1、流感禽流感实验室诊断及新技术新进展（优选）流感禽流感实验室诊断及新技术新进展流感病毒病原学3（1）血凝素(Hemagglutinin HA)：（柱形）凝集红细胞血凝现象，用于鉴定病毒 吸附宿主细胞与受体结合（侵入细胞的关键）抗原性相应抗体，有中和作用 易变异（分亚型）（2）神经氨酸酶（Neuraminidase NA）：（蘑菇形）参与病毒释放，促进病毒扩散 抗原性 易变异（分亚型）（3）病毒变异：抗原漂移和抗原转变亲脂类病毒或中等大小的病毒亲脂类病毒或中等大小的病毒（如：（如：HSV,CMV,RSV,HIV,HBV）细菌繁殖体（如：金葡，绿脓）细菌繁殖体（如：金葡，绿脓）真菌（如，念珠菌属，曲
2、霉属）真菌（如，念珠菌属，曲霉属）非脂类或小病毒（如脊非脂类或小病毒（如脊髓灰质炎病毒髓灰质炎病毒,柯萨奇病毒）柯萨奇病毒）分枝杆菌（如分枝杆菌（如TB，M.terrae）Cryptosporidium parvum 隐孢子虫隐孢子虫 细菌芽孢细菌芽孢Prions敏感敏感耐受耐受低效中效 高 效灭菌灭菌（高，延时）（高，延时）消毒剂水平消毒剂水平气体灭菌气体灭菌蒸汽灭菌蒸汽灭菌 理化特性：病理化特性：病毒对乙醇、碘毒对乙醇、碘伏、碘酊敏感；伏、碘酊敏感；对热敏感，对热敏感，56305630分钟可分钟可灭活。灭活。流感病毒病原学5 宿主范围：人、猪、马、禽类等 宿主界限不十分严格，在一定的条件下
3、可突破种间屏障，在不同种间传播 动物流感同人类流感关系密切。猪是储存宿主，也可能是“混合器”流感病毒病原学6 培养特点 细胞、动物 致病性和免疫性 病毒侵入人体后在呼吸道黏膜和肺部繁殖，病毒和其代谢产物进入血液引起相应的临床症状。引起体液和细胞免疫流感监测目的（一）监测流感活动水平和流行动态；（二）及时发现流感病毒变异并作出预警；（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。7%on day 9.2：The six internal genes were鼻拭子 鼻洗液、含漱液可用MDCK细胞和SPF鸡胚分离流感病毒，对于高致病性禽流感病毒分离要求BSL-3实验室；注意：在试验过程中，保持
4、所有的试剂在冰架上保持低温。1：The HA and NA genesdomestic birds and then to（1）血凝素(Hemagglutinin HA)：（柱形）每日观察细胞病变(CPE)5)鸡蛋开孔器on day 7,and frequency was 3.N1,N2,N4,N7 H5N1,H7N7,H9N2,2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。Hanks液清洗细胞注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。反应条件：逆转录50 30min
5、95 2min（95 15s 55 30s*）45H7N9和H9N2混合感染（环境样品）3335培养72小时were still unknown,but ducks流感监测内容（一）流感样病例监测（二）流感样病例暴发疫情监测流感样病例监测标本采集 采集对象：流感样病例流感样病例 发热（体温发热（体温3838），伴咳嗽或咽痛之一者），伴咳嗽或咽痛之一者 采集时间：病人发病的头3天内采集，最好是24h内 采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院 采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家哨点医院每周至少采集20份流感样病例的标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时调整）暴发疫情标本采集（1）1
6、周内，在同一学校、幼儿园或其他集体单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联的死亡病例；（2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内出现流感样病例异常增多。每一起暴发疫情一般应当采集10份咽、鼻拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当全部采样）。细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状尸检标本H7N9和H9N2混合感染（培养样品）标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL）RT-PCR、real-time RT-PCR April 11,t
7、he first publication on the易变异（分亚型）分子级无菌蒸馏水(无RNA酶和DNA酶)加入病毒生长液，3335度培养箱培养 一代测序对已知病原体进行测序（需要特异性扩病毒侵入人体后在呼吸道黏膜和肺部繁殖，病毒和其代谢产物进入血液引起相应的临床症状。理化特性：病毒对乙醇、碘伏、碘酊敏感；核酸提取-QIAamp Viral RNA Mini Kit置的ddNTP决定的。瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。流感禽流感实验室诊断及新技术新进展5ml 离心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室温静置13分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即实验或2
8、0以下保存。H9N2 virus populations of2探针工作浓度（10/20M/）QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit，Cat No.The Origin of H7N9注意：采样前1h内不要进食和饮水，采样液中严禁加入抗生素采集标本类型 常规常规特殊特殊咽拭子咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻拭子 鼻洗液、含漱液 血清 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本采样液 常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hanks液或MEM；标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL）咽拭
9、子采集咽拭子咽拭子 用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。注意：采样前1h内不要进食和饮水，采样液中严禁加入抗生素标本的保存与运送 标本采集后应在4条件下，尽快（哨点监测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网络实验室 未能送至实验室的，应置-70或以下保存，一周内送实验室 冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷藏条件下送到实验室实验室生物安全要求l季节性流感病毒分离鉴定在生物安全级实验室进行。l流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全级实验室的生物安全柜里操作。l用灭
10、活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全级实验室进行标本的接收 接收标本时必须核对送检表 流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”（表2）录入到“监测信息系统”标本的处理 标本送至实验室后，立即进行处理，未加抗菌素的加入适量的抗菌素。将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测程序实时调整）实验室检测分子诊断RT-PCR、real-time RT-PCR主要选用的基因片段：M基因-检测A型流感，NS基因-检测B型流感，HA基因-检测禽流感、季节流感H1/H3以及其
11、他亚型病毒分离和血凝抑制试验可用MDCK细胞和SPF鸡胚分离流感病毒，对于高致病性禽流感病毒分离要求BSL-3实验室；可以诊断感染，但无法为临床诊断及时提供结果。快速试纸条法一些商用快速检测可以区分A和B型流感病毒，但是检测季节性流感病毒的灵敏度不佳。因此，快速检测阴性结果可能是假阴性，不能作为禽流感感染的最后诊断。免疫荧光法免疫荧光试验可以区分A和B型流感病毒。免疫荧光试验的结果取决于临床标本的质量，操作技能。因此，免疫荧光试验阴性结果可能是假阴性，不能作为禽流感感染的最后诊断。血清学季节性流感检测流程临床标本采集接种MDCK细胞接种鸡胚红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒红细胞凝集试验流感病毒核酸
12、检测阳性PCR鉴定人感染高致病性禽流感标本实验室检测流程图呼吸道、尸检标本、其它标本病毒分离和鉴定标本采集对象血清标本HI试验、微量中和试验、单扩溶血报告采集检测第三份血清双 份 血 抗 体滴度4倍增长核酸检测：RT-PCR或Real-Time PCR，引物至少应包括A、两对H5再次采样再次检测按照人流感监测方法分离鉴定可疑A及两对H5阳性阳性两对H5阴性阴性扩增产物序列测定 双份血抗体滴度无4倍增长报告报告核酸检测的原理 核酸提取的原理 PCR的原理 实时荧光定量PCR的原理试剂：Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitativ
13、e Kit（公司：Invitrogen，货号：11732-020或11745-100）H4,H5,H6,H7,H9,H10 ,H7N96的Hanks液或MEM；鸡胚在收获前应4过夜或至少放置4小时瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。WAVE III用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。人类体细胞中有31亿个碱基对。标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置H3N2,H13N9H7N9和H9N2混合感染（培养样品）因此，快速检测阴性结果可能是假阴性，不能作为禽流感感染的最后诊断。CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION7）将吸附柱
14、放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液，13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。红细胞凝集试验（HA）（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION红细胞凝集抑制试验步骤3335培养72小时H7N9和H9N2混合感染（环境样品）标本采集后应在4条件下，尽快（哨点监测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网络实验室（3）将100M的引物2.核酸提取的原理 无论是从真核细胞或是从细菌病毒中提取核酸，涉及的基本原理是使细胞膜或细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，再用某些有机
15、溶剂抽提使核酸分离或使核酸吸附于某些颗粒的表面，再进行沉淀或洗脱，从而获取核酸。核酸提取 核酸提取-QIAamp Viral RNA Mini Kit 1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。5）重复步骤4。6）将吸附柱放入一新的
16、2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液，13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室温静置13分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即实验或20以下保存。PCR技术的原理 生物体的遗传物质：核酸（DNA/RNA）碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。人类体细胞中有31亿个碱基对。除了真正双胞胎外,每个人的DNA是独一无二的,就好像指纹一样。PCR技术的原理 PC
17、R的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的DNA片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。特异性：引物序列 灵敏度：扩增100万倍1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2535轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍RT-PCR和real-time PCR RT-PCR：即逆转录PCR，扩增的模板为RNA，增加RNADNA过程。Real-time PCR：即实时荧光定量PCR，是指在PCR反应体系中加
18、入荧光基团，利用荧光信号积累实实时监测时监测整个PCR进程。RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation双标记探针（双标记探针（Taqman Probe）荧光定量PCR 第一次使用前引物稀释 1引物工作浓度（40M）配制方法：（1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的量为9.1 nmol，加水量为109.191l）（3）将100M的引物2.5倍稀释，此时浓度为40M，可作为工作浓
19、度。2探针工作浓度（10/20M/）配制方法：（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（3）将100M的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20M，可作为工作浓度。荧光定量PCR 引物和探针 稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；涡旋振荡引物和探针；瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。real-time RT-PCR的试剂 QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit，C
20、at No.204443 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。荧光定量PCR反应体系和条件 试剂：Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitative Kit（公司：Invitrogen，货号：11732-020或11745-100）分子级无菌蒸馏水(无RNA酶和DNA酶)正反向引物(40M)双重标记探针(10M)反应条件：逆转录50 30min95 2min（95 15s 55 30s*）45 反应体系为25ul 注：*在55 度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）荧光PCR结果阳性样品荧光PCR结果阴性样品荧光PC
21、R结果可疑样品（1）血凝素(Hemagglutinin HA)：（柱形）稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确可用MDCK细胞和SPF鸡胚分离流感病毒，对于高致病性禽流感病毒分离要求BSL-3实验室；绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL）人类体细胞中有31亿个碱基对。进化生物学是研究生命的起源及进化的过possibly been evolved for at 下一代测序技术（next-generation开窗接种H7N9表面基因相对保守RT-PC
22、R和real-time PCR注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液Avian InfluenzaH3N2,H13N9红细胞凝集试验（HA）3%versus 96.待鉴定病毒确保没有被细菌污染RT-PCR：即逆转录PCR，扩增的模板为RNA，增加RNADNA过程。on day 7,and frequency was 3.鸡胚分离方法-试剂准备病毒分离-MDCK细胞3335培养接种流程清洗MDCK 细胞临床采样标本接种细胞Hanks液清洗细胞，一般清洗2遍3335度吸附12小时Hanks液清洗细胞加入病毒生长液，3335度培养箱培养24小时后，观
23、察细胞病变。当细胞病变为3+或4+时，即75100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融12次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于第7天收获（细胞病变情况：细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）根据使用的细胞瓶的大小，决定接种量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临床标本流程图MDCK细胞病毒分离lCPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性有关l每日观察细胞病变(CPE)l标本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA试验阴性者，继续盲传12代后，HA试验仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴性，
24、标本可弃去 细胞病变图鸡胚病毒分离检卵标本准备鸡胚分离方法-试剂准备1)91)91111日龄鸡胚日龄鸡胚2)2)照蛋灯照蛋灯3)70%3)70%7575酒精酒精4)1ml 4)1ml 一次性注射器一次性注射器5)5)鸡蛋开孔器鸡蛋开孔器6)6)无菌胶布或蜡无菌胶布或蜡7)10ml 7)10ml 试管和试管架试管和试管架8)10ml 8)10ml 移液管或移液管或1ml1ml移液器及无菌吸尖移液器及无菌吸尖9)9)无菌镊子无菌镊子10)10)无菌眼科剪无菌眼科剪H4,H5,H6,H7,H9,H10 ,H7N9用70%75酒精消毒鸡胚顶部were still unknown,but ducks流感
25、监测网络实验室的工作人员接到标本后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”（表2）录入到“监测信息系统”on day 7,and frequency was 3.鸡胚分离方法-标记鸡胚或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；Hanks液清洗细胞，一般清洗2遍带负电的分子向正极泳动，片段的迁移率取决于分子量：小分子量的片段比大分子量的片段泳动得快。4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。分子级无菌蒸馏水(无RNA酶和DNA酶)可用MDCK细胞和SPF鸡胚分离流感病毒，对于高致
26、病性禽流感病毒分离要求BSL-3实验室；当细胞病变为3+或4+时，即75100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融12次，以提高收获标本的病毒滴度。5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。Timeline of the clinical course of the patient and identification of causative pathogen死胚模糊，成淤血带或淤血块凝集红细胞血凝现象，用于鉴定病毒标本采集后应在4条件下，尽快（哨点监测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网络实验室2探针工作浓度（10/
27、20M/）Timeline of the clinical course of the patient and identification of causative pathogenH7N9和H9N2混合感染（培养样品）鸡胚分离方法-标记鸡胚 检视标记鸡胚 用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉 接种病毒方法接种病毒方法 单
28、腔接种 盲种双腔接种 灯下接种 开窗接种鸡胚分离方法鸡胚分离方法鸡胚分离流程（1）将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样本接种3个鸡胚 用70%75酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10 x6mm窗口 用注射器吸200l处理过的临床标本，装上16 号针头 从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100l标本。将针头退出至 寸，将另外100 l标本 注入鸡胚尿囊腔鸡胚分离流程（2）用同一注射器和针头将同
29、一标本依上法接种另外的两枚鸡胚将针头弃于合适的生物安全装置中用消毒过的医用胶布封口 3335oC 温箱培养鸡胚23 天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去鸡胚分离流程（3）收获尿囊液和羊水收获尿囊液和羊水鸡胚在收获前应4过夜或至少放置4小时标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致用70%75酒精消毒鸡胚顶部用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并鸡胚
30、病毒鉴定l 经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去鸡胚收获HA试验病毒鉴定 红细胞凝集 红细胞凝集抑制试验病毒鉴定流程红细胞凝集试验4个凝集单位配制“回滴”红细胞凝集抑制试验判定流感病毒型别红细胞凝集试验（HA）lMDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度l 原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有
31、蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现结合后，可以抑制凝集现象出现红细胞红细胞鸡鸡火鸡火鸡豚鼠豚鼠人人 O 型 血 红型 血 红细胞细胞马马适用范围流感和禽流感病毒流 感 和 禽流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒终浓度（）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔底部形状U或V型U或V型U型U型U型孵育时间30mi
32、n30min45min45min60min细胞对照细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细 胞 沉 积成 圆 点 状，倾 斜 时细 胞 向 下流 成 泪 滴状细胞沉积成环状细胞沉积成环状细胞沉积成环状AHBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul稀释完病毒液后加入稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液红细胞悬液50ulPBS稀释病毒加入配制好的红细胞悬液充分混匀，置室温孵育30-60分钟观察记录结果病病毒毒原原液液1：21：128HA：32HA128 HA：4（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。
33、或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；进化生物学是研究生命的起源及进化的过流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”（表2）录入到“监测信息系统”细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状Subtype:H9N2盲种RT-PCR和real-time PCR进化生物学是研究生命的起源及进化的过鼻拭子 鼻洗液、含漱液双标记探针（Taqman Probe）标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL）H7N9表面基因相对保守方向（Direction）：要
34、去哪？双腔接种 灯下接种H3N2,H13N9（1）血凝素(Hemagglutinin HA)：（柱形）CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION荧光PCR结果阳性样品parvum 隐孢子虫绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限（二）及时发现流感病毒变异并作出预警；红细胞凝集试验（HA）lHA滴度8，进行红细胞凝集抑制（HI）试验；HA滴度8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴度8后，再进行HI测定l若传12代后，HA滴度仍8者，可应用核酸检测方法进行鉴定红细胞凝集抑制（HI）试验
35、 HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标准参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI）试验，确定病毒的型别和亚型，进行HI试验时，需同时进行4种标准抗原对照。红细胞凝集抑制试验步骤 4个凝集单位的配制和检测 稀释血清 加入25ul 4个血凝单位抗原，室温孵育15-30分钟 每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。室温孵育30-60分钟 观察记录结果4个凝集单位的配制和检测 4个凝集单位的配制 读取红细胞凝集试验的结果 计算所须的4个凝集单位的病毒用量 用50ul检测4个凝集单位时，用凝集效价除以8，所得商即
36、为4个单位的稀释度 用红细胞凝集试验“回滴”，复核4个凝集单位 用50ul，前4孔完全凝集。此时的抗原即为4个凝集单位红细胞凝集抑制试验稀释血清红细胞凝集抑制试验稀释血清12765349810H1血清50ulH3血清50ul50ulPBSB血清50ul25ulPBS25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ulB血清50ulH3血清50ulH1血清50ul流感病毒的型别判定 标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价20才可以算为阳性 一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制 待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以
37、判定为此型别的流感病毒红细胞凝集抑制试验-质量控制 使用的试剂可靠无误 处理后的血清有无残余非特异性凝集素 读取HA试验的结果是否正确 4个血凝单位是否准确 红细胞阴性对照 待鉴定病毒确保没有被细菌污染 稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确一代测序原理：Sanger 测序双脱氧末端终止法1977年，英国人Fred Sanger 发现，如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。1980年诺贝尔化学奖带负电的分子向正极泳动，片段的迁移率取决于分子量：小分子量的片段比大分子
38、量的片段泳动得快。CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTIONCHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION技术的进步 以Sanger法（双脱氧核苷酸末端终止法）为代表的第一代测序技术帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组图谱等大量测序工作，但由于其存在成本高、速度慢、通量低等不足，并不是后基因组时代最理想的测序方法。进入21世纪后，以Roche 454、Illumina Solexa和ABISOLiD为代表的第二代测序技术诞生了，并迅速掀起了你追我赶的技术比拼高潮。测序技术的进步。测序
39、通量不断提升，测序成本不断降低，现在已经进入了一千美元测一个人全基因组的时代。HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标准参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI）试验，确定病毒的型别和亚型，进行HI试验时，需同时进行4种标准抗原对照。带负电的分子向正极泳动，片段的迁移率取决于分子量：小分子量的片段比大分子量的片段泳动得快。across Korea核酸提取-QIAamp Viral RNA Mini Kit几百万条DNA分子进行序列测定的高通量荧光PCR结果阴性样品H3N2,H13N9Subtype:H7N
40、9 March 31,identification of H7N9鸡胚分离方法-标记鸡胚 March 31,identification of H7N9RT-PCR：即逆转录PCR，扩增的模板为RNA，增加RNADNA过程。置的ddNTP决定的。注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL）3335度吸附12小时核酸提取-QIAamp Viral RNA Mini Kit鸡胚在收获前应4过夜或至少放置4小时带负电的分子向正极泳动，片段的迁移率取决于分子量：小分子量的片段比
41、大分子量的片段泳动得快。注：*在55 度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）2探针工作浓度（10/20M/）几百万条DNA分子进行序列测定的高通量CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION下一代测序技术 下一代测序技术（next-generationsequencing）是对传统Sanger法测序的一次革命性的改变，是一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测序技术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。为什么要使用二代测序技术 一代测序
42、对已知病原体进行测序（需要特异性扩增）对基因组较大的物种进行测序 可得到更准确的数据（数据覆盖度更高）可对原始标本和病毒含量低的样品进行测序 对变异频繁的病原体进行测序 检测低频突变 排除其他病原体感染 混合样本测序以前完成一个人类基因组的测序需要 3 年 时间,而使用二代测序技术则仅仅需要 1 周为什么流感病毒适用于NGSH3N2,H13N9H3N8,H7NH3N2,H4N57H1-H16,N1-N9H3N8H1N1,H2N2,H3N2,H5N1,H7N7,H9N2,H10N7H4,H5,H6,H7,H9,H10 ,H7N9N1,N2,N4,N7 H5N1,H7N7,H9N2,H7N9CHI
43、NESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTIONH4N6H1N1,H1N2,H2N3,H3N2,H4N6CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION利用CoverageAnalysis插件可以进行禽流感分型Subtype:H9N2Subtype:H7N9CHIESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTIONH7N9和H9N2混合感染（培养样品）H7N9和H9N2混合感染（环境样品）环境样品及其培养样品的比较：环境样本也能很好地分型Clinical and
44、epidemiological characteristics of a fatal case ofavian infl uenza A H10N8 virus infection:a descriptive studyTimeline of the clinical course of the patient and identification of causative pathogenFrequency of glutamic acid was 87.6%versus 12.4%for lysine in the sample obtainedon day 7,and frequency
45、 was 3.3%versus 96.7%on day 9.深度测序发现PB2的第627位的杂合突变Glu/Lys,其与病毒感染哺乳动物相关；在治疗过程中，Lys的突变比例增高对应其逐渐增强的毒力CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION(Virus)Evolution进化生物学是研究生命的起源及进化的过程、原因、机制、速率和方向的科学起源（Origin）：从哪里来？进程（Process/Route）：怎么来的？原因（Causes）：为什么会来？机制（Selection）：谁驱动它？速率（Dynamics）：快？慢？方向（Directio
46、n）：要去哪？Evolution of EvolutionaryMethods简单分子数据复杂分子数据简单个体样本复杂群体样本PhylogeneticsIntra-host VariationsCoalescence?2013 H7N9Avian InfluenzaVirus February 26,the first human infection March 31,identification of H7N9 April 11,the first publication on theNew England Journal of Medicine China CDC,et al.细胞沉积成圆
47、点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状红细胞凝集抑制试验稀释血清Hanks液清洗细胞CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的量为9.流感样病例监测标本采集方向（Direction）：要去哪？免疫荧光试验可以区分A和B型流感病毒。发热（体温38），伴咳嗽或咽痛之一者注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。H7N9表面基因相对保守1：The HA and NA genes3335培养72小时每日观察细胞病变(CPE)用70%75酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10 x6mm窗口（1）1周内，在同一
48、学校、幼儿园或其他集体单位发生30例及以上流感样病例；红细胞凝集抑制试验稀释血清核酸提取-QIAamp Viral RNA Mini Kit荧光PCR结果阴性样品24小时后，观察细胞病变。Frequency of glutamic acid was 87.Timeline of the clinical course of the patient and identification of causative pathogen H7N3 virus fromducks of Zhejiang H7N9 virus fromwild birds flyingacross Korea Intern
49、al genes fromH9N2 virusThe Origin of H7N9Origin and Route1：The HA and NA geneswere most probablytransmitted from wild birds todomestic birds and then tohumans2：The six internal genes werefrom at least two distinctH9N2 virus populations ofpoultry3：The intermediate hostswere still unknown,but ducksand
50、 chickens were the mostsuspects4：The H7N9 viruses havepossibly been evolved for atleast one year in poultryLancet,2013Diversity and DynamicsHANAH7N9表面基因相对保守Wave 1Wave 2Wave 3PB2PB1PANPMPNSWave 1Wave 2Wave 3H7N9&H9N2内部基因不断重配根据使用的细胞瓶的大小，决定接种量，一般的小细胞瓶接种0.1：The HA and NA genesparvum 隐孢子虫real-time RT-PCR
