1、第三章第三章 癌症的分子診斷癌症的分子診斷幾乎癌組織都是單株性增殖幾乎癌組織都是單株性增殖(clonal proliferation)患者的所有癌細胞都起源於單一的癌細胞患者的所有癌細胞都起源於單一的癌細胞大多數癌症不能用單基因遺傳方式解釋大多數癌症不能用單基因遺傳方式解釋某些類型的癌症，親屬發生同類腫瘤的風險會增某些類型的癌症，親屬發生同類腫瘤的風險會增加，但不表現孟德爾式遺傳加，但不表現孟德爾式遺傳許多癌症與環境的物理化學因子或生物因子有關許多癌症與環境的物理化學因子或生物因子有關 癌症的分子诊断1癌症的分子诊断2細胞週期的調控細胞週期的調控受細胞週期素受細胞週期素(cycIin)及相對應
2、的細胞週期素依及相對應的細胞週期素依賴激酶賴激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)嚴嚴格調控格調控細胞週期的每階段都有一組細胞週期的每階段都有一組 CDKs與與cyclins 交互作用來調控交互作用來調控CDK的磷酸化及的磷酸化及cyc-lin-CDK抑制劑抑制劑(CKIs)的的活化都會影響細胞週期活化都會影響細胞週期 癌症的分子诊断3癌症相關基因癌症相關基因 癌症的分子诊断4致癌基因致癌基因(oncogene)1911年年Rous發現的雞的腫瘤傳染因子是一種發現的雞的腫瘤傳染因子是一種病毒，為反轉錄病毒病毒，為反轉錄病毒癌化作用是因為病毒基因組內特殊致癌基因癌化作用是
3、因為病毒基因組內特殊致癌基因(v-onc)哺乳類的基因組上，也存在有同源的序列哺乳類的基因組上，也存在有同源的序列(e-onc)調控胚胎的發展、細胞的增殖、分化和凋亡調控胚胎的發展、細胞的增殖、分化和凋亡調調 控失常，會使細胞發展為惡性表型，正常控失常，會使細胞發展為惡性表型，正常細胞中具有這樣潛能的基因稱為原細胞中具有這樣潛能的基因稱為原(致致)癌基癌基因因(proto-oncogene)癌症的分子诊断5原原(致致)癌基因癌基因調控生長分化、信號傳遞、轉錄因子、細胞週期調控生長分化、信號傳遞、轉錄因子、細胞週期 生長因子生長因子病毒來源的病毒來源的sis基因與細胞來源的原癌基因基因與細胞來源
4、的原癌基因-血血小板衍生性生長因子次單位小板衍生性生長因子次單位細胞表面生長因子受體細胞表面生長因子受體表皮生長因子受體基因表皮生長因子受體基因(epidermal growth factor receptor，EGFR)集落刺激因子集落刺激因子1受體受體(CSF1R)基因相當，基因相當，CSF1R是一是一 種促進骨髓中多種細胞分裂的種促進骨髓中多種細胞分裂的生長因子生長因子癌症的分子诊断6細胞內信號傳遞系統細胞內信號傳遞系統(Intracellular signal transduction systems)RAS家族是信號傳遞通路家族是信號傳遞通路G-protein的成的成份，藉由跨膜蛋白
5、與份，藉由跨膜蛋白與G-protein的結合將的結合將信號傳至核內信號傳至核內蛋白質蛋白質-酪胺酸激酶酪胺酸激酶(protein tyrosine kinase)ABL是細胞內信號傳遞蛋白與信是細胞內信號傳遞蛋白與信號傳遞至核內有關號傳遞至核內有關核內轉錄因子核內轉錄因子 MYC是是DNA結合蛋白，而結合蛋白，而JUN是轉錄因是轉錄因子子細胞週期有關的蛋白細胞週期有關的蛋白調控細胞週期相關的激酶和激酶抑制物，調控細胞週期相關的激酶和激酶抑制物，癌症的分子诊断7癌症的分子诊断8病毒性癌基因病毒性癌基因只有少數人類反轉錄病毒引起人類癌症只有少數人類反轉錄病毒引起人類癌症HIV 可以促進細胞增殖和增
6、加體細胞突變的可以促進細胞增殖和增加體細胞突變的機會，或插入基因組促使鄰近基因活化引起機會，或插入基因組促使鄰近基因活化引起免疫缺陷而間接促進腫瘤的產生免疫缺陷而間接促進腫瘤的產生病毒癌基因插入宿主癌化的原因病毒癌基因插入宿主癌化的原因有些的癌基因產物作用如同細胞癌基因產物有些的癌基因產物作用如同細胞癌基因產物有時插入的病毒癌基因是斷裂的，這些斷裂有時插入的病毒癌基因是斷裂的，這些斷裂的序列可能是基因內的調控序的序列可能是基因內的調控序 列列有些病毒癌基因的產物與細胞癌基因產物共有些病毒癌基因的產物與細胞癌基因產物共存，可能調節癌蛋白活化存，可能調節癌蛋白活化 癌症的分子诊断9癌症的分子诊断1
7、0癌症的分子诊断11 腫瘤抑制基因腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene)在遺傳學上，癌基因對細胞的作用是顯性作用在遺傳學上，癌基因對細胞的作用是顯性作用(dominant effect)可抑制可抑制oncogene作用的基因，稱作用的基因，稱tumor suppressor gene 抑癌基因的蛋白產物能抑制抑癌基因的蛋白產物能抑制 細胞不正常生長及細胞不正常生長及抑制細胞癌化抑制細胞癌化遺傳學上一般屬於隱性的遺傳學上一般屬於隱性的(recessive)RB基因基因視網膜母細胞瘤視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)，一，一種侵犯幼兒視網膜的腫瘤種侵犯幼兒視網
8、膜的腫瘤散發性非遺傳的類型最常見，會造成單側眼睛散發性非遺傳的類型最常見，會造成單側眼睛病變病變約約1/3的的RB病人產生多發性腫瘤，且常造成雙眼病人產生多發性腫瘤，且常造成雙眼的病變，及在同胞兄弟姊妹中可發生同樣病變，的病變，及在同胞兄弟姊妹中可發生同樣病變，家族傾向遺傳性家族傾向遺傳性 癌症的分子诊断12RB基因的功能基因的功能 蛋白質產物蛋白質產物pRb是細胞週期的煞車器是細胞週期的煞車器 pRb 蛋白發生週期性的磷酸化反應蛋白發生週期性的磷酸化反應pRb蛋白在蛋白在GI期是細胞週期抑制信號的集期是細胞週期抑制信號的集合點，這個以合點，這個以pRb蛋白為中心的抑制傳導蛋白為中心的抑制傳導
9、途徑，稱為途徑，稱為RB傳導途徑傳導途徑靜止的細胞靜止的細胞(G0IG I)，pRb沒有磷酸化沒有磷酸化Gl期之末，在有絲分裂時它是磷酸化的期之末，在有絲分裂時它是磷酸化的非磷酸化的非磷酸化的pRb在進入在進入S期之前可與幾種期之前可與幾種蛋白質結合調控細胞週期蛋白質結合調控細胞週期癌症的分子诊断13癌症的分子诊断14p53基因基因 抑制腫瘤生長的作用，基因定位在抑制腫瘤生長的作用，基因定位在17p，p53是其分子量是其分子量(53 kD)在人類的大腸癌中有在人類的大腸癌中有70%因失去因失去 p53功能功能50%的肺癌、的肺癌、40%的乳癌也因的乳癌也因p53去活化而去活化而誘發誘發人類癌症
10、約有一半起因於人類癌症約有一半起因於p53突變缺陷或失突變缺陷或失去作用去作用發生突變的蛋白質可能原因發生突變的蛋白質可能原因兩個兩個alleles都發生缺失都發生缺失一個一個allele上發生錯義點突變，上發生錯義點突變，會抑制另會抑制另一個正常野生型基因的功能一個正常野生型基因的功能癌症的分子诊断15正常細胞中，正常細胞中，p53的量都很低的量都很低DNA損傷時，損傷時，p53就大量增加，造成就大量增加，造成生長的停止或細胞凋亡生長的停止或細胞凋亡(apoptosis)p53就激活就激活p21蛋白質關閉細胞週期蛋白質關閉細胞週期p21蛋白質是一個蛋白質是一個CDK 的抑制因子的抑制因子可結
11、合可結合CDK2、CDK4、CDK6，並抑，並抑制它們的活性制它們的活性細胞進細胞進 入入S期以前，得以修護受損傷的期以前，得以修護受損傷的DNA若細胞已將進入若細胞已將進入S期，已不能修護受損傷期，已不能修護受損傷的的DNA，則，則p53起動細胞凋亡起動細胞凋亡這二種功能保持基因組的穩定性，這二種功能保持基因組的穩定性，p53稱為稱為基因組保護者基因組保護者(guardian of genome)癌症的分子诊断16細胞凋亡細胞凋亡(apoptosis，programmed cell death)基因與癌症基因與癌症 細胞凋亡是一種有計畫的控制細胞死亡的方式，細胞凋亡是一種有計畫的控制細胞死亡
12、的方式，Apoptosis此字源自於希臘此字源自於希臘 文，意思是指樹葉文，意思是指樹葉從樹上凋落之意從樹上凋落之意正常生理情況下細胞凋亡是生命過程所必須的，正常生理情況下細胞凋亡是生命過程所必須的，平衡著細胞的數量平衡著細胞的數量生物發育的階段生物發育的階段高等動物在胚胎發育過程中的特定階段，特定高等動物在胚胎發育過程中的特定階段，特定區域的多餘細胞都會發生凋區域的多餘細胞都會發生凋 亡，以利於組織器亡，以利於組織器官形態的形成官形態的形成 癌症的分子诊断17病理情況下的凋亡病理情況下的凋亡人為的方式改變荷爾蒙分泌後，內分泌依賴人為的方式改變荷爾蒙分泌後，內分泌依賴組織的萎縮組織的萎縮組織損
13、傷後血液造成大量自由基所產生的細組織損傷後血液造成大量自由基所產生的細胞凋亡胞凋亡細胞細胞DNA受到物理化學的因子傷害，也會促受到物理化學的因子傷害，也會促使細胞凋亡使細胞凋亡在一些病毒感染的情況下，在病毒還未完全在一些病毒感染的情況下，在病毒還未完全被複製時也會使細胞凋亡，以抑制病毒持續被複製時也會使細胞凋亡，以抑制病毒持續感染感染 癌症的分子诊断18細胞凋亡機制在生物中具有高度保留性細胞凋亡機制在生物中具有高度保留性線蟲已發現至少線蟲已發現至少15個基因與凋亡有關個基因與凋亡有關ced-3和和ced-4促進凋亡促進凋亡ced-9則通過阻止則通過阻止ced-3和和ced-4的活化而保的活化而
14、保 護細胞免於凋亡護細胞免於凋亡哺乳動物同源物哺乳動物同源物ced-3 vs 半胱胺酸蛋白水解酶半胱胺酸蛋白水解酶(cysteine proteases)-caspasesced-9 vs Bcl-2蛋白家族蛋白家族ced-4 vs Apaf-l(HeLa細胞細胞)癌症的分子诊断19caspase蛋白水解酶，能專一性的在天門冬蛋白水解酶，能專一性的在天門冬胺酸位胺酸位 置裂解蛋白質置裂解蛋白質caspase在正常細胞中以未活化的酶原存在在正常細胞中以未活化的酶原存在細胞接受凋亡訊號後，細胞接受凋亡訊號後，caspase 自身催化自身催化或者被其它或者被其它caspase裂解而活化裂解而活化活化
15、的活化的caspases再繼續裂解許多細胞內基再繼續裂解許多細胞內基質質維持細胞骨架的蛋白維持細胞骨架的蛋白actin、Gas2、Lamins負責負責DNA修復的修復的PARP、DNA-PK訊息傳遞蛋白訊息傳遞蛋白PKC-、PITSLRE kinase 至今約有至今約有14種哺乳類動物的種哺乳類動物的caspases被鑑被鑑定出來定出來癌症的分子诊断20依據依據caspases與細胞凋與細胞凋 亡在細胞死亡時所亡在細胞死亡時所扮演之角色，可分為扮演之角色，可分為Initiator(upstream)caspases Effector(downstream)caspases 當受到凋亡刺激時，首
16、先當受到凋亡刺激時，首先initiator caspases(主要為主要為8、9、10)被活化被活化進行進行effector caspases的活化的活化主要為主要為caspases-3、6與與7，其負責細胞，其負責細胞凋亡時受質蛋白的水解凋亡時受質蛋白的水解藉由藉由cytochrome c、Apaf-l及及caspase-9形成的形成的apoptosome複合體複合體活化活化caspase-9驅動驅動caspase放大效應放大效應癌症的分子诊断21細胞凋亡的異常使不正常細胞累積，造成了癌症、細胞凋亡的異常使不正常細胞累積，造成了癌症、發炎症發炎症 及自體免疫性疾病及自體免疫性疾病過度的細胞凋
17、亡在神經退化性疾病、過度的細胞凋亡在神經退化性疾病、AIDS、骨、骨質疏鬆症、心臟病質疏鬆症、心臟病原癌基因原癌基因(proto-oncogene)和腫瘤抑制基因都和腫瘤抑制基因都參與了參與了apoptosis的調控的調控 MYC原癌基因對細胞增殖及凋亡有雙向調控原癌基因對細胞增殖及凋亡有雙向調控 MYC與與MAX形成複合物會啟動細胞的增殖或形成複合物會啟動細胞的增殖或凋亡過程，主要是決定於細胞的微環境凋亡過程，主要是決定於細胞的微環境一些腫瘤抑制基因，如一些腫瘤抑制基因，如:p53、APC及及PTEN藉由藉由誘導凋亡來誘導凋亡來 抑制腫瘤細胞的產生，如果這些抑抑制腫瘤細胞的產生，如果這些抑制
18、功能喪失就可能造成腫瘤的生長制功能喪失就可能造成腫瘤的生長 癌症的分子诊断22癌症的分子诊断23癌症有關的現象癌症有關的現象 染色體不穩定性染色體不穩定性癌化的細胞中常見到三倍體和單倍體癌化的細胞中常見到三倍體和單倍體染色體的缺失，還有染色體大片段的重排染色體的缺失，還有染色體大片段的重排(插插入、入、重複、缺失、倒轉、易位重複、缺失、倒轉、易位)染色體之間或染色體本身的交互作用，可能染色體之間或染色體本身的交互作用，可能也參與了細胞基因表達的調控也參與了細胞基因表達的調控利用利用FISH相關技術偵測染色體不穩定性相關技術偵測染色體不穩定性 多色螢光多色螢光FISH(multifluor-FI
19、SH)DNA結構不穩定結構不穩定 微衛星不穩定微衛星不穩定 異質性丟失異質性丟失 癌症的分子诊断24癌症的分子诊断25癌症的分子诊断26腫瘤的發展過程是多基因多突變多因素累加的腫瘤的發展過程是多基因多突變多因素累加的效果，突變中獲得效果，突變中獲得不必依賴外在的生長訊號不必依賴外在的生長訊號對外在的抗生長訊號不反應對外在的抗生長訊號不反應不會凋亡不會凋亡有能力無限複製有能力無限複製有能力產生支持性的血管有能力產生支持性的血管(血管新生，血管新生，angiogenesis)具有侵入組織及轉移的能力具有侵入組織及轉移的能力 癌症的分子诊断27癌症的分子诊断28微衛星不穩定微衛星不穩定MSI正常組織
20、正常組織STR相比較，出現相比較，出現STR重複次數的增重複次數的增加或減少，得到不一樣的加或減少，得到不一樣的patternMicrosatellite DNA markers廣泛使用在偵測廣泛使用在偵測腫瘤初期基因組不穩定現象腫瘤初期基因組不穩定現象Mao et al.(1996)，使用，使用microsatellite analysis偵測膀胱癌的尿沉澱物，有偵測膀胱癌的尿沉澱物，有95%的檢的檢出率出率DNA片斷異質性丟失片斷異質性丟失(loss of heterozygosity、LOH)來自父系或母系的同來自父系或母系的同-區域的區域的DNA，有多形性的，有多形性的變化變化(如如
21、SNP、STR、VNTR)，但並不改變該，但並不改變該區域基因的功能，稱異質性的變化區域基因的功能，稱異質性的變化癌化過程喪失此多形性的變化稱之，此位置常癌化過程喪失此多形性的變化稱之，此位置常是抑癌基因的所在是抑癌基因的所在 癌症的分子诊断29癌症的分子诊断30DNA甲基化與癌症甲基化與癌症人體大約有一半的基因含有人體大約有一半的基因含有CpG islands尤其是持家基因和組織特異性表現的基因尤其是持家基因和組織特異性表現的基因與正常細胞比較，與正常細胞比較，DNA的甲基化在癌細胞的甲基化在癌細胞上顯示出甲基化型式的異常上顯示出甲基化型式的異常腫瘤抑制基因與癌相關基因腫瘤抑制基因與癌相關基
22、因CpG島高度島高度甲基化，癌基因及重複序列低度甲基化甲基化，癌基因及重複序列低度甲基化 癌症的分子诊断31癌症的分子诊断32癌症的診斷癌症的診斷 雷射捕獲微切割技術雷射捕獲微切割技術(Laser capture microdissection，LCM)在腫瘤組織中通常還混有正常的大量的非腫在腫瘤組織中通常還混有正常的大量的非腫瘤組織瘤組織(基質細胞、基質細胞、血管組織、免疫反應細血管組織、免疫反應細胞胞)這些正常的基因可能模糊了腫瘤異常基因的這些正常的基因可能模糊了腫瘤異常基因的 表現表現對於癌前組織或早期及無惡性變化的腫瘤相對於癌前組織或早期及無惡性變化的腫瘤相關組織基因改變情形所關組織基
23、因改變情形所 知有限知有限LCM技術對於癌前組織的變化及腫瘤發生、技術對於癌前組織的變化及腫瘤發生、發展、演變的過程中提供了樣本的來源發展、演變的過程中提供了樣本的來源 癌症的分子诊断331996年由美國年由美國NIH Liotta實驗室所發展實驗室所發展將切片表面貼一層將切片表面貼一層ethylene-vinyl acetate(EVA)膜膜切片放在倒置顯微鏡載物台切片放在倒置顯微鏡載物台打開雷射光對準目標區，溶掉局部膜，固化打開雷射光對準目標區，溶掉局部膜，固化可分離到單一類型的細胞群可分離到單一類型的細胞群偵測偵測LOH(Loss of heterozygosity)染色體基因不正常代表
24、著整個片段基因的缺染色體基因不正常代表著整個片段基因的缺失或獲得失或獲得這片段可能在腫瘤發生有關的基因區域這片段可能在腫瘤發生有關的基因區域p53、APC基因位置的基因位置的LOH利用毛細管電泳利用毛細管電泳CE偵測偵測癌症的分子诊断34癌症的分子诊断35偵測偵測MSI(microstatellite instability)也可以說是複製差錯也可以說是複製差錯(replication error)，導致寡核苷酸重複序列長度的改變導致寡核苷酸重複序列長度的改變使腫瘤細胞基因組不穩定而降低整體細胞忠使腫瘤細胞基因組不穩定而降低整體細胞忠實複製實複製 DNA的能力的能力MSI與與DNA錯配修復基因
25、息息相關錯配修復基因息息相關DNA修補基因雙套突變，修補基因雙套突變，LOH或或promoter的甲基化，會使基因失去活性的甲基化，會使基因失去活性而沒有修復功能而沒有修復功能)癌症的分子诊断36癌症的分子诊断37蛋白質截短檢測蛋白質截短檢測(protein truncation test，PTT)檢測蛋白質層次上的突變檢測蛋白質層次上的突變造成蛋白質轉譯後縮短蛋白的原因造成蛋白質轉譯後縮短蛋白的原因單個鹼基的插入單個鹼基的插入缺失產生一個缺失產生一個stop codon的無意義突變的無意義突變或移框突變或移框突變(frameshift mutation)剪接位點的插入缺失造成剪接位點的改變剪
26、接位點的插入缺失造成剪接位點的改變應用在沒有突變熱點且錯義突變應用在沒有突變熱點且錯義突變(單鹼基單鹼基突變造成胺基酸改變突變造成胺基酸改變)發生發生很低很低的基因上的基因上 癌症的分子诊断38癌症的分子诊断39癌症的分子诊断40癌症的分子诊断41淋巴瘤的診斷淋巴瘤的診斷每一個淋巴細胞在發育過程中都會每一個淋巴細胞在發育過程中都會 經歷免疫球經歷免疫球蛋白基因蛋白基因Ig或或T細胞受體基因的重排細胞受體基因的重排造成成熟的淋巴細胞各帶有不同的免使球蛋白造成成熟的淋巴細胞各帶有不同的免使球蛋白抗體基因重排多樣化之機制由利根川進解開抗體基因重排多樣化之機制由利根川進解開(1987年諾貝爾醫學獎年諾
27、貝爾醫學獎)V基因的特異基因的特異5端引子及一個端引子及一個J基因片段的特異基因片段的特異性性 3 端引子端引子在非腫瘤中每一個淋巴細胞都在在非腫瘤中每一個淋巴細胞都在V-D和和D-J插入插入了任意數目的鹼基，所以了任意數目的鹼基，所以PCR產物在電泳膠上產物在電泳膠上電泳帶是一片模糊電泳帶是一片模糊(smeared)B細胞細胞 淋巴瘤來自同一株化的淋巴細胞，有相淋巴瘤來自同一株化的淋巴細胞，有相同的同的VDJ基因重排，所以有獨立分開的電泳帶基因重排，所以有獨立分開的電泳帶 癌症的分子诊断42基因晶片在癌症的應用基因晶片在癌症的應用 人類人類p53基因位於第基因位於第17號染色體短臂號染色體短
28、臂13區區1帶帶(17p13.1)上上全長為全長為 20 kb 由由11個個exon和和10個個intron組成，組成，編碼編碼393胺基酸胺基酸90%以上的點突變位點發生在相對保留的第以上的點突變位點發生在相對保留的第58 exon上上突變熱點集中在密碼子突變熱點集中在密碼子273、175、248、245、249、282等位點上等位點上因因p53突變位點複雜，突變位點複雜，Affymetrix公司公司 將將p53基因基因exon 58可能的突變位點全部點在晶片上，可能的突變位點全部點在晶片上，構建一個構建一個p53 GeneChip 癌症的分子诊断43將腫瘤基因的擴增產物利用標誌將腫瘤基因的
29、擴增產物利用標誌(綠色綠色)與晶與晶片雜交片雜交從雜交圖看雜交探針所出現螢光信號，最亮從雜交圖看雜交探針所出現螢光信號，最亮點表示所測出的鹼基點表示所測出的鹼基參照正常野生型這個位點的鹼基，就可知有參照正常野生型這個位點的鹼基，就可知有沒有點的突變沒有點的突變 癌症的分子诊断44微小殘癌的檢測微小殘癌的檢測(minimal residual disease，MRD)當惡性腫瘤經過治療後，有時會有殘留的癌當惡性腫瘤經過治療後，有時會有殘留的癌細胞細胞做細胞做細胞 FISH的分析，或者使用流式細胞術的分析，或者使用流式細胞術來分析來分析利用外周血液及定量利用外周血液及定量PCR的方法來檢測有明的方
30、法來檢測有明確特異性位點的基因突確特異性位點的基因突 變或染色體重排變或染色體重排偵測血中轉移的腺癌，鱗狀上皮癌等非血液偵測血中轉移的腺癌，鱗狀上皮癌等非血液的腫瘤的腫瘤利用癌細胞獨有而血液細胞無的基因做為利用癌細胞獨有而血液細胞無的基因做為標的，再利用標的，再利用real-time RT-PCR或或nested RT-PCR等技術來偵測血中是否等技術來偵測血中是否含有這些癌細胞含有這些癌細胞 癌症的分子诊断45起動子甲基化的檢測起動子甲基化的檢測致癌基因起動子的低甲基化致癌基因起動子的低甲基化抑癌基因起動子的過度甲基化抑癌基因起動子的過度甲基化利用甲基化利用甲基化 PCR，甲基化定序等方法來檢，甲基化定序等方法來檢測起動子的甲基化測起動子的甲基化癌症的形成，也會造成基因剪接的異常，癌症的形成，也會造成基因剪接的異常，non-coding RNA(如如micro RNA)的變化的變化利用利用RT-PCR、real-time qRFPCR，micro RNA array，exon array等來探討這些變化等來探討這些變化 癌症的分子诊断46
