1、和检测与临床应用和检测与临床应用汇报内容汇报内容和的简介及临床意义和的简介及临床意义的基本原理和技术特点的基本原理和技术特点等位特异性引物设计等位特异性引物设计试剂盒开发简介试剂盒开发简介和的简介及临床意义和的简介及临床意义背景背景是一种原癌基因，长约是一种原癌基因，长约35，位于，位于12号染色体，是基因家族成员之一号染色体，是基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与，编码的蛋白主要参与3K、和、信号通路的调控；、和、信号通路的调控；在通路中位于上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性，导在通路中位于上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性，导致的活化和通路中信号传导；致的活化和通路中信
2、号传导；是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（6590%）、结直肠癌（）、结直肠癌（40%）、肺癌（）、肺癌（20%）、卵巢癌（）、卵巢癌（15%）。）。基因突变影响结直肠癌药物疗效基因突变影响结直肠癌药物疗效基因野生型的转移性结直肠癌患者能从抗体（西妥昔单抗、帕尼单抗基因野生型的转移性结直肠癌患者能从抗体（西妥昔单抗、帕尼单抗）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于野生型患者突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于野生型患者,2008,N J 结直
3、肠癌患者检测突变相关指南结直肠癌患者检测突变相关指南欧洲药品评估局（，欧洲药品评估局（，2008）指出：野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受）指出：野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。益，而突变型患者受益较少。美国临床肿瘤学会（，美国临床肿瘤学会（，2009）推荐：转移性结直肠癌患者应检测突变，如有）推荐：转移性结直肠癌患者应检测突变，如有12、13位位突变，则不应进行单克隆抗体治疗；突变，则不应进行单克隆抗体治疗；美国指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前必须美国指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直
4、肠癌前必须检测基因的基因型；检测基因的基因型；2012年年7月月6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（），以判断日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（），以判断西妥昔单抗是否有效；西妥昔单抗是否有效；美国国立综合癌症网络（，美国国立综合癌症网络（，2014）指南说：转移性结直肠癌患者均应进行突变检测（）指南说：转移性结直肠癌患者均应进行突变检测（和），至少应检测第二外显子的突变情况。或突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕和），至少应检测第二外显子的突变情况。或突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。尼单抗治疗。中国卫生部于中国卫生部于2010年年10月月14日发表了结直肠癌诊疗规范（日发表了
5、结直肠癌诊疗规范（2010版）版）。明确指出。明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受西妥昔单抗、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受西妥昔单抗、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织的基因状态。在晚期织的基因状态。在晚期/转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤 基因状态，不推基因状态，不推荐作为常规检查项目。荐作为常规检查项目。基因突变影响非小细胞肺癌药物疗基因突变影响非小细胞肺癌药物疗效效基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（，如吉非替尼、基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（，如吉非替尼、厄洛替
6、尼）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗；厄洛替尼）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗；突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中红线突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中红线所示）所示）,2011,.,2005,J 非小细胞肺癌患者检测突变相关指非小细胞肺癌患者检测突变相关指南南美国国立综合癌症网络（，美国国立综合癌症网络（，2009）指出，突变与非小细胞肺癌患者）指出，突变与非小细胞肺癌患者抵抗有关，基因测序有助于确定哪些病人适合治疗。当基因发生了突抵抗有关，基因测序有助于确定哪些病人适合治疗。当基因
7、发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗。变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗。主要突变位点主要突变位点在结直肠癌中，突变主要发生于在结直肠癌中，突变主要发生于12(80%)、13(15-20%)、61和和146(C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746750(1)192235-2249156223E746750(2)192236-2250156225L747753S192240-22571812370E746750I192235-2252()13551E746750192235-22531812728E746750A19223
8、7-2251 1512678E746752A192237-2254 1812367E746752V192237-2250 T()12384E746752D192238-2255 186220L747750P192238-2248()12422L747751Q192238-2252()12419L747749192239-224796218L747751192239-2253156254L747752192239-2256186255L747750P192239-2248 C12382L747753Q192239-2258()12387L747751S192240-2251126210L7477
9、51192240-22541512369L747751P192239-2251 C()12383T790M202369C T6240S768I202303GT6241V769770202307-2308 12376H773774202319-2320 12377D770771202310-2311 12378L858R212573TG6224L861Q212582TA6213突变与药物疗效关系突变与药物疗效关系所在外显子所在外显子突变类型突变类型与疗效关系与疗效关系18G719A()3种点突变种点突变药敏突变药敏突变1919种缺失突变种缺失突变药敏突变药敏突变20点突变点突变S768I药敏突变
10、药敏突变20点突变点突变T790M耐药突变耐药突变*203种插入突变种插入突变耐药突变耐药突变*21点突变点突变L858R药敏突变药敏突变21点突变点突变L861Q药敏突变药敏突变 试剂盒突变结果检测试剂盒突变结果检测组别组别突变类型突变类型所占比例所占比例对吉非替尼对吉非替尼敏感性证据敏感性证据 1 19;L858R 90%充分充分2T790;T790858R;G719X;L861Q;S768I 7%有限有限3T790M;20;3%无无的基本原理和技术特点的基本原理和技术特点原理原理是是 (扩增阻碍突变系统扩增阻碍突变系统)的缩写。的缩写。根据根据 过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现
11、对突变位点的过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对突变位点的检测检测,当引物当引物 3 末端出现错配时末端出现错配时,产物将不能延伸。产物将不能延伸。因此设计两条上游（或下游）引物，使其因此设计两条上游（或下游）引物，使其3末端分别与突变位点碱基末端分别与突变位点碱基匹配和错配，共用下游（或上游）引物，分别扩增野生型和突变型目匹配和错配，共用下游（或上游）引物，分别扩增野生型和突变型目的片断。的片断。原理原理 (),a .3.,.a a ,().F.M.2008,产物检测产物检测 每个循环检测荧光信号，不同产物，不同荧光信号每个循环检测荧光信号，不同产物，不同荧光信号相比凝胶电泳：更快，
12、可定量，无产物污染相比凝胶电泳：更快，可定量，无产物污染信号产生方法：信号产生方法：()，双环探针，双环探针(厦门艾德厦门艾德)，2 2 .G.V.2013,应用于应用于 的的GCATGAAGG alleleA allele55553333AS primerAS primerMismatchMismatchReverse primerReverse primerFAM-53-BHQ1FAM-53-BHQ1ProbeProbe技术特点技术特点优点：优点：灵敏度高（灵敏度高（0.1-1%0.1-1%）操作简便操作简便周期短周期短不产生产物污染不产生产物污染适用样本类型多（如）适用样本类型多（如）精
13、确突变类型精确突变类型缺点：缺点：方法建立需时较长方法建立需时较长仅能检测已知突变仅能检测已知突变测序法与法相比较测序法与法相比较测序法测序法焦磷酸测序焦磷酸测序敏感度敏感度10-20%5-10%1%标本成功率标本成功率 低低较高较高高高商用试剂盒商用试剂盒无无有有有有流程与速度流程与速度1-2天天2-3天天1312131213121312131213三引物设计原理三引物设计原理 F.M.2008,三引物设计三引物设计野生型引物（野生型引物（F）53 19，51突变型引物（突变型引物（F）53 19，49下游引物（下游引物（R）53 25，54三引物设计三引物设计下游引物设计下游引物设计选择序
14、列：选择序列：53互补链：互补链：3-5下游引物：下游引物：5-33端增加错配端增加错配如果如果3端是弱错配（或）则需要引入强的错配（或）才可阻断端是弱错配（或）则需要引入强的错配（或）才可阻断3端端的扩增；的扩增；如果如果3端是强错配（或）则需要引入弱的错配（或）或不需引入错端是强错配（或）则需要引入弱的错配（或）或不需引入错配即可阻断配即可阻断3端的扩增；端的扩增；当当3端是中度错配（，端是中度错配（，或）则需要引入中度的错配。或）则需要引入中度的错配。野生型引物（野生型引物（F）53 突变型引物（突变型引物（F）53下游引物（下游引物（R）53四引物设计四引物设计四引物设计四引物设计内引
15、物（内引物（F）53 内引物（内引物（R）53外引物（外引物（F）53外引物（外引物（R）53试剂盒开发简介试剂盒开发简介突变探针和引物设计突变探针和引物设计序列：序列：1.5 3 12 2.5-3 12 3.5-3 12 4.5-3 12 5.5-3 12 6.5-3 12 7.5-3 13 8.参照引物：参照引物：5 39.下游引物：下游引物：53 探针：探针：51-3锁核酸阻滞探针锁核酸阻滞探针(野生型野生型)：5 04-3浙江大学，浙江大学，102367478 B反应体系反应体系 引物终浓度：引物终浓度：0.3 M Taqman探针终浓度：探针终浓度：0.1 M LNA阻滞探针终浓度：
16、阻滞探针终浓度：0.9 M Goldstarbest Taq酶终浓度：酶终浓度：0.05 U/l 模板模板DNA终浓度：终浓度：10-300 ng/l dNTPs终浓度：终浓度：0.2 mM MgCl2 终浓度：终浓度：3.5 mM 循环循环:95C预变性预变性10分钟分钟95C 15秒秒60C 40秒秒扩增反应扩增反应40循环，循环，60C 40秒秒在在7500或或480检测仪上进行。每个样本进行检测仪上进行。每个样本进行8管反应，每管反应管反应，每管反应加入共同的混合液，阻滞探针及模板，所不同的只有参照引物加入共同的混合液，阻滞探针及模板，所不同的只有参照引物或者引物。或者引物。拟开发产品
17、拟开发产品特异性引物：特异性引物：7条条 （检验特异性）（检验特异性）参照引物：参照引物：1条条（检验特异性）（检验特异性）下游引物：下游引物：1条条（检验特异性）（检验特异性）探针：探针：1条条锁核酸阻滞探针：锁核酸阻滞探针：1条条阳性对照：包含阳性对照：包含7种突变的质粒模板（测序）种突变的质粒模板（测序）酶，最好为酶，最好为 （)混合反应液混合反应液结果判读结果判读参照引物管扩增曲线阳性，各种引物管均无扩增曲线或者其与参照引参照引物管扩增曲线阳性，各种引物管均无扩增曲线或者其与参照引物管的扩增曲线差值物管的扩增曲线差值 10，该样本结果判断为野生型；，该样本结果判断为野生型；参照引物管扩增曲线阳性，相应引物管扩增曲线阳性，且其与参照引参照引物管扩增曲线阳性，相应引物管扩增曲线阳性，且其与参照引物管的扩增曲线差值物管的扩增曲线差值 7，该样本结果判读为可疑突变型；如重复检，该样本结果判读为可疑突变型；如重复检测测3次均显示扩增曲线阳性，该样本结果判读为突变型；次均显示扩增曲线阳性，该样本结果判读为突变型；参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新提取。参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新提取。
