮酸）因患者尿中含大量苯丙酮酸而得名。而得名。病因是患者肝缺乏病因是患者肝缺乏苯丙氨酸羟化酶苯丙氨酸羟化酶，使由食物摄，使由食物摄入体内的苯丙酮酸不能正常代谢为酪氨酸。入体内的苯丙酮酸不能正常代谢为酪氨酸。大量的苯丙氨酸使旁路代谢活跃，经苯丙氨酸转大量的苯丙氨
41、酸使旁路代谢活跃，经苯丙氨酸转氨酶作用生成苯丙酮酸。氨酶作用生成苯丙酮酸。遗传性疾病与分子生物学诊断50遗传性疾病与分子生物学诊断51遗传性疾病与分子生物学诊断52PKUPKU的分子基础的分子基础 迄今约迄今约3/43/4的导致中国人典型的导致中国人典型PKUPKU的基因突变已查明，由的基因突变已查明，由1111种不同的种不同的PAHPAH基因点突变，致基因点突变，致PAHPAH活力下降或丧失。活力下降或丧失。中国人中国人PKUPKU突变类型突变类型：外显子部位外显子部位 突变型突变型 频率频率 3 CGA(Arg111)UGA(Ter)3 CGA(Arg111)UGA(Ter)10.0 10
42、.0 5 TTT(Phe161)TCT(Cys)5 TTT(Phe161)TCT(Cys)1.01.0 6 TAT(Tyr104)TGT(Lys)6 TAT(Tyr104)TGT(Lys)14.014.0 7 CGA(Arg243)CAA(Gln)7 CGA(Arg243)CAA(Gln)14.0 14.0 10 TGG(Trp326)TAG(Ter)10 TGG(Trp326)TAG(Ter)2.02.0 11 TAG(Tyr356)TAA(Ter)11 TAG(Tyr356)TAA(Ter)7.07.0 12 CGC(Arg413)CCC(Pro)12 CGC(Arg413)CCC(Pro
43、)9.09.0遗传性疾病与分子生物学诊断53遗传性疾病与分子生物学诊断54基因诊断基因诊断 基因诊断和产前诊断主要采用基因诊断和产前诊断主要采用DNADNA分析分析 如如PCR/ASOPCR/ASO探针法（可明确诊断突变的纯合子和杂探针法（可明确诊断突变的纯合子和杂合子）和合子）和PCR/RFLPPCR/RFLP连锁分析法。连锁分析法。如待测如待测PKUPKU家系基因突变类型未知或无家系基因突变类型未知或无RFLPRFLP信息，信息，可采用可采用PCR-SSCPPCR-SSCP技术（技术（PCRPCR扩增扩增DNADNA多态性位点周多态性位点周围的片段，进行单链构象多态性围的片段，进行单链构象
44、多态性SSCPSSCP）分析。）分析。遗传性疾病与分子生物学诊断55正常与突变苯丙氨酸羟化酶探针与正常与突变苯丙氨酸羟化酶探针与PKUPKU家系成员的家系成员的DNADNA杂交结果两个探针杂交结果两个探针分别与分别与PKUPKU家系成员的家系成员的DNADNA杂交，证实与正常探针杂交者为正常个体，与杂交，证实与正常探针杂交者为正常个体，与突变探针杂交者为患者，同时可与两个探针杂交者为正常个体，但携带突变探针杂交者为患者，同时可与两个探针杂交者为正常个体，但携带突变基因。此法已成功用于产前诊断突变基因。此法已成功用于产前诊断遗传性疾病与分子生物学诊断56HindIII 遗传性疾病与分子生物学诊断
45、57 本病属常染色体隐形遗传本病属常染色体隐形遗传 主要临床特征主要临床特征：智能低下智能低下、精神神经症状、湿疹、精神神经症状、湿疹皮肤抓痕征及色素减少和鼠气味等。皮肤抓痕征及色素减少和鼠气味等。如果能得到早期诊断和早期治疗，则前述临床表如果能得到早期诊断和早期治疗，则前述临床表现可不发生，脑电图异常也可得到恢复。现可不发生，脑电图异常也可得到恢复。低苯丙氨酸饮食疗法是目前治疗经典型低苯丙氨酸饮食疗法是目前治疗经典型PKUPKU的惟一的惟一方法，治疗的目的是预防脑损伤。方法，治疗的目的是预防脑损伤。遗传性疾病与分子生物学诊断58遗传性疾病与分子生物学诊断59遗传性疾病与分子生物学诊断60（二
46、）嘌呤代谢紊乱与痛风（二）嘌呤代谢紊乱与痛风 遗传性疾病与分子生物学诊断61（二）嘌呤代谢紊乱与痛风（二）嘌呤代谢紊乱与痛风 健康成年男子每天约生成尿酸健康成年男子每天约生成尿酸600-700mg600-700mg，其中，其中6060-70-70经肾排出，剩余约经肾排出，剩余约200mg200mg排入肠道由细菌降解。体内尿酸池排入肠道由细菌降解。体内尿酸池维持在维持在1200mg1200mg尿酸水平。尿酸水平。肾排出尿酸的机制是由于尿酸分子量小（肾排出尿酸的机制是由于尿酸分子量小（168u168u），可全部），可全部经肾小球滤过，但至少有经肾小球滤过，但至少有9898被近曲小管重吸收，再经远被
47、近曲小管重吸收，再经远曲小管主动分泌。曲小管主动分泌。肾每天约排出尿酸肾每天约排出尿酸400-500mg400-500mg（2.4-3.0mmol/L2.4-3.0mmol/L），相当于），相当于肾小球原滤液中含尿酸的肾小球原滤液中含尿酸的4 4-5-5。遗传性疾病与分子生物学诊断62 在血清尿酸浓度超过尿酸盐的溶解度时，就有可能尿酸钠在血清尿酸浓度超过尿酸盐的溶解度时，就有可能尿酸钠的针状结晶沉淀于关节、肌腱、韧带、肾锥体的间质组织的针状结晶沉淀于关节、肌腱、韧带、肾锥体的间质组织等软组织。等软组织。足够数量的尿酸盐结晶可引起急性炎症反应，如沉积于关足够数量的尿酸盐结晶可引起急性炎症反应，如
48、沉积于关节腔，形成节腔，形成急性关节炎急性关节炎尿酸盐结晶被白细胞吞噬尿酸盐结晶被白细胞吞噬后，破坏溶酶体膜，使膜内酶释放损伤白细胞和周围组织，后，破坏溶酶体膜，使膜内酶释放损伤白细胞和周围组织，引起关节炎症状。引起关节炎症状。表现为关节剧烈疼痛，反复发作表现为关节剧烈疼痛，反复发作痛风痛风（goutgout）。）。痛风石痛风石沉积于软组织的结晶沉积于软组织的结晶 痛风结节痛风结节周围发生炎症反应周围发生炎症反应遗传性疾病与分子生物学诊断63 原发痛风原发痛风可由于遗传所致的核苷酸代谢中可由于遗传所致的核苷酸代谢中次黄嘌次黄嘌呤呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRTHGPR
49、T）缺失所致，缺失所致，部分缺失时，临床表现为尿酸过多的痛风特征；部分缺失时，临床表现为尿酸过多的痛风特征；当完全缺失时，表现为高尿酸血症、精神发育迟当完全缺失时，表现为高尿酸血症、精神发育迟缓等特征的自毁容貌综合征。缓等特征的自毁容貌综合征。遗传性疾病与分子生物学诊断64 HGPRTHGPRT蛋白质分子为相同亚基的四聚体。蛋白质分子为相同亚基的四聚体。HG-PRTHG-PRT基因定位于基因定位于X X染色体长臂远端，因此该病表染色体长臂远端，因此该病表现为现为X X连锁连锁。HGPRTHGPRT基因基因有许多突变类型有许多突变类型：点突变：如有的点突变：如有的109109位丝氨酸被亮氨酸代位
50、丝氨酸被亮氨酸代替，有的替，有的103103位丝氨酸被精氨酸代替，位丝氨酸被精氨酸代替，19831983年年WilsonWilson等发现一例等发现一例DNADNA上的上的TagITagI限制性内切酶的切限制性内切酶的切点发生突变，而失去酶切作用。点发生突变，而失去酶切作用。基因发生缺失、重排：严重发病患者。基因发生缺失、重排：严重发病患者。遗传性疾病与分子生物学诊断65 继发性痛风继发性痛风 病因可能有大量服用葡萄糖、果糖与甘露糖，使体内嘌呤病因可能有大量服用葡萄糖、果糖与甘露糖，使体内嘌呤合成增加；合成增加；多发性骨髓瘤、红细胞增多症、恶性贫血、牛皮癣和广泛多发性骨髓瘤、红细胞增多症、恶性
