1、第九章 动物实验质量控制v第一节 动物实验质量控制的意义动物实验质量控制的意义动物实验是对演出型的一种影响处置。动物对实验处理的反应可用如下公式表示：R=（A+B+C）D+E。其中R表示实验动物的总反应，A表示动物种的共同反应，B表示品种及品系特有的反应，C表示动物的个体反应（个体差异）,D表示环境影响，E表示实验误差。由公式可以看出：A、B、C是由实验动物本身的遗传因素所决定的，而D是环境因素（包括实验处理），与动物的总反应呈正相关，故必须尽量减少D的变化，排除实验处理以外的影响，得到一个比较理想的实验结果R。v动物实验是对演出型的一种影响处置。为了求得动物对处理结果的可信性和可重复性，就要
2、求演出型的稳定，积极控制影响动物机体的遗传因素和环境条件。因此，对动物实验实行质量控制具有特别重要的意义。一、动物实验设计中的质量控制1.规划动物实验必须掌握学科专业知识,熟悉疾病的发病机理、临床体征、治疗用药、疾病转归以及有关检查指标等.2.规划动物实验还要较好地掌握实验动物学的知识，做好实验对象、处理因素和实验效应三个基本要素的设计。因此,成功的动物实验则是将医药学和实验动物学等学科知识有机结合，并使设计合理的课题得到正确实施的结果。v在实验对象上，应正确选择实验动物，重点在遗传因素的控制；在处理因素方面，除了施加的实验因素和统计处理外，还包括实验环境、微生物和营养等实验条件的质量控制；实
3、验效应即预期实验结果。例如研究某种终止早孕药物的作用，实验对象选择早孕大鼠，处理因素则为该药物并进行实验条件质量控制，而实验效应则为早孕终止。二、实验动物标准化v 实验动物的标准化是由实验动物生产条件的标准化、动物质量的标准化以及动物实验（应用）条件的标准化三部分组成。v只有动物实验条件与生产条件相适应，才能保证标准化实验动物在整个使用过程中保持其标准化的价值，才不会发生高等级动物进入低等级实验环境中导致动物降级或降质的现象v因而，实验动物的标准化对动物实验研究结果的敏感性、准确性及可重复性具有重要影响。v实验动物标准化与遗传、微生物和寄生虫、环境、营养等影响动物生长发育的因素关系密切，在实验
4、动物繁育与使用过程中必须对这些因素进行严格控制，以保证实验动物和动物实验的质量。三、药品安全性研究规范和标准操作规程v药品的毒性检测和安全性评价是新药研究开发所必须进行的基本程序。v药品的安全性评价安排在临床研究前进行，主要采用实验动物作预测。由于影响结果的因素比较复杂，因而要保证实验数据和结果的可靠性、可重复性和科学性，就必须对实验动物选择、模型建立、试验设计与实施、检测技术、供试品与对照品的选择与保存、实验工作与数据记录、结果与结论的评价方法等作严格规范，对试验的全过程进行严格监督。对设施与仪器、人员配备与培训亦须严格要求。v因此进行药品非临床安全评价研究规范（good boratory
5、practice,GLP）体系建设非常必要，是提高新药研制水平、规范国际药品市场所必需。vGLP是药物非临床安全性研究的指导原则，是解决“做什么”的问题，而与之对应的标准操作规程（standard operating procedure,SOP）则是解决“怎么做”的问题，是保障GLP得以实现的具体方法和步骤。GLP管理规范已成为世界药品安全性评价的通行标准。第二节 动物实验设计与分组动物实验设计与分组一、医学科研工作基本程序v 医学科学研究就方法来说是提出假说、验证假说的过程，其工作程序是紧紧围绕这条主线进行的。医学科研工作基本程序如下1.提出假说、确定题目，是战略性决定。初始意念或提出问题文
6、献检索，调查访问假说形成，提出设想陈述问题，开题讨论2.安排实验，验证假说，是战术组织。实验设计实验观察数据资料积累3.总结工作，完成论文，是拿出战果。数据资料处理统计分析提出结论。二、动物实验设计应遵循的原则1.对照性原则：对照性原则是要求在实验中设立可与实验组比较，用于消除各种无关因素影响的对照组。对照应有可比性,即在“同时同地同条件”下进行.设立对照的正确方法是把研究对象随机分配给对照组和实验组.对照设立有两种方式,即自体对照和组间对照.自体对照是指在同一个体身上观察实验处理前后某种指标的变化,即把实验处理前的观察指标,作为实验处理后同一指标变化的对照.也可以把两种实验处理在同一个体身上
7、进行一前一后地交叉比较.自体对照可有效减少个体差异对试验处理反应的影响.v组间对照是指将若干动物以随机抽样的方法,将其分成若干平行组,随机挑选一组作为实验组,另一组作为对照组,进行比较.不作任何实验处理或给生理盐水进行比较的对照组称“空白对照”或“阴性对照”；施行正常值、标准值处理进行比较的对照组称”标准对照”或”阳性对照”.对照各组均应在同一条件下,否则失去对照意义.组间对照适用于需要多次进行实验观察的实验,有利于随时观察实验条件变化,判断试验反应强弱及显著性等.实验组与对照组例数相等时,统计效率最高.v2.一致性原则:一致性原则是在实验中实验组与对照组除了处理因素不同外,非处理因素基本保证
8、均衡一致.均衡一致是处理因素具有可比性的基础.为获得可靠的实验结果,最重要的是实验过程中保证实验组与对照组之间除被研究的实验处理因素有所不同之外,实验对象、实验条件、实验环境、实验时间、药品、仪器、设备、操作人员等等,均应力求一致.v3.重复性原则:重复性原则是指同一处理要设置多个样本例数.重复的主要作用是估计试验误差、降低试验误差和增强代表性,提高实验结果的精确度,同时为体现结果的真实性,保证实验结果能在同一个体或不同个体中稳定地重复出来,也需要足够的样本数.可按一般估测方法确定,也可通过统计学方法进行测算确定.兹介绍如下:v3.1.一般估测的样本数 v小动物(大鼠、小鼠、蛙、鱼)每组10-
9、30例,计量资料每组不少于10例,计数资料每组不少于30例；中等动物(豚鼠、家兔)每组8-20例,计量资料每组不少于8例,计数资料每组不少于20例；大动物(犬、猫、猪、羊等)每组6-20例,计量资料每组不少于6例,计数资料每组不少于20例.3.2按统计学方法测算的样本数 现介绍一种动物实验的样本含量计算公式：vn=22(t+t)2/2v式中，n为样本含量，为标准差；t取有显著性的t分布值，t0.05=1.96；t为无显著性的t分布值，1-为实验检验能力，动物实验一般取1-=0.80，t0.20=0.842；为处理组与对照组均值间的差异，可从预实验或文献资料库中获得。由上述参数可计算出正式实验所
10、需样本含量。举例如下：v 给某种动物饲喂一种新型饲料，预实验中每月体重增长比原饲料增加3015克（均值标准差）。设显著水平为95%，检验能力为80%，则正式实验所需样本含量n为：v n=2152（1.96+0.842）2/302=3.93v即每组只需4只动物。v由以上公式及有关计算可知，优化了实验操作，使获得的数据波动即标准差越小，实验结果的一致性越好，要求的样本含量就越少；处理组与对照组实验结果间的差异即越大，所需样本含量亦越少。从而有利于减少动物用量。样本含量多少尚与统计显著性相关，若提高显著性水平和检验能力的要求，则所需动物数量就得增多。4.随机性原则:随机性原则就是按照机遇均等的原则来
11、进行分组.其目的是使一切干扰因素造成的实验误差尽量减少,而不受实验者主观因素或其它偏性误差的影响.随机化的手段可采用编号卡片抽签法、随机数字表或采用计算器的随机数值键等.5.客观性原则:动物实验设计中力戒主观偏性干扰,选择观察指标时,不用或尽量少用带主观成分的指标.结果判断要客观,更不能以主观的意愿对结果或数据作任意的改动和取舍.三、动物实验设计的基本类型1.单组比较设计 单组比较设计是指在同一个体上观察实验处理前后某种观测指标的变化。此法的优点是能排除个体间生物差异，但不适用于在同一个体上多次进行实验和观察的情况。还应注意有时生理盐水等阴性对照下前后两次测量时一些指标也出现一定差异（如体重、
12、血压等）。2.配对比较设计 配对比较设计是指实验前将动物按性别、体重或其它有关因素加以配对，以基本相同的两个动物为一对，配成若干对，然后将一对动物随机分配到两组中。两组动物的数量、体重、性别等情况基本相同，取得均衡进行实验，以减少误差及动物间的个体差异。3.完全随机化设计 将动物随机分配到处理组及对照组做实验观察。先将动物按顺序编号，再用随机化工具，如查随机数字表，将动物分组。统计分析比较简单，抗数据缺失能力较强。其缺点是对非实验因素缺乏有效控制，只能依靠随机化方法来平衡有关因素的影响。故精确度较低，误差往往偏高。该方法适用于实验对象同质性较好的实验设计。4.随机区组设计v在动物实验时，可将一
13、窝小鼠或大鼠划为一个区组，确定数个区组后，按区组随机化原则将各区组的动物随机分配到处理组和对照组。注意每个区组的动物数量须与处理组要求的动物数量相等。若一窝仔数少于处理组数则不可采用，不能用别窝动物补充；反之，应将多余的动物舍弃，不得放于其他区组。v由于同窝动物在遗传、营养、微生物携带上的一致性都较高，而各区组内每只动物接受何种处理是随机的，因而随机区组设计的均衡性好，可减少误差，提高实验效率，统计分析也较简易。其缺点是抗数据缺失能力较低。若一个区组的某个动物发生意外，那么整个区组都得放弃，或不得已采取缺项估计。v拉丁方设计是指由拉丁字母所组成的正方形排列，在同一横行与同一纵列中都没有重复的字
14、母，可进行不同横行或不同纵列之间对调，任意选择下面一种正方形排列方式。该设计适用于多因素的均衡随机，如比较某药与阳性、阴性对照组的作用，要求用4种药物编成A、B、C、D 4个号码，再按4*4拉丁方进行，每个动物（纵列）没有重复使用的药物，同一日期（横行）也没有重复使用的药物，这样既能控制动物间的个体差异，也可避免了注射日期先后带来的实验误差,若样本是5、6个,则可采用5*5或6*6拉丁方等.1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 41 A B C D 1 C D A B 1 C B A D2 B C D A 2 B C D A 2 B A D C3 C D A B 3 A B C D 3
15、A D C B4 D A B C 4 D A B C 4 D C B A 1,3两行对调 2,4两列对调5.拉丁方设计6.正交设计v正交设计是研究多因素试验的一种设计方法。其特点是利用一套规格化的表格正交表来安排试验,适用于多因素、多水平、试验误差大、周期长等一类试验的设计。v在实验设计过程中只要根据试验条件直接套用正交表即可,而不需要另行编制。正交表在统计学书上都可查到,仅以L9(34)为例,说明其意义及使用方法.L代表正交表,右下角9字表示这张表需安排9次试验，括号内3表示这张表适用于三水平的试验,3的右上方指数4表示最多可以安排4个因素的试验，L9(34)的意思是,用这张表进行试验设计,
16、最多可以安排4个因素,每个因素取三个水平,一共进行9次试验。v常用的正交表中,适用于二水平试验的有L4(23)、L8(27)；适用于三水平试验的有L9(34)、L27(313)等,还有适用于四水平、五水平及水平数不等的各种正交表。选择哪一种正交表要根据试验的具体条件来决定。四、动物随机分组方法v动物随机分组的方法很多,如抽签、拈阄等形式,但最好的方法是使用随机数字表或计算器。随机数字表上所有数字是按随机抽样原理编制的,表中任何一个数字出现在任何一个地方都是完全随机的。计算器内随机数字键所显示的随机数也是根据同样原理贮入的。v随机数字表使用简单。假设从某群体中要抽10个个体作为样本,那么,可以先
17、闭目用铅笔在随机数字表上定一点。假定落在第10行8列的数字22上,那么可以向右(向左,向下,向上均可),依次找37、48、65、90、69、13、85、84、98,把包括22在内的这10个号的个体按号作为样本,来作为研究总体的依据。v使用计算器产生随机数时,每当按下2ndF(第二功能键)和RND（随机数字键)时,随机数就产生。产生的随机数值是0.000至0.999。显示的数前两个小数位用作一个样本个体,如输入2ndF RND显示为0.166,表明第十六个数据作为一个样本个体,重复按键操作,直到产生所需的样本大小。由于随机数是随机产生的,所以,绝对不会产生相同的数目。随机数产生后,随机分组要根据
18、组数来进行,具体较为复杂。以下示例介绍使用随机数字表进行随机分组的方法.1.当分为二组时v 例:设有雄性Wistar大鼠12只,按体重大小依次编为1、2、3、12号,试用完全随机的方法,分为甲、乙两组。v 分组方法:假设所产生的点是随机数字表上第21行第6列的20,则从20开始,由上向下抄12个随机数字,如下:动物编号:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12随机数字:20 21 72 29 52 01 61 72 57 16 43 37组 别:乙 甲 乙 甲 乙 甲 甲 乙 甲 乙 甲 甲现在以随机数字的奇数代表甲组,偶数代表乙组,则编号为2、4、6、7、9、11、12号分入甲组
19、,而1、3、5、8、10号分入乙组。因两组数字不等,继续用随机方法将甲组多余的一只调整给乙组,从上面最后一随机数字37,接下去抄一个数为95以7除之(因甲组原分配7只)余数得4，即把原分配在甲组的第4个甲(即7号大鼠)调入乙组。如果甲组多两个,则接下去抄两个数，分别以8、7除之,余数即指要调入乙组的第几个甲,余此类推。最后各组的鼠数就相等了,调整后各组鼠的编号为:组别 鼠的编号 甲组 2 4 6 9 11 12 乙组 1 3 5 7 8 102.当分为三组时v 例:设有雄性的SD大鼠12只,按体重大小依次编号为1、2、3、12号,试用完全随机的方法,分为A、B、C三组。v 分组方法:假设所定的
20、点是随机数字表第30行10列的91,则从91开始,自左向右抄12个随机数字，如下:v 动物编号:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12v 随机数字:91 80 27 63 28 18 62 95 37 88 31 54v 除3余数:1 2 0 0 1 0 2 2 1 1 1 0v组 别:A B C C A C B B A A A C v调整组别:Bv以3去除各随机数字,若余数为1,即该鼠归A组；余数为2,归入B组；余数为0,归入C组。结果A组为5只,B组3只,C组4只。vA组多一只应调入B组,方法同上。仍采用随机方法,从54后面接着抄,为39，除以5,余数为4,则将第4个A,即第
21、10号鼠调入B组,调整后各组鼠的编号如下:组别:鼠的编号v A组:1 5 9 11v B组:2 7 8 10v C组:3 4 6 12v 对于将动物随机分为四组或更多组，原理基本一致。3.当每个动物一组时例:设有A、B、C、D、E、F代表的6只家兔,试用完全随机法将其每只分为一组。分组方法:从随机数字表上用铅笔任指一点,若为第11行第8列的32,则从32向左抄用6个数字,然后分别以6、5、4、3、2、1除之。凡除不尽的,即将余数写下；除尽的,写余数时即将其除数写下。如下:随机数 32 59 55 48 51 81 除 数:6 5 4 3 2 1 余 数:2 4 3 3 1 1随机排列:B E
22、D F A C 上列第一个随机数字余数为2,意即将六个字母中列在第二位的字母B写在该数下,第二个数字的余数为4,即在剩下的五个字母列在第四位的E写在该数字下面,余此类推。六个字母相应号代表的兔随机排列结果见上表最后一行。第三节第三节 影响动物实验效果的影响动物实验效果的 动物个体因素与遗传因素动物个体因素与遗传因素v药物毒性研究表明，如以人体反应为衡量标准比较动物实验结果与临床试验结果，可出现真阳性、真阴性、假阳性、假阴性四种情况。前两者表示动物实验结果与人体试验结果基本一致，即动物毒性试验有实用价值。但这种相似属定性的，在定量上则肯定存在差异。后两者显示药物反应的种属差异，即实验动物出现的毒
23、性反应在人体不出现（假阳性），或实验动物未出现的毒性反应却在人体出现（假阴性）。其中假阴性的危害最大，要特别注意。如沙利度胺（反应停）在大鼠不引起畸胎，对人则有较强的致畸胎作用，其动物毒性试验为假阴性。v实验动物种属、品系及个体差异对动物实验结果的重复性和均一性有重要影响。一、种属一、种属v实验动物种属是影响动物实验结果的重要因素。比较毒理学研究表明，不同种属的实验动物在代谢转化、DNA损伤的诱导与修复等方面存在差异，这种差异与其进化程度相一致。由于不同种属的实验动物间解剖、生理、遗传和代谢过程均有差别，故对药物的毒性反应可有量或质的不同。1、易感性：不同种属LA对同一实验因素的易感性不同。如
24、在研究醋酸棉酚对雄性动物生殖功能的影响时，发现小鼠很不敏感，大鼠和地鼠则很敏感。2药物代谢动力学 在不同种属动物身上做的实验结果有较大差异，主要由于其药物代谢动力学不同，药效就不同。吸收过程差异：如大鼠吸收碘较家兔和豚鼠快，药效也有差别。排泄过程差异：如大鼠体内的巴比妥在3天内可排出90%以上，而鸡在7天内仅排出33%，因而巴比妥对鸡的毒性比对大鼠要大得多。3.药物反应性 不同种属动物对药物的反应也有差异。如啮齿类实验动物和家兔对催吐药不产生呕吐反应，在犬、猫和人则易产生呕吐。苯胺及其衍生物对犬、猫和豚鼠能引起与人相似的病理变化，产生变性血红蛋白；对家兔则不易产生变性血红蛋白，而小鼠则完全不产
25、生。4生理学差异 不同种属动物的基础代谢率相差很大，以单位体重的基础代谢率而言，小动物比大动物要高。因此，一般地说，动物越小，其所需的单位体重的药物剂量就越大。5遗传差异 有学者认为：动物实验中的差异25%归于遗传差异，75%则归于环境影响。如Gunn鼠先天缺乏胆红素葡萄糖醛酸转移酶，易发生黄疸；D绵羊的红细胞缺少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD），易发生溶血。二、品种与品系二、品种与品系v不同品系、品种之间存在基因多态性，具有不同等位基因或不同基因型。其对动物实验所给予的外来刺激所表达的反应是不同的，使用不当也会影响动物实验的结果。v近交系实验动物由于其基因型、表现型相同，故对刺激的反应
26、性一致，实验结果的重复性、可比性极好；封闭群动物由于遗传组成具有很高的杂合性，个体间反应性具有差异，故个体间重复性和一致性没有近交系动物好。v不同品系实验动物遗传上的差异，造成其形态与功能的差异，并导致对同一刺激产生不同的反应。有人观察不同品系雄性小鼠暴露于相同浓度氯仿中,DBA/2品系死亡率为75%,DBA/1为51%,C3H为32%,BALB/c为10%.不同品系实验动物对微生物感染的抵抗力也不同.如小鼠对细菌感染的抵抗力就存在品系差异.同种动物不同器官也存在反应差异.。三、年龄与体重v实验动物的解剖生理特征和机体反应性随年龄而有明显变化,往往幼年动物较成年敏感。敏感性从大到小顺序为幼年老
27、年成年。v对毒物反应的年龄差异可能与解毒酶活性有关。就人类而言，胎儿因缺乏这些解毒酶，故对毒物很敏感；新生儿出生后8周解毒酶才达到成人水平。实验动物也一样，大鼠葡萄糖醛酸转换酶约在出生后30天才达到成年大鼠水平。兔出生4周后，肝脏解毒酶活性才与成年兔接近。v实验动物一生对药物的毒性反应水平，是随年龄变化的动态过程。v如八甲磷在体内须经羟化才具有毒性，以35mg/kg剂量给初生大鼠灌胃不引起死亡，但相同剂量给成年大鼠灌胃则全部死亡。老年实验动物对毒物的耐受性提高，可能是排泄及生物转化能力降低的缘故。v实验动物体重与年龄一般呈正比关系，因而同批实验的动物年龄应尽可能一致，体重应大致相近，一般相差不
28、超过10%。四、性别v一般而言，雌性实验动物对药物的敏感性高于雄性，但随受试物不同而异。v一般认为，动物对激素的依存性，是其药物毒性反应性别差异的主要原因。研究表明雄性激素能促进细胞色素P450的活力，药物在雄性实验动物体内易于代谢，因此雌性大鼠对药物较雄性敏感。因此，在药品安全性评价研究中，通常选择实验动物应雌雄各半。若发现有明显的性别差异时则应分别测定不同性别实验动物的LD50值。五、生理及功能状态v实验动物在处于特殊的生理状态如怀孕、哺乳时，其体重及某些生理生化指标将有所不同。因此，一般实验研究不宜采用怀孕、哺乳的实验动物。但为了阐明药物对妊娠及产前胎儿的影响时，就必须选用这类实验动物。
29、妊娠和哺乳期大鼠和小鼠最适合进行这类实验。v实验动物由于所处的功能状态不同，对药物的反应也常常受到影响。如动物在体温升高的情况下对解热药比较敏感，而体温不高时则不敏感；血压高时对降压药比较敏感，而在血压低时对降压药敏感性就差，反而可能对升压药比较敏感。六、健康状况v一般来说，有病动物对药物的耐受性比健康动物要小，故有病动物比较容易中毒死亡。患病或营养不良的家兔不易复制成动脉粥样硬化模型，维生素C缺乏的豚鼠对麻醉药很敏感。v动物潜在性感染对实验结果的影响也很大，如观察肝功能在实验前后变化时，必须要排除实验用的家兔是否患有球虫病，不然家兔的肝脏上已有很多球虫囊，肝功能必然发生变化，所测结果波动很大
30、。v因此，动物实验一定要选用健康动物，最好选择SPF级实验动物，不宜采用不健康或患病的实验动物，否则就会影响实验结果。为确保实验动物健康，要做好实验前检疫。实验前通常要观察7-14天，发现不健康动物应予以剔除。第四节第四节 影响动物实验效果的生物因素影响动物实验效果的生物因素v生物因素涉及同种动物因素和异种生物因素等。同种动物因素包括社会地位、势力范围和饲养密度等，异种生物因素主要是指微生物与寄生虫及人等因素。一、同种动物因素v实验动物存在为社会地位和势力范围的相互争斗。动物的争斗和社会地位可影响内分泌系统的功能。v实验动物要有一定的活动面积和空间。密度大使动物活动受到限制，同时由于排泄物大量
31、增加，使温度、湿度、有害气体的浓度增加，动物患传染病的机会增大，内分泌和代谢也随之发生改变，从而影响实验结果。因此实验动物饲养要有合理的密度。二、异种生物因素v异种动物之间可产生相互影响。如将小鼠和猫同室饲养，小鼠就会出现性周期不规则的现象；因此，不同种、品系的动物要分室饲养。v实验动物是由人饲养管理和进行实验的，饲养管理和科研人员的素质直接影响动物实验结果。当动物遭受到虐待、创伤、粗暴对待等意外刺激时，其内分泌系统、循环系统、机体代谢都与正常时不同。应养成日常善待动物，并熟练掌握捉拿、固定、注射、给药、手术等技能，减少对动物的不良刺激。同时要合理设计实验，按照实验室操作规范（GLP）和标准操
32、作程序（SOP）严格执行，才能得到好的实验结果。v病原微生物对实验动物和动物实验的影响显而易见。有的可引起动物发病，表现临床症状和病理改变，甚至发生死亡，使实验中断；有的在动物体内呈隐性感染，常不引起死亡，但可影响动物自身的稳定性和反应性，使实验结果受到干扰，甚至导致错误的结论；有的属人兽共患病原，可同时引起人和动物发病。1病毒感染对动物实验的影响（1）鼠痘病毒：鼠痘病毒是危害实验小鼠最为严重的病毒之一。感染鼠痘病毒的急性病例是小鼠突然死亡，使实验中断；而慢性病例则出现全身症状，使实验结果混乱；隐性感染病例则无临床症状，许多因素如实验性结核、X射线、各种化学毒素、组织移植、肿瘤和运输等都能激活
33、鼠痘病毒而使鼠痘流行，从而干扰实验结果。（2）仙台病毒：仙台病毒是大、小鼠群中常见潜在性感染的病毒之一，其感染可严重影响体液和细胞介导的免疫应答，抑制大鼠淋巴细胞对绵羊红细胞的抗体应答，减弱淋巴细胞对植物血凝素和刀豆素的促有丝分裂应答。对小鼠免疫系统可产生长期的影响，包括自发性免疫疾病，发病率明显增加；抑制吞噬细胞的吞噬能力及在细胞内杀灭降解被吞噬细菌的能力，对移植免疫学产生影响，可加速同种异系甚至同系小鼠之间皮肤移植的排斥；导致动物的移植瘤的抗原性质改变、致癌性降低而难以继续传代。（3）小鼠肝炎病毒：该病毒的潜在性感染可改变机体的各种免疫应答参数，显著降低小鼠血清免疫球蛋白水平，影响巨噬细胞
34、的数目、吞噬活性和杀伤肿瘤细胞活性，增强自然杀伤T细胞活性，诱生干扰素；使许多酶系统发生改变，增高某些肝酶活性，降低另一些肝酶活性；裸鼠感染可严重影响肿瘤免疫学的研究。（4）淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒：该病毒能在B、T淋巴细胞和巨噬细胞中大量复制，从而抑制体液和细胞介导的免疫应答。常可污染移植肿瘤，影响肿瘤学研究。2细菌感染对动物实验的影响 v多数都表现精神沉郁、食欲不振、被毛粗乱、体重下降、行为呆滞等全身症状。（1）人兽共患病原和动物致病菌：这类细菌中，有的如沙门氏菌、志贺氏菌、布氏杆菌、结核分枝杆菌等，不仅可引起实验动物的疾病，而且也是人类的重要致病菌，应坚决予以排除，以确保人员的健康和安全
35、。（2）条件性致病菌：一般不引起动物自然发病。当动物在某些诱因的作用下，机体抵抗力下降，导致疾病发生，甚至流行。它们一方面不断地向外部环境排菌，成为危险的传染源；另一方面，在动物实验过程中，由于受试验因素的刺激而发病，可使实验期间的动物发生不规律死亡，导致实验失败。如隐性感染绿脓杆菌的动物在进行放射性照射试验时，常发生致死性败血症。（3）正常菌群的细菌：许多正常菌群成员在受到内外环境的变化而发生菌群失调时，可发生数量的变化和位置的改变，由非致病菌转变成为致病菌。3真菌感染对动物实验的影响：病原真菌大多为人兽共患病原，其病原性比其它微生物弱，一般为慢性过程，多呈散发性，病理变化缺乏特征性，多以慢
36、性增生性炎症为主。若机体免疫功能低下，特别是细胞免疫功能低下时，常发生真菌感染。不仅影响科学实验的准确性，而且容易污染环境，威胁动物群体和饲养、实验人员的健康。一旦发现实验动物被真菌感染，应立即将饲养单元所有动物一并处死、焚烧，防止隐性感染动物的污染。4.寄生虫感染对动物实验的影响：v实验动物感染寄生虫后不仅虫体对动物机体造成一定的损害，而且动物机体也对虫体产生反应，使动物机体的生理、生化及免疫学指标发生改变，从而影响实验结果。v具体表现为抢夺宿主的营养、体外寄生虫骚扰动物、对宿主机械性损伤、对宿主产生毒性作用、对宿主生理生化和免疫系统产生影响等。v蛔虫在动物小肠内寄生，以半消化物质为食，抢夺
37、宿主大量营养并使动物出现体重下降、精神不振、消瘦、发育缓慢等一系列营养不良症状，在肠道中虫体有时可与肠内粘液混合形成栓塞堵塞肠道，引起肠梗阻，严重时造成肠破裂。第五节 影响动物实验结果的饲养环境因素v见第四章 实验动物的环境控制温度湿度气流与风速光照噪声空气洁净状况第六节第六节影响动物实验效果的动物营养因素影响动物实验效果的动物营养因素一、影响因素1、营养素的质与量v提供动物的养分过多、缺乏或失衡将影响实验动物的健康，并影响实验结果。v如小鼠维生素A过量可致其繁殖紊乱和胚胎畸形；豚鼠维生素C缺乏，可致坏血病、生殖机能下降等症状，甚至造成死亡。v动物的某些系统和器官，特别是消化系统的机能和形态随
38、饲料品种的更换而变异，如豚鼠日量中粗纤维含量不足，可引起其出现排粪障碍和脱毛现象。v摄入过多热量可加速或加重衰老、退行性变、传染病与肿瘤演变过程，以及对化学物质的毒性反应，从而严重干扰有关研究。2、饲料污染v实验动物日粮中含有许多天然、合成的化合物，这些化合物可能对生化和生理过程产生影响，但并不引起明显的中毒症状。v饲料的污染物包括氯化烃类、有机磷类、多氯联苯类和重金属以及黄曲霉素、硝酸盐、亚硝胺和雌激素化合物等。3、饮水v缺水或长期饮水不足，可对动物健康和生殖机能造成严重危害。缺水初期食欲明显减退，尤其不愿进食干饲料；随着失水的增多，干渴的感觉日益严重，可导致食欲完全丧失，消化机能减弱至丧失
39、，机体免疫力和抗病力显著降低。二、影响机制（一）进行非营养研究时的影响v在进行非营养研究时，由于动物的营养状况是与其生化指标、免疫反应息息相关的，故会影响动物实验结果。1、对采食量的影响v饲料的原料组成不同时，能量浓度也有差异，这直接影响动物的采食量，而动物的采食量变化就会影响动物所摄入药量的多少，从而影响实验结果。2、对生长发育的影响v实验动物的生长情况与饲料中所含营养素是否全面、充足、平衡，有毒有害成分的多少，适口性如何，甚至与饲料的软硬程度等都有密切关系。v营养因素特别是日粮的蛋白质水平，不仅影响实验动物的断奶体重、体长和尾长的生长曲线，而且影响各种脏器的重量和脏器系数，因而亦将影响实验
40、结果的准确性和重复性。3、对生理生化指标的影响v当饲料中的某种营养素含量发生改变时，必然导致血液及某些器官组织中该种营养素含量改变，从而影响相关生理生化指标。4、对免疫功能的影响v动物的营养状况影响动物的健康状况，并影响其免疫系统和机能。例如饲料中维生素A不足时，动物的免疫机能明显下降，此时动物的生长发育，甚至生化指标可能还未改变。5、对动物疾病的发生、发展和转归的影响v某些营养因素与癌、心血管疾病等非传染性疾病关系密切。v如在家兔骨折实验中，使用全价营养颗粒料，家兔骨骼如期愈合，而饲喂大麦青菜的家兔骨骼愈合速度则较慢。6、对动物麻醉反应的影响 v采食全价营养颗粒料的家兔在麻药注射后约10分钟
41、，绝大部分反射虽遭到不同程度的抑制，但眼球活动、瞳孔的大小与麻醉前无显著变化，且手术后复苏快。而采食营养失衡饲料的家兔，在麻药注射后10分钟左右，绝大多数都处于深度抑制状态。7、其它v饲料中的抗营养因子、毒素或农药残留、重金素污染等均可对研究结果造成直接或间接影响。（二）进行营养研究时的影响v在进行营养学研究时，饲料中的营养因素与动物的营养状况对研究结果的影响更大、更直接。1、动物早期营养状况 v动物早期的营养对其后期的营养状况有影响。动物妊娠和哺乳阶段的营养水平不仅影响仔代断奶前的生长发育，而且对其断奶后的生长发育特别是营养状况有影响，当这种影响较严重时，即使以后给予充足的营养也无济于事，造
42、成不可逆的后果。2、动物实验时的营养 v在动物体内，各种营养素之间存在非常复杂的关系，了解其关系对于营养研究至关重要。如维生素D和钙、磷之间密切相关，钙、磷之间也有密切关系。当我们研究维生素D的需要量时，要注意钙、磷水平与钙、磷比例。3、动物日粮 v在与营养相关研究中，尤其是营养与免疫、营养与癌症、营养与衰老的研究已成为热点，动物日量的控制问题日益受到重视。如研究维生素E与免疫功能的关系时，要注意控制日量中维生素A、微量元素硒、锰等的水平。此外，动物日量的种类对实验结果也有一定影响。第七节第七节影响动物实验效果的药物因素影响动物实验效果的药物因素一、抗菌素v某些抗菌素对实验动物有毒性，普鲁卡因
43、对豚鼠、兔和小鼠有毒性，用含有盐酸普鲁卡因的青霉素双氢链霉素给蒙古沙鼠注射后2h，可引起急性中毒和死亡。v许多抗菌素对免疫系统有关细胞的功能具有不良影响。如四环素类可抑制小鼠的迟发型超敏反应和巨噬细胞的体内趋化性。v抗菌素还可对实验结果造成影响。如经常使用抗菌素可引起动物心血管功能变化，有些抗菌素不仅减弱心肌和动脉平滑肌的收缩力，而且改变其他药物如去甲肾上腺素增强收缩力的作用。v抗菌素还影响代谢，并由此影响其他物质的毒性，或改变药物动力学。如氯霉素抑制肝脏微粒体酶，从而影响通过肝脏微粒体酶系统代谢的药物，如巴比妥类麻醉剂的药效。二、麻醉剂和镇静剂v麻醉剂对动物本身可有毒性，或可能增强其他药物的
44、毒性。v麻醉剂对心血管功能的影响已有许多研究。如戊巴比妥和氟烷可通过依赖钙的生化过程，而直接影响心肌和血管平滑肌，并影响平滑肌对被试药物的敏感性及实验结果。v麻醉剂还会影响免疫功能。如氟烷在血中达到一定浓度时，会减弱大鼠淋巴细胞对致有丝分裂原的应答；氟烷还有降低趋化性、减弱吞噬作用、改变淋巴细胞代谢活性作用。某些麻醉剂还可能影响肿瘤转移手术后的转归。一、分组v实验分组应当随机而不是随意。记录及报告中，应说明采用什么随机分组方法。要设立空白对照组，以排除非实验因素带来的影响。还要注意溶媒或其他赋形剂等的影响，亦须设立相应的对照组进行比较。二.实验药物v动物实验中常常需要给动物体内注入各种药物以观
45、察其作用和变化。因此给药的途径、制剂是影响实验中很重要的问题。v药物的浓度和剂量也是一个重要问题，剂量设计是否合理是实验成功与否的关键。动物和人用药剂量的换算以体表面积计算比以体重换算好一些。第八节第八节 影响动物实验结果的实验设计影响动物实验结果的实验设计 及实施因素及实施因素三、给药时间v动物试验的给药时间应当一致。一是可比性强，二是避免错误，而影响其他药理试验甚至临床用药。四、试验周期v急性毒性试验给药后至少观察1周，有的要观察2周或更长时间。五、动物实验环境v应符合国家及地方的标准，并保持稳定。环境温度对药物的LD50影响较大。六、资料记录v毒性试验过程要做好观察记录，特别要详细记录中
46、毒症状，尤其中毒发生时间、持续时间和恢复时间，或死亡时间等。七、剖检对急性毒性（7或14d后）存活的实验动物要称量体重，尤其是低剂量组动物，以了解中毒效应是短暂还是较长期的效应。对死亡动物应及时剖检，观察组织器官有无充血、出血、水肿或其他改变。肉眼观察有明显改变者，应作病理镜检。八、评价同种实验动物测定LD50时，不同给药途径的LD50值大小次序为，口服肌肉注射、皮下注射腹腔注射静脉注射，但也有少数药物例外。因此对具体药物要具体分析。九、关于最大限度试验我国新药审批办法关于急性毒性试验未提最大限度试验，而有最大耐受剂量（MTD），这比较符合实际。并且规定，如果口服大于5g/kg，或注射大于2g
47、/kg均不产生急性毒性症状或死亡，就不必做进一步试验。当然这不适用于中药及某些西药复方制剂，更不能依此作为长期毒性限度试验的依据。第九节第九节 影响动物实验效果的影响动物实验效果的 动物实验技术环节因素动物实验技术环节因素一、动物选择v应按照不同实验的要求选择合适的动物。如作肿瘤的研究工作，就必须了解哪种动物是高癌种，哪种是低癌种，各种动物自发性肿瘤的发生率是多少。二、实验季节v生物体的许多功能随着季节产生规律性的变动。如，不同季节对辐射效应有影响。三、昼夜过程v人和动物的生命活动存在昼夜规律性变动。研究发现：小鼠、大鼠和猴等动物的血液成分如白细胞、红细胞、血红蛋白、单核细胞和嗜酸性粒细胞与血
48、液生化值，普遍存在日夜节律，部分参数具有24小时周期性。v抗病力和易感性也可能存在日夜节律。v动物对照射的敏感性在昼夜间有不同的变化，白天放射敏感性降低，夜间升高。v体温、血糖、基础代谢率、内分泌激素的分泌均发生昼夜节律性变化。四、麻醉深度v动物实验中往往需要将动物麻醉后才能进行各种手术和实验。要求麻醉深度要适度，而且在整个实验过程中要保持始终恒定。如果麻醉过深，动物处于深度的抑制，甚至濒死状态，动物各种正常反应受到抑制，那是不会做出可靠的实验结果的。麻醉过浅，在动物身上进行手术或实验，将会引起强烈的疼痛的刺激，使动物全身，特别是呼吸、循环功能发生改变，消化功能也会发生改变，如疼痛刺激会反射性
49、地长时间中止胰腺的分泌。所以麻醉深度必须合适。五、手术技巧v手术熟练可以减少对动物的刺激，动物受的创伤、出血等就少，将会提高实验成功率和实验结果的正确性。六、对照问题v一般对照的原则是“齐同对比”。对照方法很多，有空白对照、实验对照、有效（或标准）对照、配对对照、组间对照、历史对照以及正常值对照等。1空白对照是在不给任何措施情况下观察动物自发变化的规律，以排除非实验因素带来的影响。2实验对照是采用与实验组相同操作条件的对照，如给药实验中的溶媒或其它赋形剂、手术、注射以及观察抚摸等都可以对动物发生影响。3有效（或标准）对照：常用于药物研究。对一新药的疗效要用一已知的有效药或能引起标准反应的药物做
50、对照，这样既可考核实验方法的可靠性，又可通过比较了解新药的疗效和特点。4配对对照：是同一个体在前后不同时间比较对照期和实验期的差异，或同一个体的左右两部分作对照处理和实验处理的差异，这样可大大减少抽样误差。5组间对照：是将实验对象分成两组或几组比较其差异。这种对照个体差异和抽样误差比较大。组间对照可用交叉对照方法以减少误差。6历史对照与正常值对照 这种对照要十分慎重，必须要条件、背景、指标、技术方法相同才可进行对比，否则将会得出不恰当的甚至错误的结论。7实验重复和肯定选用动物一方面要数量合适，不造成浪费，另一方面也应做必要的重复实验。有些实验单做一种动物还不够，应当重复做几种动物。v由于不同种
