1、微生物与基因工程微生物与基因工程Recombinant DNA technology has been used to create genetically Recombinant DNA technology has been used to create genetically modified crops.modified crops.Genetically engineered corn,which produces a toxin that kills insect pests,now comprises over 30%of all corn grown in the United
2、 States.)Restriction enzyme Mocular cloning DNA sequencingGenetics engineering基本过程基本过程分离或者合成基因分离或者合成基因体外重组体外重组导入细胞导入细胞扩增扩增筛选筛选鉴定或测序鉴定或测序控制外源基因表达控制外源基因表达得到基因产物得到基因产物基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤基因分离基因分离酶切酶切载体载体酶切酶切连接连接转化转化筛选筛选表达表达基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤(示意图示意图)微生物学与基因工程微生物学与基因工程载体载体工具酶工具酶宿主宿主基因来源基因来源理论理论基因工程中常用的工具酶基
3、因工程中常用的工具酶工具酶的种类工具酶的种类核酸降解酶类核酸降解酶类(核酸内切酶核酸内切酶,核酸外切酶核酸外切酶)核酸合成酶类核酸合成酶类(聚合酶聚合酶,连接酶连接酶)核酸修饰酶类核酸修饰酶类(甲基化酶甲基化酶,基因转移酶基因转移酶,激酶等激酶等)限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名EcoREcoR I I Escherichia coli Ry13属名属名 种名种名 株系株系 编号编号Hind Hind IIIIIIHaemophilus influenzae d strain?限制性内切酶的分类限制性内切酶的分类类型类型I IIIIIIIIIII识别与切识别与切割部位割部位分别分别,随意切
4、割随意切割,相距远相距远,单链切割单链切割相同相同相距相距5-10bp对基因工程对基因工程的意思的意思不大不大大大不大不大IIII类限制性内切酶的不同切割方式类限制性内切酶的不同切割方式A.平末端切割平末端切割5CCCGGG 33GGGCCC 55CCC GGG33GGG CCC5SmaIB.粘性末端切割粘性末端切割5凸出凸出5GAATTC 33CTTAAG 55G AATTC33CTTAA G5EcoRIC.粘性末端切割粘性末端切割3凸出凸出5CTGCAG 33GACGTC 55CTACA G33G ATGTC5PstI限制性内切酶的活性单位限制性内切酶的活性单位 指在指在50l体系中体系中
5、,于于最适宜的条件下最适宜的条件下(温度温度,离子浓度等离子浓度等),一小时内完全一小时内完全酶解酶解1g特定底物特定底物DNA所需要的酶蛋白量所需要的酶蛋白量限制性内切酶在基因工程中的应用限制性内切酶在基因工程中的应用产生特异切割产生特异切割DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）指在DNA或者RNA模板指导下，以4种dNTP为底物，在引物3OH末端聚合DNA链的一类酶。特点：需要模板，引物，特点：需要模板，引物，5 3，具有，具有3 5和和5 3外切作用外切作用 DNA聚合酶聚合酶I（E.coli）Klenow片段（片段（E.coli）T4 DNA聚合酶（聚合酶（T4感染的感染
6、的E.coli）T7 DNA聚合酶（聚合酶（T7感染的感染的E.coli）修饰的修饰的T7DNA聚合酶（测序）聚合酶（测序）Taq DNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶载体（载体（vector）克隆载体（cloning vector）表达载体（expression vector）克隆载体克隆载体以扩增外源以扩增外源DNA为目的的载体。为目的的载体。要求？能够独立自主的复制能够独立自主的复制具有若干个限制酶单一的切割位点具有若干个限制酶单一的切割位点具有筛选标记具有筛选标记克隆载体的要求克隆载体的要求表达载体表达载体具有宿主细胞基因表达所需要的调控序列，能使克隆的基因在宿主体内转录和翻译的载体。克
7、隆载体克隆载体质粒具有独立复制起点具有独立复制起点较小的分子质量较小的分子质量具有较高的拷贝数具有较高的拷贝数具有筛选标记具有筛选标记容易导入细胞容易导入细胞安全安全插入片段（插入片段（15kb)pBR322插入失活insertional inactivation克隆载体宿主克隆载体宿主基本要求基本要求高效吸收外源DNA高效复制外源DNA的酶系统不具有限制-修饰系统重组缺陷型菌株便于基因操作和筛选具有安全性原核生物宿主原核生物宿主E.coliB.subtilis真核生物宿主真核生物宿主S.cereviaiae哺乳动物细胞昆虫细胞系基因文库基因文库基因组文库（基因组文库（genomic libr
8、arycDNA文库（文库（cDNA library）genomic library A library encompassing an entire genomecDNA library A library composed of cDNAs,not necessarily representing all mRNAs.The differences between cDNA clones and genomic DNA clones 基因组文库的构建基因组文库的构建一般步骤一般步骤基因组DNA的分离部分酶解分离特定大小的片段切割载体连接转化/转染鉴定容量cDNA文库的构建文库的构建一般步骤m
9、RNA提取反转录（oligo dT）cDNA一链RNAase HDNAase IcDNA二链载体连接转化Preparation of a bacteriophage l l cDNA library基因工程步骤基因工程步骤目的基因的获得特异切割（基因，载体）连接外源基因导入宿主细胞重组体筛选目的基因的获得目的基因的获得A.正向遗传学（正向遗传学（forward genetics）策略策略表型改变突变体表型改变突变体分离相关基因分离相关基因野生型突变体突变位点鉴定突变位点序列筛选文库克隆，亚克隆全序列基因功能确定B.反向遗传学（反向遗传学（reverse genetics）策略策略基因序列确定功
10、能基于同源性的反向遗传学异源探针保守序列异源探针保守序列基于蛋白质的反向遗传学蛋白质部分测序推测DNA序列合成DNA筛选文库克隆，亚克隆蛋白质制备抗体原位杂交克隆，亚克隆An efficient technique commonly used to detect a bacterial colony carrying a particular DNA clone The use of overlapping DNA clones to find a new gene by chromosome walking 特异切割（基因，载体）特异切割（基因，载体）连接（基因与载体）连接（基因与载体）外源
11、基因导入宿主细胞外源基因导入宿主细胞原核宿主原核宿主转化（质粒）转染（噬菌体，cos质粒）真核宿主真核宿主转化（PEG，CaCl2）fungi微量注射，电穿孔：animal cellTi 质粒介导 plant 重组体筛选重组体筛选表型特征鉴定抗生素筛选插入失活插入表达-半乳糖苷酶显色反应重组DNA分子结构特征的鉴定菌落原位杂交酶切鉴定PCR序列测定外源基因表达产物的鉴定免疫活性（抗原-抗体反应）活性检查（酶活测定）氨基酸序列平板滤膜裂解固定（蛋白质）标记抗体检测表达载体构建表达载体构建表达载体：具有宿主细胞基因表达所需要的调节控制序列，表达载体：具有宿主细胞基因表达所需要的调节控制序列，能使克
12、隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。表达系统的要求与主要调控元件表达系统的要求与主要调控元件真核细胞基因在原核细胞中表达时的困难真核细胞基因在原核细胞中表达时的困难：真核生物启动子不能被原核生物细胞RNA聚合酶识别真核mRNA没有SD序列，不能结合原核核糖体原核细胞缺乏将其转录产物进行加工的酶真核生物基因表达产物容易被原核细胞蛋白酶降解用用cDNA原核启动子，终止子，原核启动子，终止子，SD序列序列产生产生mRNA必须稳定必须稳定防止外源蛋白降解防止外源蛋白降解真核基因的原核表达策略真核基因的原核表达策略表达载体的构建表达载体的构建启动子 lac
13、promoter，trp promoter，tac promoter PL、R promoter，T7 promoter核糖体结合位点（ribosome-binding site，RBS）ShineDalgarno sequence，SD终止子偏爱密码子非融合蛋白的表达非融合蛋白的表达表达载体表达载体PSDCoding regionT表达载体表达载体防止非融合蛋白降解的措施防止非融合蛋白降解的措施采用细胞内蛋白酶含量低的突变株作为宿主菌利用蛋白酶抑制剂分泌蛋白包涵体外源蛋白的分泌表达外源蛋白的分泌表达signal融合蛋白的表达融合蛋白的表达表达载体PSDNTCT裂解融合蛋白的表达融合蛋白的表达
14、表达高效表达高效 稳定稳定 直接利用直接利用特点特点分离：酶法，化学法基因工程的应用及展望基因工程的应用及展望基因工程在商业上的主要应用领域基因工程在商业上的主要应用领域微生物发酵病毒疫苗哺乳动物蛋白转基因动植物环境生物技术基因调控和基因治疗基因工程药物基因工程药物生物体内含量少，作用大的蛋白质自然界中不存在的蛋白质重组胰岛素重组胰岛素胰岛素的生产是基因工程最早也是最大的商业成功之一用于糖尿病的治疗初期胰岛素的生产：从牛或猪胰脏中分离（高成本，高价格，低活性）人类胰岛素基因的分离成功后，开始应用基因工程方法生产胰岛素重组胰岛素1982年进入市场ssssAB生产方法 生产胰岛素原，化学切割 分别
15、用两株克隆菌生产A链和B链，用化学方法连接重组疫苗重组疫苗疫苗：由灭活或经过加工的致病微生物或者从微生物上分离的某些成分制成的悬浮液，其注射倒动物体类，会引起动物对相应疫病产生免疫力。通常起作用的成分为表面蛋白。第一个用于人体的重组亚单位疫苗是由酵母菌生产的（乙肝表面抗原疫苗，HBsAg）1986年，FDA正式批准基因工程疫苗进入市场美国科学家在体外将20多种病毒，细菌和寄生虫的基因重组后插入到卡介苗中，形成多效卡介苗，多多种疾病有作用DNA疫苗的设想植物基因工程植物基因工程转基因棉花，烟草，大豆等方法：电穿孔，基因枪，Ti质粒介导转基因动物转基因动物方法，显微注射应用：增强动物抗病能力，生产蛋白质（乳腺反应器）基因治疗基因治疗向靶细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。用正常的基因弥补有缺陷的基因，用来治疗遗传性疾病通过转移基因来刺激免疫力，用于肿瘤和爱滋病的治疗转移的药物配合细胞或药物治疗，以增强特异性或增强疗效基因治疗的类型
