1、会计学1微生物的实验室培养微生物的实验室培养 公开课公开课第2页/共44页第3页/共44页第4页/共44页第5页/共44页1.1.概念：概念：人们按照人们按照微生物微生物对营养物质的不同需求，对营养物质的不同需求，配制出供其配制出供其生长繁殖的营养基质生长繁殖的营养基质。二二.培养基培养基思考：微生物要生存繁殖，需要思考：微生物要生存繁殖，需要“吃吃”什么？什么？第6页/共44页2.2.培养基的营养物质培养基的营养物质1.1.水水2.2.碳源碳源（提供碳元素的物质）（提供碳元素的物质）3.3.氮源氮源（提供氮元素的物质）（提供氮元素的物质）4.4.无机物无机物（无机盐）（无机盐）第7页/共44
2、页3.3.培养基的类型培养基的类型（1 1）按物理状态分：）按物理状态分：固体培养基固体培养基 半固体培养基半固体培养基 液体培养基液体培养基区别区别：加入琼脂的量决定培养基的物理状态。：加入琼脂的量决定培养基的物理状态。注意：一般细菌不能利用琼脂。注意：一般细菌不能利用琼脂。第8页/共44页 单个或者少数微生物在固体培养基表面生单个或者少数微生物在固体培养基表面生长繁殖长繁殖,可以形成肉眼可见子细胞的群体可以形成肉眼可见子细胞的群体菌菌落落固体培养基用途固体培养基用途：用于微生物：用于微生物纯化、计数、鉴定纯化、计数、鉴定第9页/共44页液体培养基：工业生产液体培养基：工业生产表面生长表面生
3、长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长第10页/共44页半固体培养基：观察运动半固体培养基：观察运动第11页/共44页天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基化学成分不恒定的化学成分不恒定的天然有机物天然有机物如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基如：牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基化学成分完全了解化学成分完全了解的物质配制而成的培养基的物质配制而成的培养基（2 2）按化学成分划分：）按化学成分划分：第12页/共44页鉴别培养基鉴别培养基将某种类微生物从混杂的微生物群体中将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离分离出来出来用于用于鉴别鉴别不同类型微生物的培养基不同类型微生物的培养基选择培养基选
4、择培养基（3 3）按用途划分：）按用途划分：第13页/共44页选择培养基和鉴别培养基的比较选择培养基和鉴别培养基的比较选择培选择培养基养基鉴别培鉴别培养基养基第14页/共44页2.2.无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验用具灭菌实验操作过程实验操作过程3.3.无菌的方法：无菌的方法：酒精灯旁操作酒精灯旁操作三三.无菌技术无菌技术防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.无菌的意义：无菌的意义：消毒与灭菌消毒与灭菌第15页/共44页（1 1）消毒）消毒（2 2）灭菌）灭菌概念概念较为温和较为温和理化方法理化方法杀死杀死部分部分
5、有害微生物有害微生物强烈强烈的理化因素的理化因素杀死杀死所有所有的微生物的微生物2.无菌的方法无菌的方法第16页/共44页接种室内空气、接种箱、超净工作接种室内空气、接种箱、超净工作台台紫外线消毒紫外线消毒实验者的手臂、实验台等实验者的手臂、实验台等化学药剂消毒化学药剂消毒牛奶等不宜高温消毒灭菌的牛奶等不宜高温消毒灭菌的巴氏消毒巴氏消毒日常食物、罐装食品日常食物、罐装食品煮沸消毒法煮沸消毒法适用范围适用范围方法方法（1 1）消毒）消毒第17页/共44页培养基、实验器材培养基、实验器材高压蒸汽灭高压蒸汽灭菌菌耐高温需干燥的物品（玻璃器耐高温需干燥的物品（玻璃器皿等）皿等）干热灭菌干热灭菌接种的工
6、具、试管口、瓶口接种的工具、试管口、瓶口灼烧灭菌灼烧灭菌适用对象适用对象灭菌方法灭菌方法灼烧灼烧灭菌灭菌干热灭菌箱干热灭菌箱高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅（2 2）灭菌）灭菌第18页/共44页请你判断以下材料或用具是否需要消毒请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻璃棒、试管、烧瓶玻璃棒、试管、烧瓶（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。第19页/共44页我们已经对培养基和无
7、菌技术有了一定的了解，我们已经对培养基和无菌技术有了一定的了解，你能不能用培养基进行大肠杆菌的纯化培养？你能不能用培养基进行大肠杆菌的纯化培养？第20页/共44页大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基四四.实验操作实验操作（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌第21页/共44页1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H H2 2O O 定容至定容至1000ml1000mlNacl 5gNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g10g牛肉膏牛肉膏 5g5g琼脂琼脂20.0g20.0g1.1.计算：计算：依配方
8、计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂、搅拌琼脂、搅拌 补水定容补水定容4.4.灭菌：灭菌：5.5.倒平板：倒平板：（一）制备培养基（一）制备培养基培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌第22页/共44页计算计算称量称量溶化溶化灭菌灭菌倒平板倒平板（一）制备培养基（一）制备培养基1.1.将培养皿放在将培养皿放在火焰旁火焰旁的桌面上，右手的桌面上，右手拿装有培
9、养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。123 42.2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过通过火焰火焰。3.3.用左手将培养皿打开用左手将培养皿打开一条一条稍大稍大于瓶口的于瓶口的缝隙缝隙，右手将锥形瓶中，右手将锥形瓶中的培养基的培养基(约约101020mL)20mL)倒入培养倒入培养皿，左手皿，左手立即盖上立即盖上皿盖。皿盖。4.4.等待平板等待平板冷却凝固冷却凝固（约需（约需5 5 10min10min）。然后，将平板）。然后，将平板倒过来倒过来放放置，使皿盖在下，皿底在上。置，使皿盖在下，皿底在上。第23页/共44页1.1.培养基灭菌后，需要冷
10、却到培养基灭菌后，需要冷却到5050左右时，才能左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。度下降到刚刚不烫手即可。2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。第24页/共44页3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在倒平板的过程中，
11、如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？培养微生物吗？为什么？答：答：防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染 避免培养基中水分过快蒸发。避免培养基中水分过快蒸发。答：最好不要用这个平板培养微生物。答：最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。之间的培养基上滋生。第25页/共44页单个细胞单个细胞单个菌落单个菌落（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌如何纯化？如何纯化？接种接种常见常见方法方法平板划线法平板划线法
12、如何分散成单个细胞？如何分散成单个细胞？稀释涂布平板法稀释涂布平板法微生物群微生物群分散分散第26页/共44页1.1.平板划线法：平板划线法：分区划线法分区划线法连续划线法连续划线法（1 1）概念与原理：）概念与原理：聚集的菌群聚集的菌群连续划线连续划线稀释分散稀释分散单个细胞单个细胞菌落菌落生长繁殖生长繁殖第27页/共44页(2)“平板划线平板划线”实验操作实验操作第28页/共44页（1 1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧仍然需要灼烧接种环吗？为什么？接种环吗？为什么？杀
13、死接种环上残留的菌种，避免细菌污杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者染环境和感染操作者接种结束后接种结束后杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端的菌种直接来源上次划线的末端，从而，从而使使每次划线时菌种数目逐渐减少每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到，直至得到单个细胞单个细胞每次划线前每次划线前杀死接种环上原有微生物杀死接种环上原有微生物取菌种前取菌种前目的目的灼烧时期灼烧时期第29页/共44页（2 2）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？再进行划线？答：以免接种环温
14、度太高，杀死菌种答：以免接种环温度太高，杀死菌种。（3 3）在作第二次以及其后的划线操作时，为什）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？么总是从上一次划线的末端开始划线？答：答：线条末端细菌的数目比线条起始处要少线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最，最终得到单个细菌繁殖而来的菌落。终得到单个细菌繁殖而来的菌落。第30页/共44页3 3个划线平板个划线平板1 1个不划线平板个不划线平板（重复实验）（重复实验）（空白对照）
15、（空白对照）（3 3）培养）培养放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h第31页/共44页2.2.稀释涂布平板稀释涂布平板法法菌液的梯度稀释：菌液的梯度稀释：涂布平板操作：涂布平板操作：(1)(1)概念与原理：概念与原理：聚集的微生物聚集的微生物单个细胞单个细胞菌液梯度稀释菌液梯度稀释菌落菌落涂布平板涂布平板(2)(2)操作：操作：生长繁殖生长繁殖第32页/共44页系列梯度稀释操系列梯度稀释操作作9mL9mL无菌无菌水水9mL9mL无菌无菌水水9mL9mL无菌无菌水水9mL9mL无菌无菌水水9mL9mL无菌无菌水水9mL9mL无菌无菌水水注意：移液管需要经过注意：移液管
16、需要经过灭菌灭菌；试管口和移液管离；试管口和移液管离火焰火焰1 12cm2cm处。处。第33页/共44页涂布平板操作：涂布平板操作：第34页/共44页各梯度分别涂布各梯度分别涂布3 3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h（3 3）培养）培养第35页/共44页1.1.临时保藏：临时保藏：试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1m
17、l菌液菌液2020三三 菌种的保存菌种的保存3 36 6个月，转移培养个月，转移培养第36页/共44页_。有选择作用。因为此配方中尿素是唯一氮有选择作用。因为此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长能够生长葡萄糖葡萄糖尿素尿素第37页/共44页A第38页/共44页四四 成果评价成果评价如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温1 12d2d后后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求
18、如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。求。（一）培养基的制作是否合格（一）培养基的制作是否合格第39页/共44页（三）是否进行了及时细致的观察与记录（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养培养12h12h与与24h24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。并能观察到其他一些细微的变化。第40页/共44页液体培养基：工业生产液体培养基：工业生产表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长第41页/共44页固体培养基用途固体培养基用途：用于微生物：用于微生物纯化、计数、鉴定纯化、计数、鉴定第42页/共44页半固体培养基：观察运动半固体培养基：观察运动第43页/共44页感谢您的观看！感谢您的观看！第44页/共44页
