1、HPVHPV分子生物学分子生物学及宫颈病变病理诊断及宫颈病变病理诊断彭振武彭振武 广州广州安必平医药科技有限公司安必平医药科技有限公司 HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断1一，HPV简介二，HPV与宫颈癌的关系三，HPV相关细胞学形态改变及判读要点四，HPV检测方法及宫颈病变的病理诊断五，HPV疫苗的研究进展HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断2（一）HPV简介HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断31.完整的病毒颗粒为一个感染单位，外形呈20面体对称型，外壳有72个衣壳体。2.HPV基因组为环状双链DNA，含有近8000个碱基对。分为早期区，晚期区和长控区。Human papillomavirus
2、（HPV）HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断4早期转录区：参与病毒DNA的复制，转录，翻译，调控和细胞转化。晚期转录区：编码病毒的衣壳蛋白。上游调控区：又称长控区，通过与转录因子的相互作用调节早期区基因的转录，参与病毒复制，转录的调控。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断5HPVHPV基因组基因组早期转录区E1涉及病毒DNA复制，在病毒起始复制中起关键作用E2抑制病毒转录复制，E2失活直接导致E6，E7过度表达E4与病毒成熟胞浆蛋白有关，破坏胞浆中间细丝（纤维），促进病毒颗粒释放E5位于E2下游，通过细胞生长因子受体激活上调控E6促进P53过早降解而抑制P53功能，并能阻止和干扰细胞凋亡，引起细
3、胞无限增生并向恶性转化E7通过抑制pRB而消除细胞周期阻滞，导致细胞周期失控而发生永生化晚期转录区L1主要衣壳蛋白，LI:L2大约30:1L2次要衣壳蛋白长控区URR或LCR调节基因转录HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断6HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断7（二）HPV与宫颈癌的关系HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断8宫颈癌是第一个被确定有单一明确病因的癌症，即高危型HPV感染。HPV感染普遍存在，但是引起的宫颈癌却相对少见。高危型HPV总感染率大概在10%，15岁到25岁感染率最高。HPV感染平均为6-9个月，70%的HPV感染在一年内清楚，两年内的清除率可达90%HPV分子生物学与宫颈病变
4、病理诊断9HPV感染引起的低度病变（CIN1）不是癌前病变，大多会自然转愈，对于任何致癌性HPV，诊断CIN1并不意味着发展成CIN3的风险比活检阴性者高。HPV病毒量的多少跟宫颈癌的发生有一定的相关性，但是不成正比，不能预测疾病的进展。有效预防HPV感染，就能减少甚至不得宫颈癌。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断10通过微小破损感染上皮组织。通过胞吞作用使整个病毒颗粒侵入上皮基底层细胞，继而通过不明的机制被传送到细胞核。正常情况下，病毒基因中的E1，E2，E4，E5低表达，有利于病毒基因组的维持和细胞增生。表达水平增高促进病毒基因组复制。随着宿主角质细胞开始分裂并逐渐分化为上皮表层，L1和L
5、2蛋白表达促使病毒组装形成感染性病毒颗粒，而E4高表达则使细胞胞浆破坏，凹陷，促进病毒释放。HPV自然生活史（游离状态）HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断11 高危型HPV病毒持续性感染。病毒DNA与宿主细胞DNA发生整合，病毒与之整合的部 位位于E2编码区。HPV整合导致E2片段缺失，失去了对E6，E7的正常调控，导致其过度表达。E6与P53结合并使之降解，并能阻止和干扰细胞凋亡，引起细胞无限增生并向恶性转化。E7与pRB结合，使E2F得以释放，从而使细胞周期由G1期向S期转化，细胞周期失控而发生永生化。E6，E7编码的原癌蛋白表达，导致人类染色体端粒体酶逆转录酶基因（hTERC）扩增，维持
6、端粒长度，细胞永生，免于凋亡，发生癌变。HPV致癌机制（整合状态）HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断12宫颈癌发生过程：一过性一过性HPV感染感染持续性持续性HPV感染感染HPV病毒病毒正常宫颈正常宫颈初次感染初次感染清除清除HPV感染的宫颈感染的宫颈进展进展逆转逆转癌前病变癌前病变宫颈癌宫颈癌浸润浸润中度细胞学异常中度细胞学异常HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断13（三）HPV相关细胞学形态改变及判读要点HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断14 多数HPV感染并没有细胞学异常，大约只有30%的HPV感染会产生相应的细胞病理学变化。HPV引起的细胞学形态改变不仅仅表现挖空细胞特征，还包括ASC和
7、HSIL的病变特点。挖空细胞只说明有HPV感染，但无法分清楚是低危型还是高危型。HPV分子生物学行为对应TBS报告术语。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断15 典型的挖空细胞判读为LSIL，不典型的挖空细胞判读为ASC-US或ASC-H.理解LSIL的定义，其实就是要弄清楚以下这个问题：组织学的CIN1指的是下1/3的细胞异型，而与之对应的LSIL则是表层细胞形态的异常，如何解释？HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断16LSILHPV分子生物学与宫颈病变病理诊断17LSILHPV分子生物学与宫颈病变病理诊断18糖原溶解细胞VS挖空细胞HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断19LSIL（HPV病毒游离
8、状态，一过性感染）细胞学诊断的要点：1.细胞成熟，为表层细胞来源。2.核周空晕透亮，为胞浆塌陷或被破坏造成。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断20LSIL ASC-USHPV分子生物学与宫颈病变病理诊断21ASC-USHPV分子生物学与宫颈病变病理诊断22ASC-US（可疑HPV一过性感染，无典型挖空表现）细胞学诊断要点：1.核有一定异型，有挖空趋势，但核周空晕不透亮。2.成片聚集的表层细胞，核轻度增大或双核，可伴有角化不全现象。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断23HSILHPV分子生物学与宫颈病变病理诊断24HSIL（HPV病毒整合状态，持续性感染）细胞学诊断要点：1.高核浆比。2.核的异
9、型性，主要体现在核膜的不规则以及核染色质增粗。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断25CIN3HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断26CIN3HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断27CIN3（HPV病毒整合状态，持续感染，向宫颈癌进展）组织学诊断要点：1.核异型明显（肿瘤异倍体细胞的表现）。2.中表层细胞出现病理性核分裂像。3.全层细胞密度增加，极性紊乱，丧失正常的组织结构。4.表层细胞不出现典型的挖空细胞形态。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断28（四）HPV检测方法及宫颈病变的病理诊断HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断29HPV检测：1.病毒DNA检测2.病毒mRNA检测3.病毒相关蛋白检测4.
10、病毒靶向检测HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断30低危型HPV主要见于生殖器疣，常见的型别为6型和11型。高危型HPV与癌前病变和宫颈癌相关，常见的型别为16型和18型。检测方法有分型检测与不分型检测。HPV-DNA检测HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断31HC2（不分型）HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断32操作步骤：裂解杂交捕获抗原抗体反应信号放大结果判读HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断33 HC2结果判读：1.0pg/ml为阳性，相当于5000拷贝。如何正确理解HC2的检测结果？HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断34PCR-RDB（分型检测）DA8000全自动核酸分子杂交仪HPV分子生
11、物学与宫颈病变病理诊断35HPV-DNA分型检测的临床意义？能区分持续或反复感染。不同型别有不同的患病风险。不同型别有不同的处理方案。ASCCP2009版指南指出：30岁女性细胞学阴性，而HPV16或18型阳性者，建议阴道镜检测。细胞学阴性，其它HR-HPV型阳性者，一年后复查HPV-DN和细胞学。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断36HPV E6，E7 mRNA检测HPV 的E6、E7是病毒癌基因，它们的翻译产物介导抑癌基因p53和Rb的降解，从而干扰细胞周期调节。如若癌基因没有表达，则细胞本身不会发生癌变。E6蛋白能与细胞内 E6相关蛋白(E6 AP)形成复合物,特异性地结合 p53,并通
12、过依赖蛋白酶系统将其水解,使其对细胞生长负调节功能丧失,从而引起细胞无限增生并向恶性转化。E7蛋白是 HPV的主要转化蛋白,与控制细胞周期有关的肿瘤抑制蛋白视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)亲和力极高.E7与 Rb结合使 Rb E2F复合物解离,E2F被游离,从而发挥其转录因子的作用,导致细胞周期失控而发生永生化。HPV E6/E7mRNA 在宫颈组织中表达，说明HPV 病毒表达出癌基因活性。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断37bDNA技术原理HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断38HPV 相关蛋白检测人体的细胞周期包括G1，S,G2，M四个时相，且存在多个检查点调节各时相点的转换及细胞周期进程。其中
13、以G1S期最为重要，因为细胞一旦从G1期进入S期，则不再依赖外界信息刺激而很快自动完成分裂过程，因此G1卡点可以决定细胞继续增值或进入G0期或离开细胞周期进入终末分化或死亡。细胞周期卡点的转换受控于“细胞周期蛋白（cyclins）-细胞周期依赖性激酶（cdks）-细胞周期依赖性激酶抑制因子（clks）”这组分子网络。研究最为广泛的一组是：Cyclin D1/cdk4/P16。P16在细胞周期G1卡点中与CyclinD1竞争结合cdk4并特异性抑制其活性，组织细胞尤其是带有损伤DNA的细胞进入S期，从而控制细胞分裂。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断39P16：1.在LSIL的敏感性和特异性为7
14、4%，在HSIL中则达到97%以上。2.在LSIL中的表达为点状，散在分布；在HSIL中的表达为灶状，片状连续分布。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断40P16HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断41P16HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断42Cyclin D1：1.在正常宫颈组织中低表达，在CIN和宫颈鳞癌中表达增加并逐渐加强。2.促进细胞周期紊乱，细胞异常增殖。CyclinD1过度表达可能导致细胞G1期缩短，细胞过度增殖失控而促进肿瘤的发生。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断43Ki-67:1.在细胞周期的G1后期，S,G2，M期呈高表达，而在静止的G0期细胞呈低表达。2.Ki-67半衰期短
15、，脱离细胞周期后迅速降解，检测结果的可靠性明显优于半衰期长的增殖细胞核抗原，是最能反映细胞增殖状态的蛋白标志物之一。3.Ki-67用于CIN的鉴别诊断，主要用于萎缩性病例，而对反应性改变，化生性改变，修复性改变意义不大（细胞增殖指数也很高）。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断44Ki-67HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断45HPV分子靶向检测hTERC:宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增。其中，涉及到的最重要的基因可能是人类染色体末端酶（hTERC）基因。该基因的扩增可阻止细胞凋亡，因而可导致肿瘤产生。现已得知，3号染色体长臂扩增能准确区分宫颈细胞高度
16、癌前病变与低度癌前发育异常，鉴别诊断的敏感性及特异性均在90%以上 HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断46人类染色体末端酶基因-hTERC基因 hTERC基因定位在基因定位在3q26.3hTERC基因的作用：基因的作用：编码人类染色体端粒酶的重要基因，编码人类染色体端粒酶的重要基因，影响细胞凋亡。影响细胞凋亡。端粒酶活性端粒酶活性端粒端粒影响影响影响影响与细胞凋亡密切相关与细胞凋亡密切相关hTERC基因状态基因状态HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断47TBSTBS分级分级正常正常/炎症炎症ASCUSASCUSASC-HASC-HLSILLSILHSILHSILTERCTERC基因扩增发生率（基
17、因扩增发生率（%）4.64.613.513.528.628.625.225.287.787.7病理分级病理分级正常正常/炎症炎症CIN 1CIN 1CIN 2CIN 2CIN 3CIN 3原位癌原位癌TERCTERC基因扩增发生率（基因扩增发生率（%）4.24.27.37.369.269.285.185.195.795.7hTERC检测的意义HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断4849ASCUSCIN1CIN2/3TERC 基因基因ASCCIN1LSIL与HSIL的辅助判断指标HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断49宫颈脱落细胞FISH探针CSP3TERChTERChTERC基因定位于基因定位于3
18、q26.33q26.3 3 3号染色体着丝粒信号号染色体着丝粒信号HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断50正常扩增hTERC基因检测（fish）HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断51（四）HPV疫苗HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断52目前已分离出的HPV达100多型，其中至少14型可导致宫颈癌。16型与18型是最常见的高危型，大约70%宫颈癌由这两种型别引起。6型和11型是最常见的低危型，与90%生殖器尖锐湿疣相关。中国：HPV16（76.7%），HPV18（7.8%），HPV31（3.2%），HPV52（2.2%），HPV58（2.2%）。HPV流行病学HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断53
19、HPV疫苗：四价疫苗（6,11,16,18）2006年6月，美国FDA正式批准美国默克公司生成的四价预防性疫苗Gardasil的注册。建议针对9-26岁的女性使用。在美国和其它部分国家，该疫苗还被批准用于预防性男性生殖器疣。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断54二价疫苗（16,18）：2007年注册的英国葛兰素史克生成的二价疫苗Cervarix.批准用于10岁以上的女性。尚未申请在男性中使用的适应症。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断55疫苗为无菌混悬液，需储存在2-8环境下，不能冷冻。肌肉注射，注射后观察15分钟。接种分三次进行（第一针,1或2个月后第二针，6个月后第三针）对其它疫苗有严重过敏史的人或孕期女性禁用。预防性HPV疫苗无法治疗已存在的病毒感染或相关病变。治疗性疫苗需要进一步研制。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断56总结 HPV病毒与宫颈病变关系密切，不同程度的宫颈病变其实就是HPV病毒感染机体后不同分子生物学行为的表现，而病变的多样化与病毒型别，机体抵抗力及个体差异相关联。宫颈癌筛查最重要的目的是发现并且治疗那些经过初筛发现异常，并最终活检确诊为高级别或以上的病例。宫颈病变LISL与HSIL的明确诊断，越来越有赖于多种检测项目的联合应用及准确分析。HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断57HPV分子生物学与宫颈病变病理诊断58
