1、 和和 地中海贫血的分子基础地中海贫血的分子基础及产前诊断及产前诊断 徐湘民徐湘民南方医科大学，医学遗传学教研室南方医科大学，医学遗传学教研室南方医院产前诊断和遗传病诊断技术中心南方医院产前诊断和遗传病诊断技术中心地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民1遗传性血红蛋白病遗传性血红蛋白病Genetic disorders of human hemoglobin 异常血红蛋白异常血红蛋白 Abnormal hemoglobin,Structural variants 地中海贫血地中海贫血(地贫地贫)遗传性持续性胎儿血红蛋白遗传性持续性胎儿血红蛋白 Hereditary persistence of
2、fetal hemoglobin(HPFH)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民2Thalassemia地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一中国南方不同高发地中国南方不同高发地区人群携带率区人群携带率 1 23%研究背景研究背景地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民3全球血红蛋白病人群负荷全球血红蛋白病人群负荷地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民4中国南方地中海贫血人群携带率中国南方地中海贫血人群携带率Xu,et al.J Clin Pathol 2004,57:517-22.Cai,et al.Chi J Epidemiol 2002,23:281-5.
3、地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民5广州市主要出生缺陷的发生率广州市主要出生缺陷的发生率(1998-2001)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民6Pedigree for -thalassemia in a typical family.地中海贫血地中海贫血:常染色体隐性遗传病常染色体隐性遗传病地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民7地贫是严重致死地贫是严重致死、致残性遗传性血液病致残性遗传性血液病 常染色体隐性遗传病常染色体隐性遗传病 受累基因：受累基因：突变纯合子：突变纯合子：病理学基础：病理学基础：/链比例失衡链比例失衡地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民8地贫纯合子：致死性出生缺陷地
4、贫纯合子：致死性出生缺陷重型重型 地贫地贫:胎儿水肿综合征胎儿水肿综合征 早产死胎或出生前后死亡早产死胎或出生前后死亡 可导致严重产科并发症可导致严重产科并发症 无理想治疗方法无理想治疗方法重型重型 地贫地贫 出生后出生后1 1年内发病年内发病 多于未成年前因严重贫血而夭折多于未成年前因严重贫血而夭折 输血和去铁治疗可维持输血和去铁治疗可维持,代价昂贵代价昂贵地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民9家系样品采集现场家系样品采集现场地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民10研究地中海贫血的意义研究地中海贫血的意义 重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题
5、通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病 预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求研究背景研究背景地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民11中国需要解决的研究主题中国需要解决的研究主题 发展用于临床和预防的分子诊断技术发展用于临床和预防的分子诊断技术 高发地区人群中的遗传流行病学调查高发地区人群中的遗传流行病学调查 开展人群水平的地中海贫血预防开展人群水平的地中海贫血预防地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民12指导
6、制定计划指导制定计划大人群监控和预防大人群监控和预防用于基因分型用于基因分型用于产前诊断用于产前诊断 诊断诊断 筛查筛查 预防预防地中海贫血的研究策略地中海贫血的研究策略研究背景研究背景遗传流行病学调查遗传流行病学调查建立一系列诊断标准和诊断技术建立一系列诊断标准和诊断技术地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民13地中海贫血的临床特征地中海贫血的临床特征小细胞低色素性溶血型贫血小细胞低色素性溶血型贫血(中、重度中、重度)黄疸黄疸肝脾肿大肝脾肿大(脾大明显脾大明显)骨髓扩增骨髓扩增发育迟缓发育迟缓合并感染合并感染Barts Barts 水肿胎水肿胎(地贫地贫,宫内或出生后半小时内死亡宫内或出生后半
7、小时内死亡)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民14地中海贫血的血液学表型特征地中海贫血的血液学表型特征 RBC 参数参数 MCV MCH 细胞形态变化细胞形态变化 Hb电泳分析电泳分析 Hb A2 ()或或 ()Hb Barts Hb H()Hb E()地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民15地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民16血红蛋白电泳图谱血红蛋白电泳图谱1 2 3 4 51.正常人正常人HB2.轻型轻型 地贫地贫 3.异常异常HB E 杂合子杂合子4.新生儿新生儿HB
8、 Barts(地贫标准型地贫标准型）5.HB HNormal AA2 AE Barts AF HA+-500V,25min地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民17地贫地贫发生的发生的分子病理学经典机制分子病理学经典机制 地贫地贫:基因缺失使基因功能丢失基因缺失使基因功能丢失 地贫地贫:结构基因变异使结构基因变异使转录异常转录异常地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民18 -50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb(-SEA)Deletion (-4.2)Deletion(-3.7)Deletion 2 1导致导致地贫的不同类型的基因缺失地贫的不同类型的基因缺失地中海贫血的分子基
9、础及产前诊断徐湘民19 Globin genes affected by thalassemia deletionSilent carrierThalassemia traitHb H diseaseHydrops fetalisNormal 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民20地贫疾病严重程度的单倍型顺序 2 1T 2 1 2T 1 1T 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民21Hematological data of the proposituse and her family members.地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民22Jia SQ,et al.J Clin Patho
10、l,2004;57:164-7.地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民23Different point mutations reducing globin gene expression EXON 1IVS 1 EXON 2EXON 3 IVS 2Rund.&Rachmilewitz.N.Engl.J.Med.2005,353:1135-46.地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民24世界上不同种族的常见世界上不同种族的常见地贫突变地贫突变类型类型 种种 族族 突变类型突变类型 地中海人地中海人 IVS-1,position 110(G A)CD39,nonsense(CAG TAG)IVS-1
11、,position 1(G A)IVS-2,position 745(C G)IVS-1,position 6(T C)IVS-2,position 1(G A)黑人黑人 29,(A G);88,(C T)Poly(A),(AATAAA AACAAA)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民25东南亚人东南亚人,中国人中国人 CD 41-42,Frameshift(CTTT)IVS-2,position 654(C T)28,(A G);Hb E(G A)CD17,nonsense(AAG TAG)IVS-1,position 5(G C)亚洲印地安人亚洲印地安人 IVS-1,position 5
12、(G C)619-bp deletion CD 8-9,Frameshift(+G)IVS-1,position 1(G T)CD 41-42,Frameshift(CTTT)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民26Results of blood analysis,DNA diagnosis and Results of blood analysis,DNA diagnosis and mRNA detection in the family members.mRNA detection in the family members.地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民27Sequencing
13、 of the -globin gene amplified from the probandHeterozygosity for the CHeterozygosity for the CT substitution T substitution at position-90 of the-globin geneat position-90 of the-globin gene地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民28近年来发现的部分中国南方新突变近年来发现的部分中国南方新突变地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民29地中海贫血的产前诊断地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术胎儿取样技术 DNA诊断
14、技术诊断技术 -地贫的诊断地贫的诊断 -地贫的诊断地贫的诊断地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民30羊膜穿刺羊膜穿刺 (amniocentesis)抽取胎儿样品示意图抽取胎儿样品示意图地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民31 植入前基因诊断植入前基因诊断 Preimplantation genetic diagnosis(PGD)超声产前诊断超声产前诊断 Prenatal diagnosis:Ultrasound measurement 母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断 Prenatal diagnosis:Fetal cells in the matern
15、al circulation 母体血浆或血清中胎儿母体血浆或血清中胎儿DNA分析分析 Analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum目前及今后的胎儿产前诊断新技术目前及今后的胎儿产前诊断新技术地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民32Ding C,Chiu RW,Lau TK,Leung TN,Chan LC,Chan AY,Charoenkwan P,Ng IS,Law HY,Ma ES,Xu X,Wanapirak C,Sanguansermsri T,Liao C,Ai MA,Chui DH,Cantor CR,Lo YM.MS ana
16、lysis of single-nucleotide differences in circulating nucleic acids:Application to noninvasive prenatal diagnosis.Proc Natl Acad Sci U S A.2004 20;101(29):10762-7.地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民33单碱基延伸产物的质谱分析单碱基延伸产物的质谱分析M FF父亲的突变类型父亲的突变类型SABER:single allele base extension reaction 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民34分子量分子量FMSta
17、ndard protocol SABER protocol在母血浆在母血浆DNADNA中中排除排除父亲的父亲的地贫突变地贫突变+双亲基因型不同：双亲基因型不同：地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民35鉴定母血浆鉴定母血浆DNA中的父亲中的父亲地贫突变地贫突变地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民36地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民37地中海贫血的产前诊断地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术胎儿取样技术 DNA诊断技术诊断技术 -地贫的诊断地贫的诊断 -地贫的诊断地贫的诊断地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民38DNA诊断技术诊断技术 多重多重PCR（multiplex PCR）等位基因特异性性
18、寡核苷酸杂交（等位基因特异性性寡核苷酸杂交（ASO）反向点杂交反向点杂交（RDB）变性高效液相色谱（变性高效液相色谱（DHPLC）基于基于微孔板微孔板(microtiter well-based)高通量检测高通量检测 实时实时PCR(real-time PCR)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民39 -50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb(-SEA)Deletion (-4.2)Deletion(-3.7)Deletion 2 1导致导致地贫的不同类型的基因缺失地贫的不同类型的基因缺失地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民40Location of primers and
19、 detection of-SEA deletion by gap-PCR地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民41Genotyping of the-SEA alleles by Gap-PCR 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民42Chong SS,et al.Blood.2000;95(1):360-2.地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民43寡核苷酸探针杂交技术寡核苷酸探针杂交技术地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民44ASOASO探针检测探针检测 -地贫基因诊断结果地贫基因诊断结果 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民45PCRBBBBBBgDNAHybridizationDetec
20、tionStreptavidin-PODColor Signal MMembraneASON M N M N MSubstrate(TMB)反反向向点点杂杂交交技技术术地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民46RDB analysis:application to rapid prenatal diagnosisRDB analysis:application to rapid prenatal diagnosisfor eight thalassaemia mutations.for eight thalassaemia mutations.GenotypeFather CDs41-42(CT
21、TT)/N MotherIVS-2-654(C T)/N FetusCDs41-42 /IVS-2-654Normal control N /N 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民47Human Human -globin gene and the PCR amplicons-globin gene and the PCR amplicons 5UTREXON 1IVS 1EXON 2IVS 2 IVS2EXON 33UTRFA(453bp)FB(364bp)FC(423bp)-90,-73,-29,-28cd2cd13-14,cd14-15,cd15-16,cd17 cd26,cd27-2
22、8 IVS1-1,IVS1-5 cd37,cd38 cd41-42,cd43cd71-72IVS2-5,IVS2-16IVS2-654,IVS2-666地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民4868 uniquely profiled DHPLC patterns observed from 795 DNA samples地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民49实验结果实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民50实验结果实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民51实验结果实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民52实验结果实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民53实验结果实验结
23、果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民54中国南方中国南方 和和地中海贫血的预防计划地中海贫血的预防计划人群筛查预防计划的策略人群筛查预防计划的策略 医院水平医院水平(Hospital-based)(Hospital-based)的预防计划的预防计划 社区水平社区水平(community-based)(community-based)的预防计划的预防计划 家系扩展筛查家系扩展筛查(screening extended families)(screening extended families)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民55Carrier screening for and thala
24、ssemia in pregnancy:the results of an 11-year prospective program in Guangzhou Maternal and Neonatal Hospital Guangzhou Maternal and Neonatal Hospital Liao C Li J Huang YN Li QM Feng Q Zhong HZ Cui YYSouthern Medical University Mo QH Li LY Hua L Zhang JZ Zeng R Jia SQ Xu XMPrenat Diagn 2004,25:163-7
25、1地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民56地贫携带者筛查及产前诊断流程地贫携带者筛查及产前诊断流程被检对象被检对象（婚前或孕中期）（婚前或孕中期）血液学分析血液学分析（MCV，Hb A2变化）变化）排除地贫排除地贫地贫携带者地贫携带者遗传咨询，配偶检查遗传咨询，配偶检查血液学分析血液学分析（MCV Hb A2变化）变化）地贫携带者地贫携带者排除地贫排除地贫遗传咨询遗传咨询双亲基因分析双亲基因分析胎儿产前诊断胎儿产前诊断地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民57Outcomes of screening program in GZMNH 1993-2003 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民58
26、(contd)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民59Prenatal diagnosis in 83 fetuses at-risk for thalassemia 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民60(contd)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民61Results in 266 pregnancies where a precisediagnosis was achieved*Three Hb H disease involved地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民62Detection of the-SEA/deletion by 1%agarose gelelectrophor
27、esis of amplified fragments using gap-PCR.地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民63 筛查发现的阳性孕妇或阳性夫妇筛查发现的阳性孕妇或阳性夫妇 地贫地贫1 地贫地贫 地贫地贫 地贫地贫 5.7%3.6%4.4%1.8%Total of 4503 couples screened Outcomes of screening program in GZMNH 1993-200354例例Barts水肿儿和水肿儿和Hb H病病 18例例重型重型地贫地贫 2804 1783 198对对 83对对产前诊断：产前诊断：187 例例 地贫地贫 82例例 地贫地贫 地中海
28、贫血的分子基础及产前诊断徐湘民64 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民65 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民66 自行研制的东南亚型地贫链免疫学检测试剂盒AB地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民67地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民68产前遗传学的临床和公共卫生问题产前遗传学的临床和公共卫生问题1.1.利用有效的公共卫生教育资源，首先使医生利用有效的公共卫生教育资源，首先使医生2.2.和公众了解更多的地贫知识和知晓选择遗传和公众了解更多的地贫知识和知晓选择遗传3.3.服务及其对待产前诊断的态度是我们面临的服务及其对待产前诊断的态度是我们面临的4.4.一个重要课题；一个重要课题；2.2.
29、为满足大规模预防工作的需要，我们须大力为满足大规模预防工作的需要，我们须大力 加强专科医生加强专科医生,遗传咨询师，及其他相关专业遗传咨询师，及其他相关专业 人员的培训工作人员的培训工作;地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民693.3.预防监测系统建立过程中，要特别注重转诊、预防监测系统建立过程中，要特别注重转诊、病例登记、实验室质量控制的把关病例登记、实验室质量控制的把关;4.4.政府在组织、基础建设、制定政策法规和行政府在组织、基础建设、制定政策法规和行 政管理上的主导作用是推动预防计划的关键政管理上的主导作用是推动预防计划的关键 因素。因素。(contd)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民70A AcknowIedgmentscknowIedgments 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民71
