1、From Prof.XW Bian1为没有工作经验的医学研究生编写为没有工作经验的医学研究生编写一本适合自学的手册式教材，为他们一本适合自学的手册式教材，为他们做课题时更快、更好地选择合适的实做课题时更快、更好地选择合适的实验技术提供决策参考。验技术提供决策参考。2重点介绍同类实验技术的发展沿革、重点介绍同类实验技术的发展沿革、优劣比较；不同实验技术的特点、用优劣比较；不同实验技术的特点、用途、相互关系、发展趋势；各类实验途、相互关系、发展趋势；各类实验技术的关键、操作要点和选择示范。技术的关键、操作要点和选择示范。3重点强调医学实验技术的原理与选重点强调医学实验技术的原理与选择，而非具体操作
2、，亦非理论知识。择，而非具体操作，亦非理论知识。常用医学实验动物模型的种类及选择常用医学实验动物模型的种类及选择组织学实验技术组织学实验技术细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术分子生物学实验技术分子生物学实验技术蛋白质化学技术蛋白质化学技术免疫学实验技术免疫学实验技术医学微生物学实验技术医学微生物学实验技术活细胞活细胞细胞爬片细胞爬片细胞离心涂片细胞离心涂片细胞培养细胞培养离心后包埋制片离心后包埋制片冻存冻存细胞悬液细胞悬液固定固定形态学形态学IHCISHProtein/DNA/RNA分子生物学分子生物学IF、FCM印片法印片法穿刺法穿刺法沉淀法沉淀法细胞爬片法细胞爬片法适用范围适用范围活检组
3、织标本、活检组织标本、手术切除标本的手术切除标本的细胞取材细胞取材实质器官的病实质器官的病变区细胞取材变区细胞取材体液多细胞少体液多细胞少的标本的标本有贴壁生长特性有贴壁生长特性的细胞，如纤维的细胞，如纤维母细胞、粘液癌母细胞、粘液癌细胞细胞优优 点点简便省时，细胞简便省时，细胞抗原保存较好抗原保存较好操作简便，细操作简便，细胞形态保持较胞形态保持较好好操作简便，细操作简便，细胞形态保持较胞形态保持较好好操作简便，保持操作简便，保持细胞形态及活性细胞形态及活性缺缺 点点细胞分布不均匀，细胞分布不均匀，易重叠，影响标易重叠，影响标记效果记效果细胞分布不均细胞分布不均匀匀细胞分布不均细胞分布不均匀
4、，易重叠，匀，易重叠，影响标记效果影响标记效果适用细胞种类较适用细胞种类较少少定义：将组织浸入适当化学试剂，使细胞内定义：将组织浸入适当化学试剂，使细胞内 物质尽量接近其物质尽量接近其生理状态生理状态时的形态结时的形态结 构和位置的过程构和位置的过程意义：意义：防止自溶防止自溶 防止腐败防止腐败 最大限度保存细胞和组织的抗原性最大限度保存细胞和组织的抗原性 保留特殊成分：糖原、核酸、色素等保留特殊成分：糖原、核酸、色素等 蒸汽固定法蒸汽固定法浸入法浸入法灌注法灌注法微波固定法微波固定法某些薄膜组织及血液或细胞涂片中的可溶物质某些薄膜组织及血液或细胞涂片中的可溶物质手术取材组织标本和细胞涂片手术
5、取材组织标本和细胞涂片仅适用于动物实验仅适用于动物实验醛类固定剂醛类固定剂非醛类固定剂非醛类固定剂丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂双功能交联剂，可使组织间相互交联，原位保存抗原双功能交联剂，可使组织间相互交联，原位保存抗原对组织穿透力强，收缩性小对组织穿透力强，收缩性小是最常用固定剂是最常用固定剂适用于多肽类激素的组织固定适用于多肽类激素的组织固定常需与戊二醛或多聚甲醛混合适用降低边缘效应常需与戊二醛或多聚甲醛混合适用降低边缘效应穿透性很强，保存抗原活性较好穿透性很强，保存抗原活性较好常用于冰冻切片及细胞涂片固定常用于冰冻切片及细胞涂片固定2.5%常规组织病理制片常规组织病理制片 脱水，透明，
6、浸蜡，包埋，切片脱水，透明，浸蜡，包埋，切片近年来基因芯片（近年来基因芯片（DNA芯片）技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋芯片）技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片一样，属于特殊生物芯片技术白芯片、抗体芯片一样，属于特殊生物芯片技术 组织芯片技术可将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预组织芯片技术可将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具本的分析工具 科研人员可同时研究几百甚至上千种不同阶段病理生理状态下的科研人员可同时研究几百甚至上千种不同阶段病
7、理生理状态下的组织样本的某一个或多个特定基因或相关表达产物组织样本的某一个或多个特定基因或相关表达产物 Tissue MicroarrayTissue Microarray选取选取同质性同质性研究材料，是在对组织的深入研究中研究材料，是在对组织的深入研究中常常遇到却又不易解决的问题常常遇到却又不易解决的问题 该技术是在显微状态下或显微直视下通过显微操作系统对选该技术是在显微状态下或显微直视下通过显微操作系统对选择的材料（组织、细胞、细胞群、细胞内组分或染色体带等）择的材料（组织、细胞、细胞群、细胞内组分或染色体带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术进行切割分离并收集用于后续研究的技术 细微
8、：微米、纳米级切割细微：微米、纳米级切割原位：所取材料定位清楚原位：所取材料定位清楚同质：所取材料在一定层次上相同同质：所取材料在一定层次上相同结合：与其他实验技术结合结合：与其他实验技术结合手动直接显微切割手动直接显微切割 机械辅助显微切割机械辅助显微切割 液压控制显微切割液压控制显微切割 激光捕获显微切割（激光捕获显微切割（laser capture microdessection,LCM）全自动组织处理机全自动组织处理机石蜡包埋机石蜡包埋机石蜡切片机石蜡切片机震荡切片机震荡切片机硬组织切片机硬组织切片机冰冻切片机冰冻切片机冰冻切片机冰冻切片机常用组织切片染色方法常用组织切片染色方法 未经
9、染色的组织切片各部分折射率差别很小，即使有足够的分未经染色的组织切片各部分折射率差别很小，即使有足够的分辨率和合适的放大倍数，也无法直接在光镜下观察。辨率和合适的放大倍数，也无法直接在光镜下观察。通过适当的染色，增大各部分结构折射率差别，提高分辨率通过适当的染色，增大各部分结构折射率差别，提高分辨率 HE染色能非常鲜明地对组织和细胞染色能非常鲜明地对组织和细胞染色，是染色，是的技的技术方法，又被称为常规染色。术方法，又被称为常规染色。DNA带负电荷，呈酸性，与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键形式结合，呈蓝色带负电荷，呈酸性，与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键形式结合，呈蓝色伊红伊红
10、Y为一种合成酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与嗜酸性物质结合呈红色为一种合成酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与嗜酸性物质结合呈红色 特殊染色特殊染色l显示显示HE染色不明显的目的物染色不明显的目的物，如，如Gridley染色能染色能突出显示感染的霉菌突出显示感染的霉菌l区别常规区别常规HE染色不能鉴别的病变染色不能鉴别的病变，如，如染色可区染色可区分胶原纤维和平滑肌分胶原纤维和平滑肌l显示某些常规显示某些常规HE染色中不能看到的目的物染色中不能看到的目的物，如，如网状纤维、星形细胞的突起和结核杆菌等网状纤维、星形细胞的突起和结核杆菌等结缔组织染色结缔组织染色 Van Gieso
11、n氏苦味酸酸性品红染色法（简称法）Masson氏三色染色法Mallory氏三色染色法Pollak氏三色染色法Sirius Red苦味酸法等 分布最广、含量最多的一种纤维分布最广、含量最多的一种纤维 l 来源于间胚叶的肿瘤如纤维瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、神经来源于间胚叶的肿瘤如纤维瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、神经纤维瘤及其肉瘤等的诊断和鉴别诊断。纤维瘤及其肉瘤等的诊断和鉴别诊断。l 在慢性炎症、机化和瘢痕形成等病变中显示胶原纤维，如慢在慢性炎症、机化和瘢痕形成等病变中显示胶原纤维，如慢性肾小球肾炎的肾小球纤维化、大叶性肺炎、血栓机化、风性肾小球肾炎的肾小球纤维化、大叶性肺炎、血栓机化、风湿性肉芽肿时湿
12、性肉芽肿时Aschoffs巨细胞消失、胃、十二指肠溃疡愈合、巨细胞消失、胃、十二指肠溃疡愈合、慢性阑尾炎、肝硬化。慢性阑尾炎、肝硬化。l 血管壁的胶原纤维染色对病理诊断有重要意义。如良性高血血管壁的胶原纤维染色对病理诊断有重要意义。如良性高血压的小动脉玻璃样变（压的小动脉玻璃样变（阳性）；恶性高血压小动脉管型纤维阳性）；恶性高血压小动脉管型纤维素样坏死（素样坏死（阴性而纤维素染色阳性）；高血压性肾固缩，其阴性而纤维素染色阳性）；高血压性肾固缩，其小动脉小动脉阳性呈红色，而淀粉样物质沉积的小动脉壁阳性呈红色，而淀粉样物质沉积的小动脉壁染色呈黄染色呈黄色色 在病理诊断上主要用于和在病理诊断上主要用
13、于和肌纤维肌纤维相鉴别相鉴别 结缔组织染色结缔组织染色 是网状结缔组织内的一种纤维，纤细而有分支，直径约是网状结缔组织内的一种纤维，纤细而有分支，直径约0.21mm，无弹，无弹性，穿行于细胞体之间，共同构成网状支架。性，穿行于细胞体之间，共同构成网状支架。HE染色不易辩识，用银氨染色不易辩识，用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色，故称嗜银纤维溶液浸染能使纤维变成黑色，故称嗜银纤维 主要分布在淋巴组织、骨髓、扁桃体、胸腺、基底膜、主要分布在淋巴组织、骨髓、扁桃体、胸腺、基底膜、血管（特别是毛细血管）、脾窦、肝窦、肌纤维周围、血管（特别是毛细血管）、脾窦、肝窦、肌纤维周围、神经纤维、脂肪细胞周围及肺泡等
14、神经纤维、脂肪细胞周围及肺泡等结缔组织染色结缔组织染色 Perdrau氏法、氏法、Foot氏法、氢氧化银液法、氏法、氢氧化银液法、Wilder氏氢氧化银液法、氏氢氧化银液法、James氏氏法、法、Naoumemko-Feigin氏法、氏法、Del Rio-Hortega氏法、氏法、Hortega氏法、氏法、Bielschowsky氏法、氏法、Hamason-Lushbangh氏法、醋酸氨银染色法（汪荣法）氏法、醋酸氨银染色法（汪荣法）和组织块镀银法等和组织块镀银法等 l 常用于区别癌和肉瘤：癌巢周围常有网状纤维包裹；常用于区别癌和肉瘤：癌巢周围常有网状纤维包裹；用于基底膜染色，鉴别原位癌或原位
15、癌早期浸润。用于基底膜染色，鉴别原位癌或原位癌早期浸润。l 鉴别血管内皮瘤和外皮瘤：血管内皮瘤瘤细胞呈泡巢鉴别血管内皮瘤和外皮瘤：血管内皮瘤瘤细胞呈泡巢状，周围被网状纤维包绕；血管外皮瘤瘤细胞间可见状，周围被网状纤维包绕；血管外皮瘤瘤细胞间可见较多网状纤维。较多网状纤维。l 区别脑肿瘤：脑原发性肉瘤周围有较多网状纤维、脑区别脑肿瘤：脑原发性肉瘤周围有较多网状纤维、脑血管周围肉瘤组织内有较多网状纤维，其它脑肿瘤少血管周围肉瘤组织内有较多网状纤维，其它脑肿瘤少见网状纤维见网状纤维 结缔组织染色结缔组织染色 弹力纤维（弹力纤维（Elastic fiber）广泛分布于身体各处，以肺泡壁、）广泛分布于身
16、体各处，以肺泡壁、动脉壁和皮肤最为丰富。直径约动脉壁和皮肤最为丰富。直径约0.21mm，纤维分支，交织成，纤维分支，交织成网，电镜下无周期性横带。对沸水、弱酸和碱有一定抵抗力，网，电镜下无周期性横带。对沸水、弱酸和碱有一定抵抗力，但可被胃液、胰液等消化但可被胃液、胰液等消化 间苯二酚品红法、醛品红法、地衣红法、间苯二酚品红法、醛品红法、地衣红法、Verhoeff氏法、氏法、Hart氏法、酸性地衣红姬姆萨法、醛复红阿辛蓝法、碱性蓝氏法、酸性地衣红姬姆萨法、醛复红阿辛蓝法、碱性蓝B染色法、弹力、胶原纤维的双重组合染色法和显示胶原、网染色法、弹力、胶原纤维的双重组合染色法和显示胶原、网状和弹力纤维的
17、三联法状和弹力纤维的三联法 l弹力纤维增生：原发性或继发性高血压的小动弹力纤维增生：原发性或继发性高血压的小动脉、皮肤弹力纤维瘤、老年弹力纤维增生症、心脉、皮肤弹力纤维瘤、老年弹力纤维增生症、心内膜弹力纤维增生症、乳腺癌的弹力纤维增生等。内膜弹力纤维增生症、乳腺癌的弹力纤维增生等。l弹力纤维断裂、崩解：老年性肺气肿、主动脉弹力纤维断裂、崩解：老年性肺气肿、主动脉粥样硬化、梅毒性主动脉炎、皮肤环状肉芽肿等。粥样硬化、梅毒性主动脉炎、皮肤环状肉芽肿等。法、法、Mallory三色染色法、三色染色法、Gomori多色染色法、多色染色法、Gomori氏改良多色染色氏改良多色染色法、铁苏木素法、偶氮桃红染
18、色法、横纹肌的组织块染色法、苏木素碱法、铁苏木素法、偶氮桃红染色法、横纹肌的组织块染色法、苏木素碱性品红苦味酸法、酸性复红光绿染色法、酸性复红染色法、性品红苦味酸法、酸性复红光绿染色法、酸性复红染色法、CV-AF染色染色法和变色酸法和变色酸2R亮绿染色法等亮绿染色法等 l未分化间叶性肿瘤，如横纹肌肉瘤的来源确定未分化间叶性肿瘤，如横纹肌肉瘤的来源确定l炎症渗出纤维素、弥散性血管内凝血的纤维素染色炎症渗出纤维素、弥散性血管内凝血的纤维素染色l神经胶质瘤研究神经胶质瘤研究动脉粥样硬化病灶、肿瘤组织坏死灶、细胞内类脂沉积、脂性肾动脉粥样硬化病灶、肿瘤组织坏死灶、细胞内类脂沉积、脂性肾病的肾小管、肾上
19、腺皮质中胆固醇类激素含量增减的测定病的肾小管、肾上腺皮质中胆固醇类激素含量增减的测定 由甘油、脂肪酸、磷酸和含氮的碱基组成，是细胞膜和细胞内膜性由甘油、脂肪酸、磷酸和含氮的碱基组成，是细胞膜和细胞内膜性结构的主要组成成分，在大脑、神经组织、骨髓和肝脏等含量较多结构的主要组成成分，在大脑、神经组织、骨髓和肝脏等含量较多 神经组织主要由磷脂和糖脂构成，用此法可以显示磷脂，神经组织主要由磷脂和糖脂构成，用此法可以显示磷脂，用用PAS显示糖脂显示糖脂 糖原又名肝糖，以大小不等的颗粒贮存于肝细胞及肌细胞糖原又名肝糖，以大小不等的颗粒贮存于肝细胞及肌细胞浆中，遇碘变褐色，易溶于水浆中，遇碘变褐色，易溶于水
20、机体坏死后，糖原即被破坏，须取新鲜标本并及时固定机体坏死后，糖原即被破坏，须取新鲜标本并及时固定 碘酸碘酸-Schiff氏法（氏法（PAS）能打开多糖类结构的乙二醇基（能打开多糖类结构的乙二醇基（-CHOH-CHOH-）或氨羟基（或氨羟基（-CHOH-CHNH2-）的碳键，生成醛基）的碳键，生成醛基化合物，暴露出游离醛基（化合物，暴露出游离醛基（-CHO）。再与无色品）。再与无色品红液作用，生成新的红色或紫红色复合物，即红液作用，生成新的红色或紫红色复合物，即Schiff反应。糖原被染成红色，细胞核呈蓝色反应。糖原被染成红色，细胞核呈蓝色 该方法对含乙二醇基或氨羟基的多糖呈阳性反应该方法对含乙
21、二醇基或氨羟基的多糖呈阳性反应急性心肌缺血时心肌糖原消失，饥饿时肝糖原减少，糖尿病时急性心肌缺血时心肌糖原消失，饥饿时肝糖原减少，糖尿病时肝、肾、肾曲小管可出现大量糖原肝、肾、肾曲小管可出现大量糖原含铁血黄素染色含铁血黄素染色 鉴别组织或细胞中的黄棕色色素性质鉴别组织或细胞中的黄棕色色素性质 黑色素染色黑色素染色 含黑色素的组织切片在含黑色素的组织切片在HE染色中容易与含铁血染色中容易与含铁血黄素、脂褐素等混淆黄素、脂褐素等混淆 脂褐素染色脂褐素染色 在老年性萎缩和恶液质患者的实质细胞、病毒在老年性萎缩和恶液质患者的实质细胞、病毒性肝炎时星形细胞内有脂褐素出现性肝炎时星形细胞内有脂褐素出现 胆
22、色素染色胆色素染色 化学成分是胆红素和橙色血质，为不含铁的化学成分是胆红素和橙色血质，为不含铁的血红蛋白分解产物血红蛋白分解产物 钙盐染色钙盐染色 病理性钙化是常见病理变化病理性钙化是常见病理变化 缓冲亚甲蓝法（缓冲亚甲蓝法（Pischingert法）、混合染色法（焦油紫、硫法）、混合染色法（焦油紫、硫堇、亚甲蓝、甲苯胺蓝法）、堇、亚甲蓝、甲苯胺蓝法）、Thionine氏硫堇法、甲苯胺蓝氏硫堇法、甲苯胺蓝法、焦油紫法、培花青法等法、焦油紫法、培花青法等 尼氏体的存在或消失是神经细胞是否受损的重要指标。脑缺血、脑炎、脊髓前角灰质炎及轴突反应等病变时，神经元受损，尼氏体可溶解消失 轴突有嗜银性，常
23、用银浸镀法、甘轴突有嗜银性，常用银浸镀法、甘氨酸银浸镀法和氨酸银浸镀法和Holmes氏法染色氏法染色髓鞘（髓鞘（myelin）是包裹在神经轴突外面的节段性管状鞘，是由雪旺氏细胞的）是包裹在神经轴突外面的节段性管状鞘，是由雪旺氏细胞的胞膜（周围神经纤维）或少突胶质细胞的胞膜（中枢神经纤维）包卷轴突作胞膜（周围神经纤维）或少突胶质细胞的胞膜（中枢神经纤维）包卷轴突作螺旋状盘绕。髓鞘由鞘磷脂构成，含螺旋状盘绕。髓鞘由鞘磷脂构成，含60%的类脂质和的类脂质和40%的蛋白质的蛋白质 碳酸锂苏木素法、砂罗铬花青法、四氧化锇法、碳酸锂苏木素法、砂罗铬花青法、四氧化锇法、Weil氏铁明矾苏木素法、氏铁明矾苏木
24、素法、Weigert铁苏木素法、铁苏木素法、Kultsohitsky酸性苏木素锇酸法、酸性苏木素锇酸法、Luxol氏坚牢蓝甲氏坚牢蓝甲苯酚紫法和苯酚紫法和Marchi氏锇酸法等。氏锇酸法等。氯化金升汞法、氯化金升汞法、PTAH法、法、Holzer氏磷钼酸结晶紫法、氏磷钼酸结晶紫法、Scharenberg氏法、氏法、Rio-Hortega氏法等，均属镀金法，在加氏法等，均属镀金法，在加入二氯化汞的氯化金溶液中，星形胶质细胞具有嗜金性。入二氯化汞的氯化金溶液中，星形胶质细胞具有嗜金性。神经胶质细胞瘤与脑膜瘤、室管膜瘤等鉴别时往往需要做胶质神经胶质细胞瘤与脑膜瘤、室管膜瘤等鉴别时往往需要做胶质细胞染
25、色细胞染色 显示显示DNA的一种常用方法。基本原理是在酸水解下，去除的一种常用方法。基本原理是在酸水解下，去除DNA中的嘌呤，暴露出中的嘌呤，暴露出脱氧核糖核酸的醛基，后者再与脱氧核糖核酸的醛基，后者再与Schiff氏试剂反应，生成紫红色产物，用显微分氏试剂反应，生成紫红色产物，用显微分光光度计和流式细胞测量计对细胞分别进行静态光光度计和流式细胞测量计对细胞分别进行静态DNA测量和流式细胞测量测量和流式细胞测量 是是rRNA的染色体片段，与嗜银酸性非组蛋白有的染色体片段，与嗜银酸性非组蛋白有关。关。rRNA基因直接控制着核糖体和蛋白质的合基因直接控制着核糖体和蛋白质的合成。计数细胞内成。计数细
26、胞内NORS的数量可反映细胞增殖的的数量可反映细胞增殖的情况。经典方法是银染法，如情况。经典方法是银染法，如PLOTON改良法，改良法，镜下镜下NORS位于细胞核内呈黑色的颗粒状位于细胞核内呈黑色的颗粒状 甲基紫、甲基紫、MSB和和PAS等染色法。等染色法。炎症渗出性改变、炎症渗出性改变、DIC、高血压、高血压的小血管壁及一些胶原性疾病的的小血管壁及一些胶原性疾病的疏松纤维疏松纤维 刚果红染色法（淀粉样物质呈红色，细胞核呈蓝色）和刚果红染色法（淀粉样物质呈红色，细胞核呈蓝色）和甲基紫染色法（淀粉样物质呈红色或紫红色，细胞核呈甲基紫染色法（淀粉样物质呈红色或紫红色，细胞核呈蓝色）。蓝色）。可用于
27、辅助诊断全身消耗性疾病、区分淀粉样变性与其可用于辅助诊断全身消耗性疾病、区分淀粉样变性与其他变性、肿瘤的诊断与鉴别等他变性、肿瘤的诊断与鉴别等 免疫组织化学免疫组织化学 酶组织化学酶组织化学 immunohistochemistry，IHC enzymohistochemistry，EHC 免疫组织化学免疫组织化学 免疫组织化学与免疫细胞化学本质上一致，习惯上共同称为免疫组织化学与免疫细胞化学本质上一致，习惯上共同称为免疫组织化学（免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC），也可称），也可称为原位免疫学（为原位免疫学（in situ immunology）膜阳性膜阳性浆阳
28、性浆阳性核阳核阳性性由抗原分子表面的抗原决定簇（由抗原分子表面的抗原决定簇（antigenic determinant）决定其免疫原性，也是抗原与抗体）决定其免疫原性，也是抗原与抗体特异结合的基本单位，也称抗原表位（特异结合的基本单位，也称抗原表位（epitope）多克隆抗体（多克隆抗体（polyclonal antibody,pAb）单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）基因工程抗体基因工程抗体 多克隆抗体（多克隆抗体（polyclonal antibody,pAb）l又叫又叫血清抗体血清抗体，机体接受抗原主动或被动免疫后，从，机体接受抗原主动或被动免疫后，
29、从血清血清中中分离提纯的抗体。分离提纯的抗体。lpAb由由多个多个B细胞克隆细胞克隆针对针对不同的抗原决定簇不同的抗原决定簇而产生，特异而产生，特异性较低，与其他抗原间存在交叉反应，使背景着色较高。各性较低，与其他抗原间存在交叉反应，使背景着色较高。各批次间可能存在特异性和亲和性的差别。批次间可能存在特异性和亲和性的差别。lpAb制备程序简单，易大量获得，成本较低，在一些特异性制备程序简单，易大量获得，成本较低，在一些特异性要求不高的实验中，仍在广泛应用。要求不高的实验中，仍在广泛应用。单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）lMilstein&khler，19
30、75l原理：抗原免疫小鼠，将小鼠脾脏淋巴细胞与体外培养的原理：抗原免疫小鼠，将小鼠脾脏淋巴细胞与体外培养的人骨髓瘤细胞株在一定条件下人骨髓瘤细胞株在一定条件下融合融合，形成可长期存活并能，形成可长期存活并能分泌抗体的分泌抗体的杂交瘤（杂交瘤（hybridoma）细胞）细胞，将其分离培养后，将其分离培养后形成形成单个瘤细胞克隆单个瘤细胞克隆。培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠。培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠腹腔产生的腹水中就含有瘤细胞分泌的抗体，这就是腹腔产生的腹水中就含有瘤细胞分泌的抗体，这就是mAblmAb由一个瘤细胞克隆产生，只针对一个抗原决定簇，所由一个瘤细胞克隆产生，只针对一个抗原决定簇，
31、所有抗体分子在结构上完全一致，具有高度特异性和稳定性有抗体分子在结构上完全一致，具有高度特异性和稳定性 基因工程抗体基因工程抗体 l采用采用DNA重组技术重组技术生产的抗体生产的抗体第第3代抗体代抗体l1989年年Huse等首次构建抗体基因库，使抗体研究从体内和等首次构建抗体基因库，使抗体研究从体内和细胞水平进入到分子水平细胞水平进入到分子水平l基因工程抗体包括嵌合抗体、人源性型抗体、完全人源化基因工程抗体包括嵌合抗体、人源性型抗体、完全人源化抗体、单链抗体、双功能抗体、片段抗体等抗体、单链抗体、双功能抗体、片段抗体等l重组抗体的体积越来越小，或被重新构建成多价分子，或重组抗体的体积越来越小，
32、或被重新构建成多价分子，或与其它分子融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病与其它分子融合，如放射性核素、毒素、酶、脂质体和病毒等毒等l重组技术的出现使抗体改造成为可能，并取代杂交瘤技术，重组技术的出现使抗体改造成为可能，并取代杂交瘤技术，为以抗体为基础的生物药物研发开拓了广阔前景为以抗体为基础的生物药物研发开拓了广阔前景 Ag-Ab复合物并不可见，必须将抗体加以标记并利用标记物复合物并不可见，必须将抗体加以标记并利用标记物与其他物质的反应，形成可见的发光或显色与其他物质的反应，形成可见的发光或显色 TMRITC免疫酶组织化学法：用酶蛋白标记抗体。通过免疫反应后追加标免疫酶组织化学法：用酶蛋白
33、标记抗体。通过免疫反应后追加标记物酶催化底物的组织化学反应，得到具有一定电子密度的有色记物酶催化底物的组织化学反应，得到具有一定电子密度的有色产物，可用光学及电子显微镜观察。产物，可用光学及电子显微镜观察。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(1)体积小，不会遮盖抗原的结合部位，穿透力强体积小，不会遮盖抗原的结合部位，穿透力强(2)稳定且易获得高纯度酶制品稳定且易获得高纯度酶制品(3)具较高活性及特异性具较高活性及特异性(4)不溶性好，终产物不向周边扩散不溶性好，终产物不向周边扩散(5)内源性酶较少，抑制方法较多内源性酶较少，抑制方法较多(6)价格相对较便宜价格相对较便宜(7)特异性底物是过
34、氧化氢特异性底物是过氧化氢(H202)，可选用不同发色基团，可选用不同发色基团（电子供体），使终产物呈不同颜色（电子供体），使终产物呈不同颜色 HRP.H2O2+DH2HRP+D+2H2ODAB是广泛应用的电子供体，产物为是广泛应用的电子供体，产物为棕黄色颗粒，不溶于水和有机溶剂棕黄色颗粒，不溶于水和有机溶剂 有潜在致癌性有潜在致癌性 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AKP)磷酸萘酯磷酸萘酯H2O萘酚磷酸盐萘酚磷酸盐萘酚偶氮染料萘酚偶氮染料有色沉淀有色沉淀分子大（100kDa），穿透力较弱某些组织细胞内含有较高的内源性AKP，干扰染色不溶于有机溶剂，切片不易褪色呈色反应的敏感性比HRP高2-3倍，显色时
35、间从30min到48h其产物为鲜红色，可与HRP组合进行IHC的双重或多重标记 缺点缺点优点优点 葡萄糖氧化酶（葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase，GOD）胶体金和铁蛋白：免疫电镜技术的主要标记物胶体金和铁蛋白：免疫电镜技术的主要标记物 枣红蛋白与枣红蛋白与FITC共同用于双重标记共同用于双重标记 亲和组织化学标记物亲和组织化学标记物 利用具有亲和特性的利用具有亲和特性的的高度亲和性，将酶、荧光等标记物的高度亲和性，将酶、荧光等标记物与亲和物质连接，对抗原或其他靶物质进行定位和定量的方法与亲和物质连接，对抗原或其他靶物质进行定位和定量的方法 生物素亲和素系统生物素亲和素系统 生物素（生物
36、素（biotin）vitamin H亲和素（亲和素（avidin）卵白素或抗生物素蛋白（）卵白素或抗生物素蛋白（antibiotin），由），由4个相同亚基个相同亚基组成，组成，1分子亲和素可结合分子亲和素可结合4分子生物素分子生物素二者以二者以非共价键不可逆结合非共价键不可逆结合，其亲和力是抗原抗体亲和力的，其亲和力是抗原抗体亲和力的100万倍，是万倍，是自然界已知结合最紧密的物质对之一自然界已知结合最紧密的物质对之一 生物素分子量小，生物素分子量小，1分子抗体可结合约分子抗体可结合约150个生物素个生物素不影响抗体与抗原结合，也不影响与之结合的酶活性不影响抗体与抗原结合，也不影响与之结合的
37、酶活性亲和素可与荧光素、酶等标记物偶联亲和素可与荧光素、酶等标记物偶联具有敏感性高、特异性强、稳定性好和方便快速等特点具有敏感性高、特异性强、稳定性好和方便快速等特点 以不与内源性生物素结合的链霉亲和素来代替亲和素以不与内源性生物素结合的链霉亲和素来代替亲和素 Conjugated avidin常用标记物常用标记物荧光标记物荧光标记物酶标记物酶标记物亲和组织化学标记亲和组织化学标记物物FITC/TMRITCHRPAKPGOD生物素亲和素生物素亲和素优优 点点结合稳定，颜结合稳定，颜色鲜明，染色色鲜明，染色步骤简便步骤简便穿透力强；穿透力强；稳定；特异稳定；特异性高；不溶性高；不溶性好性好底物较
38、多；敏底物较多；敏感性高；显色感性高；显色时间范围宽时间范围宽 终产物稳终产物稳定，易永定，易永久保存久保存敏感性、特异性和敏感性、特异性和稳定性好；方便快稳定性好；方便快速速缺缺 点点背景较高、保背景较高、保存时间短、需存时间短、需荧光显微镜荧光显微镜特异性受内特异性受内源性过氧化源性过氧化物酶影响物酶影响分子大，穿透分子大，穿透力弱；受内源力弱；受内源性性AKP干扰干扰分子大，分子大，穿透力弱；穿透力弱；与底物反与底物反应敏感性应敏感性低低特异性受内源性生特异性受内源性生物素干扰物素干扰适用范围适用范围免疫荧光，流免疫荧光，流式细胞术式细胞术IHC，蛋白，蛋白免疫印迹免疫印迹原位杂交和双原
39、位杂交和双重酶标重酶标IHC多重多重标记标记IHC、核酸分子杂、核酸分子杂交、免疫印迹、交、免疫印迹、ELISA等等5S：sensitivitysimplicitysafelysave直接法间接法PAP法APAAP法ABC法 用荧光素或酶标记的特异性抗体，用荧光素或酶标记的特异性抗体，直接与待检组织中的抗原反应，又直接与待检组织中的抗原反应，又称一步法称一步法 操作简单，特异性高而敏感性低操作简单，特异性高而敏感性低抗体需单独标记，生产成本高抗体需单独标记，生产成本高最常用于肾活检组织及结缔组织病最常用于肾活检组织及结缔组织病皮肤活检标本的皮肤活检标本的IgG、IgA、IgM及及补体等免疫相关
40、蛋白的检测补体等免疫相关蛋白的检测也用于也用于FCM测定各种细胞表面抗原测定各种细胞表面抗原 组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体过氧化物酶过氧化物酶又称夹心法（又称夹心法（sandwich method），分两步检测抗原或抗体。检），分两步检测抗原或抗体。检测抗原时，先以未标记的特异性抗体（第一抗体）与组织或细胞中测抗原时，先以未标记的特异性抗体（第一抗体）与组织或细胞中的抗原反应，洗去未结合的抗体后，再以酶或荧光素标记的第二抗的抗原反应，洗去未结合的抗体后，再以酶或荧光素标记的第二抗体（抗抗体）与第一抗体结合，再显色或荧光检查。体（抗抗体）与第一抗体结合，再显色或荧光检查。酶桥法（enzyme
41、 bridge technique）PAP法（peroxidase antiperoxidase method）APAAP法 亲和素亲和素-生物素生物素-过氧化物酶复合过氧化物酶复合物技术（物技术（avidin biotin-peroxidase complex technique，ABC）ABC复合物由亲和素与酶标生物素以一复合物由亲和素与酶标生物素以一定比例结合而成，亲和素作为桥梁，将定比例结合而成，亲和素作为桥梁，将ABC复合物与生物素化的抗体结合起来，复合物与生物素化的抗体结合起来，再由抗体检出抗原再由抗体检出抗原 酶标亲和素生物素技术（酶标亲和素生物素技术（labeled avidi
42、n-biotin technique，BA或或LAB技术）技术）用亲和素分子直接与酶分子结合，形成酶亲和素复合物，再用亲和素分子直接与酶分子结合，形成酶亲和素复合物，再与生物素标记的二抗结合，其与生物素标记的二抗结合，其敏感性较敏感性较ABC法又有数倍提高法又有数倍提高。如用链霉亲和素（如用链霉亲和素（streptavidin,SA）代替亲和素，又衍生出）代替亲和素，又衍生出LsAB法，该法避免了与切片中内源性生物素结合，特异性更高。法，该法避免了与切片中内源性生物素结合，特异性更高。利用线状葡聚糖分子与大量酶结合，再将葡聚糖酶复合物利用线状葡聚糖分子与大量酶结合，再将葡聚糖酶复合物(EnVi
43、sion复复合物合物)连接到二抗上，形成酶葡聚糖二抗复合物，复合物中酶分子绝连接到二抗上，形成酶葡聚糖二抗复合物，复合物中酶分子绝对数量远高于其他复合物（可达对数量远高于其他复合物（可达150个）；同时存在多个第二抗体（个）；同时存在多个第二抗体（15个），增加了该复合物与特异性抗体的结合机会，具高度放大作用。个），增加了该复合物与特异性抗体的结合机会，具高度放大作用。组织抗原组织抗原一抗一抗HRP多聚骨架多聚骨架原理是增加了生物素化的酪胺基团分子，通过原理是增加了生物素化的酪胺基团分子，通过HRP的催化作用，使酪胺基的催化作用，使酪胺基团分子与抗原抗体结合部位形成一个共价结合位点，团分子与抗
44、原抗体结合部位形成一个共价结合位点，当再次滴加链霉亲和素，当再次滴加链霉亲和素HRP复合物时，原始信号得到几何复合物时，原始信号得到几何级放大。级放大。优点优点缺点缺点适用范围适用范围直接法直接法操作简单，特异性高操作简单，特异性高敏感性低，抗体需单敏感性低，抗体需单独标记独标记检测肾等活检标本免疫球检测肾等活检标本免疫球蛋白、补体等蛋白、补体等；流式细胞；流式细胞术测细胞表面抗原术测细胞表面抗原间接法间接法敏感性较高，不必标记每敏感性较高，不必标记每种一抗种一抗特异性较低特异性较低检测血清中抗体检测血清中抗体酶桥法酶桥法敏感性高敏感性高过氧化物酶稀释度难过氧化物酶稀释度难以把握；背景较高以把
45、握；背景较高其衍生的其衍生的PAP法和法和APAAP法应用广泛法应用广泛ABC法法敏感性高，背景干净敏感性高，背景干净易受内源性生物素干易受内源性生物素干扰扰应用最为广泛应用最为广泛EnVision法法敏感性和特异性显著高于敏感性和特异性显著高于其他方法，更省时简便其他方法，更省时简便EnVision复合物分子复合物分子大，定位核内抗原较大，定位核内抗原较差差应用广泛应用广泛CSA法法敏感性和特异性高，尤其敏感性和特异性高，尤其定位核内抗原定位核内抗原严重内源性物质干扰严重内源性物质干扰应用较少应用较少酶组织化学技术酶组织化学技术 酶（酶（enzyme）生物体内催化各种化学反应和新陈代谢的特殊
46、蛋白质）生物体内催化各种化学反应和新陈代谢的特殊蛋白质 组织细胞内的酶并不直观可见，但酶可催化特定底物产生组织细胞内的酶并不直观可见，但酶可催化特定底物产生相应反应产物，通过检测产物即可在酶所在部位获得相应相应反应产物，通过检测产物即可在酶所在部位获得相应信号。这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应产物信号。这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应产物信号来显示细胞和组织结构中的各种酶，对其进行定性、信号来显示细胞和组织结构中的各种酶，对其进行定性、定位和定量分析的方法称为酶组织化学技术定位和定量分析的方法称为酶组织化学技术1950s广泛应用于病理学，广泛应用于病理学，操作复杂，必需新鲜组织
47、操作复杂，必需新鲜组织以保持酶活性以保持酶活性,反应特异性反应特异性较低，限制了其应用较低，限制了其应用 酶组织化学技术酶组织化学技术 底物经酶分解后，其产物可与大多数金属结合，底物经酶分解后，其产物可与大多数金属结合，如金、银、铜、铁、铅、钴及其化合物，产物如金、银、铜、铁、铅、钴及其化合物，产物呈特定颜色呈特定颜色 基本原理是应用特定人工合成底物进行酶促反基本原理是应用特定人工合成底物进行酶促反应，其分解产物再与重氮盐结合，引起偶联偶应，其分解产物再与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性偶氮色素氮反应，形成不溶性偶氮色素 无色底物经酶促反应，在局部形成色素沉着对无色底物经酶促反应，在局
48、部形成色素沉着对酶定位酶定位 酶组织化学技术酶组织化学技术（nucleic acid molecular hybridization）是）是检测核酸分子间序列同源性的一种技术。检测核酸分子间序列同源性的一种技术。p原理：核酸间的碱基互补结合，及原理：核酸间的碱基互补结合，及DNA高温变性低温复性高温变性低温复性p不同来源单链核酸只要彼此间不同来源单链核酸只要彼此间存在互补顺序存在互补顺序，就可复性形成，就可复性形成杂交体。链间序列互补程度越高，越容易结合形成杂交体结杂交体。链间序列互补程度越高，越容易结合形成杂交体结构且更加牢固不易洗脱。构且更加牢固不易洗脱。1969年由年由Pardue和和J
49、ohn等人在不同的实验室几乎同时建立等人在不同的实验室几乎同时建立 应用已知碱基顺序并带有标记物的探针（应用已知碱基顺序并带有标记物的探针（probe），与待检标本），与待检标本上的核酸特异性结合形成杂交体，再用与标记物相对应的检测系上的核酸特异性结合形成杂交体，再用与标记物相对应的检测系统，在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，用显微镜或电统，在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，用显微镜或电子显微镜进行细胞内定位。子显微镜进行细胞内定位。组织切片预处理组织切片预处理 探针制备探针制备 最大限度地保持细胞内最大限度地保持细胞内DNA或或RNA的完整性的完整性 组织具有良好的通透性组织具有
50、良好的通透性 探针类型标记方法优 点缺 点检测对象双链DNA缺口平移法随机引物法特异性高易自身粘连、使用前需变性处理DNA，mRNA单链DNA缺口平移法随机引物法特异性高不产生自身粘连探针制备较难DNA，mRNA单链cRNA通过转录形成特异性高，形成的杂交体稳定，不产生自身粘连易降解mRNA寡核苷酸末端标记特异性好，易制备，杂交时间短DNA，mRNA探针的标记探针的标记放射性标记放射性标记 优点：敏感性和特异性均较高优点：敏感性和特异性均较高缺点：有放射污染、成本高、实验周期较长缺点：有放射污染、成本高、实验周期较长 3H，35S，32P，14C和和125I等等非放射性标记非放射性标记 荧光素
