1、2022年10月19日星期三手足口病的实验诊断手足口病的实验诊断手足口病的病原w 手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）由人肠道病毒感染引起。w 人肠道病毒为小RNA病毒科（Picornaviridae），肠道病毒属（Enterovirus）的一组单股正链RNA病毒。其中包括埃可病毒（31个血清型）、柯萨奇病毒A组（23个血清型）和B组（5个血清型），还包括3个脊髓灰质炎病毒血清型和人肠道病毒68-71型。2Courtesy of Linda M.Stannard,University of Cape Town,S.A.hu30nmu二十面体对称u无包膜人肠道病毒
2、的毒粒结构人肠道病毒的毒粒结构3w 脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒：1909年年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。w 柯萨奇病毒柯萨奇病毒：1948年年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。w 埃可病毒埃可病毒：1951年年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。w 新肠道病毒新肠道病毒：随后随后新发现的病毒被按照序号命名（6971），最近，已
3、经命名至102型4肠道病毒主要血清型5手足口病的常见致病病原多种肠道病毒都可引起多种肠道病毒都可引起HFMD，主要为：，主要为：w 柯萨奇病毒A组的47、9、10、16型w B组的13、5型w 埃可病毒的部分血清型w 肠道病毒71型 最常见的为CV-A16和EV71 6肠道病毒的抵抗力肠道病毒的抵抗力w 肠道病毒无包膜，乙醚、75%酒精、表面活性剂等均不能将其灭活。w 对紫外线及干燥敏感；各种氧化剂（高锰酸钾、漂白粉等）、甲醛或56 30min都能灭活病毒w 病毒在4可存活1年，-20可长期保持感染性 w 病毒RNA有感染性。7（一）粪便标本（一）粪便标本采集病人发病采集病人发病7 7日内的粪
4、便标本，用于病原检测。粪便标本日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量采集量5 58g/8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，份，采集后立即放入无菌采便管内，44暂存立暂存立即即(12h(12h内内)送达实验室，送达实验室，2020以下低温冷冻保藏，需长期保以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于存的标本存于7070冰箱。冰箱。（二）脑脊液标本（二）脑脊液标本出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3 3日内，采集量日内，采集量为为1.01.02.0ml
5、2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，44暂存立即暂存立即(12h(12h内内)送达实验室，送达实验室，2020以下低温冷冻保藏，需以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于长期保存的标本存于7070冰箱。冰箱。手足口病的标本采集手足口病的标本采集8手足口病的标本采集手足口病的标本采集（三）血清标本（三）血清标本 采集急性期采集急性期(发病发病0 05 5天天)和恢复期和恢复期(发病发病14143030天天)双双份配对血清用于抗体检测。检测份配对血清用于抗体检测。检测IgMIgM时，采集时，采集(发病发病7 72020天天)血。静脉采集血。静脉采集3
6、 35ml5ml全血，置于真空无菌采血管中，自全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于凝后，分离血清，将血清置于2020以下冰箱中冷冻保存。以下冰箱中冷冻保存。（四）咽拭子标本（四）咽拭子标本 采集病人发病采集病人发病3 3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3 35ml5ml保存液（细保存液（细胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折
7、断棉签杆，旋紧管盖并密封，管盖并密封，44暂存立即暂存立即(12h(12h内内)送达实验室，送达实验室，2020以以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于7070冰箱。冰箱。9（五）疱疹液（五）疱疹液可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3 35ml5ml保存液保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本签杆，旋紧管盖并密封。所采集
8、标本44暂存立即暂存立即(12h(12h内内)送达实验室，送达实验室，2020以下低温冷冻保藏，需长期保存的标以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于本存于7070冰箱。冰箱。手足口病的标本采集手足口病的标本采集10标本采集器械要求w 注射器：医用（注射器：医用（5ml5ml和和10ml10ml）一次性注射器）一次性注射器w 棉拭子：塑料杆棉拭子：塑料杆w 全血收集管：全血收集管：10ml10ml螺口塑料管螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈外螺旋、带密封垫圈)w 血清保存管：血清保存管：2 ml2 ml螺口塑料管螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）可耐深低温（液
9、氮保存）w 粪便保存管：粪便保存管：5-20 ml5-20 ml螺口塑料管螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温（液氮保存）可耐深低温（液氮保存）-全国全国POLIOPOLIO网络实验室网络实验室11w 鼻咽拭子保存管：鼻咽拭子保存管：10 ml螺口塑料管螺口塑料管(外螺旋、带密封外螺旋、带密封垫圈垫圈)，可耐深低温（液氮保存），可耐深低温（液氮保存）w 痰液保存管：痰液保存管：50 ml螺口塑料管螺口塑料管(外螺旋、带密封垫外螺旋、带密封垫圈圈)，可耐深低温（液氮保存），可耐深低温（液氮保存）w 尸检组织冻存管：尸检组织冻存管：50ml螺口塑料管螺口塑料管(外螺旋、带
10、密封外螺旋、带密封垫圈垫圈)；尸检（每一个样品换手术刀）；尸检（每一个样品换手术刀）w 记号笔：油性，防水记号笔：油性，防水标本采集器械要求12 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液 中分中分离病毒具有很高的诊断价值。离病毒具有很高的诊断价值。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。持液或生理盐水，以防干燥。标本采集注意事项标本采集注意事项13标本采集注意事项标本采集注意事项 为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发为了保证检测结果的准确性和有效性，标本
11、应在病例发病后尽早采集，尽快检测。病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病恢复期血清在发病2-4周后采集。周后采集。14手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病鉴定离和病鉴定手足口病的实验室诊断手足口病的实验室诊断15手足口病的实验室诊断方法手足口病的实验室诊断方法w 病毒分离w 抗体检测w 核酸
12、检测w 蛋白/核酸芯片16标本标本病毒分离病毒分离CPE阳性阳性RT-PCR及序列测定及序列测定肠道病毒肠道病毒非肠道病毒非肠道病毒测双份血清测双份血清中和抗体滴度中和抗体滴度RT-PCRReal time RT-PCR检测病毒核酸检测病毒核酸序列测定序列测定无无CPE常规实验常规实验补充实验补充实验中和定型中和定型手足口病的实验室检测流程手足口病的实验室检测流程17病毒分离培养w 用于病毒分离的标本：包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本w 适用的细胞 RD细胞（人胚胎横纹肌肉瘤细胞）、Hep-2细胞（人喉上皮癌细胞）18病毒分离培养w标本的处理 1、粪便：2
13、g 加PBS 10ml，振荡混匀，1500g低温离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 2、咽拭子：于采样管中充分洗涤拭子，4下 10000rpm离心20min，上清0.2ml接种敏感细胞 3、脑脊液和疱疹液：直接接种19病毒分离培养w 培养观察：36培养逐日观察，第1代培养见可疑CPE 至观察满7天后再继续冻融传代，待稳定CPE出现后,-20或-70冻存以备进一步鉴定；如果7天之后没有出现CPE，需盲传2代继续观察，盲传2代后仍不出现CPE则判定为阴性；w 鉴定：中和试验20血清抗体检测w 方法 中和实验、ELISAnIgM：单份血：急性期nIgG：双份血：急性期，恢复期w阴转阳，四倍升
14、高，四倍降低均可诊断近期感染21病毒核酸检测RT-PCR RT-PCR(Reverse Transcriptase PCR)w 用于RNA病毒的检测，酶促催化使RNA逆转录成cDNA第一链，逆转录与第一次PCR在同一系统内进行，逆转录完成后，加热灭活逆转录酶，然后开始PCR扩增。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与mRNA杂交，然后由依赖RNA的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。22病毒核酸检测RT-PCR方法特点：方法特点：w 快捷、简便w 高度灵敏、特异w 具有病原诊断意义w 高效的通用型技术平台23 粪便标本：粪便标本：采用氯仿进行处理。肛拭子肛拭子/咽拭子标
15、本：咽拭子标本：咽拭子要在标本保存液中充分搅动，然后在4下，10000 rpm离心20min。疱疹液和脑脊液：疱疹液和脑脊液：直接用于RNA提取。标本的预处理标本的预处理24可使用商业化试剂盒从临床标本中提取病毒可使用商业化试剂盒从临床标本中提取病毒RNA 简化操作、规范方法、条件一致、排除干扰简化操作、规范方法、条件一致、排除干扰QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）适合临床标本和病毒培养物标本QIAGEN Rneasy Mini Kit（CAT：74104）适合组织和咽拭子标本RNA的提取的提取25引引 物物w 人肠道病毒（包括人肠道
16、病毒（包括EV71、CA16、CA24v、EV70）核酸检）核酸检测通用引物测通用引物 PE2（上游）：5-TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C-3 PE1（下游）：5-ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC-3 26EV71核酸检测引物序列：核酸检测引物序列：EV71-S（上游）：5-GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC-3EV71-A（下游）：5-ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC-3引引 物物27CA16核酸检测引物序列：核酸检测引物序列：Cox A16-S（上游）：5-ATT GGT GCT
17、CCC ACT ACA GC-3Cox A16-A（下游）；5-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3 引引 物物28根据自己实验室的实际情况建立各自RT-PCR反应体系配下列试剂主溶液：10PCR Buffer（含Mg2+）5.0ldNTPs（2.5mM each）2.0l上游引物（0.1g/l）1.0l下游引物（0.1g/l）1.0lRNA酶抑制剂（RNasin,40U/l）0.5lTaq DNA聚合酶（5U/l）0.5lAMV逆转录酶（10U/l）1.0l模板RNA 3.0lRNase Free dH2O 36.0l 50.0l反应体系反应体系29在PCR仪上进行RT-
18、PCR反应，反应步骤如下：4245min953min9520s5025s 32个循环 7230s7210min 4Soak 温度循环参数温度循环参数30通过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。结果解释结果解释31RT-PCR实验结果解释32实验室诊断原则实验室诊断原则w 人肠道病毒在自然界广泛存在且种类繁多，一病多原、人肠道病毒在自然界广泛存在且种类繁多，一病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征。因而应对血清诊一原多症是肠道病毒感染的重要特征。因而应对血清诊断及病原诊断的实验室结果作严格评价，必须结合临床断及病原诊断的实验室结果作严格评价，必须结合临床
19、症状及环境因素流行病学分析，以确立病毒与疾病的病症状及环境因素流行病学分析，以确立病毒与疾病的病原学关系。原学关系。w 一般采取的原则为：一般采取的原则为：n（1）病毒分离阳性率远高于对照人群；）病毒分离阳性率远高于对照人群；n（2）病程中有特异性抗体变化并排除其他病毒感染；）病程中有特异性抗体变化并排除其他病毒感染；n（3）从病变组织中分离出病毒。）从病变组织中分离出病毒。33从疑为肠道病毒感染的脑炎从疑为肠道病毒感染的脑炎/脑膜炎患者的脑膜炎患者的脑脊液脑脊液中检测中检测到相应的肠道病毒核酸（到相应的肠道病毒核酸（RT-PCR法），或分离到病毒或肠法），或分离到病毒或肠道病毒道病毒IgM阳
20、性，即可证明是该肠道病毒引起的中枢神经系阳性，即可证明是该肠道病毒引起的中枢神经系统感染。统感染。从疑为死于从疑为死于EV71（或其它肠道病毒）的（或其它肠道病毒）的尸检标本尸检标本中检测中检测到相应的肠道病毒核酸，或分离到病毒或肠道病毒到相应的肠道病毒核酸，或分离到病毒或肠道病毒IgM阳性，阳性，即可证明是该肠道病毒是病因。即可证明是该肠道病毒是病因。从从HFMD患者的患者的疱疹液疱疹液中检测到相应的肠道病毒核酸，或中检测到相应的肠道病毒核酸，或分离到病毒，那么该病毒就是病因病原。分离到病毒，那么该病毒就是病因病原。实验结果的诊断意义实验结果的诊断意义34实验结果的诊断意义实验结果的诊断意义
21、 当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊断当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据。肠道病毒有时引起无方法可以作为病毒感染的间接证据。肠道病毒有时引起无症状感染，只从个别症状感染，只从个别HFMD患者粪便标本中分离到患者粪便标本中分离到EV71（或其它肠道病毒）时，不能轻易下结论（或其它肠道病毒）时，不能轻易下结论EV71是病因，是病因，应该扩大样本量，所以实验结果的实际意义应结合临床过应该扩大样本量，所以实验结果的实际意义应结合临床过程和流行病学资料进行解释。程和流行病学资料进行解释。35手足口病检测实验室相关问题 1、实验室生物安全问题：必须重视的
22、问题、实验室生物安全问题：必须重视的问题实验人员受过生物安全培训 有防范潜在生物危害的意识 熟悉生物安全规程，掌握生物安全技能实验室自己的生物安全指南合格的生物安全实验室实验室文件化的规程及方法（包括常规的和特殊的）362 2、PCRPCR实验室质量控制问题：实验室质量控制问题：保证实验结果可靠的必要手段保证实验结果可靠的必要手段 实验对照：阳性、阴性、试剂、空白对照 控制实验室核酸污染 试剂污染 器械污染 实验过程污染手足口病检测实验室相关问题37手足口病检测实验室相关问题 3、实验结果的应用问题：、实验结果的应用问题：综合分析、排除干扰、合理运用综合分析、排除干扰、合理运用 阳性结果：排除假阳性干扰 分析阳性结果的价值 阴性结果：分析可能的原因（样品采集？过程规范？核酸降解？试剂质量？临床信息误导？）38
