1、生物大分子的制备技术生物大分子的制备技术 蛋白质、核酸的分离和提纯蛋白质、核酸的分离和提纯 研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有生物活性研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有生物活性的的目的物质目的物质。基本原理不外乎两方面：基本原理不外乎两方面：一是利用混合物中几个一是利用混合物中几个组分分配率组分分配率的差别，把它们分配到的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；提取、层析和结晶等；二是将混合物置于二是将混合物置于单一物相单一物相中，通过物理力场的作用使各组中，通过物理力场的作用使各
2、组分分配于不同区域而达到分离的目的分分配于不同区域而达到分离的目的，如，如电泳、超速离心、电泳、超速离心、超滤等。超滤等。而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的大分子的完整性完整性，防止，防止酸、碱、高温酸、碱、高温及及剧烈机械作剧烈机械作用用而导致所提物质而导致所提物质生物活性的丧失。生物活性的丧失。生物大分子的制备一般分为以下四个阶段：生物大分子的制备一般分为以下四个阶段：选择选择材料和预处理材料和预处理；细胞的细胞的破碎及细胞器的分离破碎及细胞器的分离；提取和纯化提取和纯化；浓缩浓缩干燥和保存干燥和保存。第一节第一节 选择材料及预处理选择
3、材料及预处理 选材：选材：微生物、植物和动物都可作为制备生物大微生物、植物和动物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确分子的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。定。（一）微生物（一）微生物 微生物应该注意它的微生物应该注意它的生长期生长期，在微生物的，在微生物的对数生对数生长期长期，酶和核酸酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料时有两种情况以微生物为材料时有两种情况 1 1、利用微生物菌体、利用微生物菌体分泌分泌到培养基中的代到培养基中的代谢产物和胞外酶等；谢产物和胞外酶等；2 2、利用、利用菌体菌体含有的生化物质，如蛋
4、白质、含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。核酸和胞内酶等。（二）植物材料（二）植物材料 植物材料必须经过植物材料必须经过去壳、脱脂去壳、脱脂并注并注意植物品种和生长发育状况不同，其中意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的所含生物大分子的量变化很大量变化很大，另外与，另外与季节性季节性关系密切。关系密切。（三）动物组织（三）动物组织 动物组织用有效成分含量丰富的动物组织用有效成分含量丰富的脏器组织脏器组织为原料，先进行为原料，先进行绞碎、脱脂绞碎、脱脂等处理。另外，等处理。另外，对于处理好的材料，若不立即进行实验，应对于处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。对于易分解的生
5、物大分子应选用冷冻保存。对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。新鲜材料制备。第二节第二节 细胞的破碎及细胞器的分离细胞的破碎及细胞器的分离一、细胞的破碎一、细胞的破碎 1 1、高速组织捣碎机捣碎、高速组织捣碎机捣碎 此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。2.2.玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆 此法对细胞破碎程度比高速组织捣碎机此法对细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用量少的动物内脏组织。为高，适用量少的动物内脏组织。3.3.反复冻融法反复冻融法 将细胞在将细胞在2020以下冰冻，室温融解，以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内反复几次，由于细胞内
6、冰粒冰粒形成和剩余细胞形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。4.4.化学处理法化学处理法 有些动物细胞，如：肿瘤细胞可采用有些动物细胞，如：肿瘤细胞可采用十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）、去氧胆酸钠等使）、去氧胆酸钠等使细胞膜破坏。如果细胞壁较厚，可采用细胞膜破坏。如果细胞壁较厚，可采用溶菌溶菌酶酶处理效果更好。处理效果更好。5 5、超声波处理、超声波处理 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧振荡破碎。此法多适用于急剧振荡破碎。此法多适用于微生物材料微生物材料，用，用大大肠杆菌肠杆
7、菌制备各种酶，常选用菌体质量浓度为制备各种酶，常选用菌体质量浓度为5050100mg/ml 100mg/ml，在，在1010100KHz100KHz频率下处理频率下处理101015min 15min。此法的缺点是在处理过程中会产生大量的热能，此法的缺点是在处理过程中会产生大量的热能，应采取相应降温措施。对超声波敏感的酶和核酸应采取相应降温措施。对超声波敏感的酶和核酸应慎用。应慎用。细胞器名称细胞器名称 主要蛋白和酶主要蛋白和酶 核核 酸酸细胞核细胞核 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系 全部的全部的DNA和和RNA10线粒体线粒体 电子传递、氧化磷酸化、三羧酸循环、电子传
8、递、氧化磷酸化、三羧酸循环、微量微量DNA，总，总RNA 脂肪酸的氧化、氨基酸氧化等脂肪酸的氧化、氨基酸氧化等 510 内质网内质网（微粒体）微粒体）蛋白质合成酶系、羟化酶类蛋白质合成酶系、羟化酶类 总总RNA50溶酶体溶酶体 水解酶系（核酸酶、磷酸酯酶、水解酶系（核酸酶、磷酸酯酶、组织蛋白酶及糖苷酶）组织蛋白酶及糖苷酶）高尔基体高尔基体 糖苷转移酶、粘多糖类固醇合成酶糖苷转移酶、粘多糖类固醇合成酶细胞膜细胞膜 载体与受体蛋白、特异抗体、载体与受体蛋白、特异抗体、ATP酶、酶、环腺苷酶、葡萄糖环腺苷酶、葡萄糖6磷酸酶磷酸酶细胞液细胞液 嘧啶与嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、嘧啶与嘌呤代谢、氨基酸合成
9、酶系、RNA（主要是（主要是t RNA 可溶性蛋白类可溶性蛋白类 占占50）二、细胞器的分离二、细胞器的分离 各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。一般采用差速离心法。一般采用差速离心法。第三节第三节 提取和纯化提取和纯化 提取是将经过处理或破碎的细胞，置于一定的提取是将经过处理或破碎的细胞，置于一定的条件和溶液中让被提取的生物大分子充分释放出来条件和溶液中让被提取的生物大分子充分释放出来的过程。的过程。影响提取的因素主要是被提取物质在影响提取的因素主要是被提取物质在提取的溶提取的溶液中溶解度的大小液中溶解度的大小及及由固相扩散到液相的难易程度。由固相扩散
10、到液相的难易程度。某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂理化性质有关，一般遵守相似相溶的原则。及溶剂理化性质有关，一般遵守相似相溶的原则。一、蛋白质的提取（包括酶）一、蛋白质的提取（包括酶）、pHpH 蛋白质和酶是具有等电点的两性电解质，提取蛋白质和酶是具有等电点的两性电解质，提取液的液的pHpH应选择在应选择在偏离等电点两侧的偏离等电点两侧的pHpH范围内范围内。用稀。用稀酸或稀碱提取时，应酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱防止过酸或过碱而引起蛋白质而引起蛋白质可解离基团发生变化。可解离基团发生变化。从而导致蛋白构象的不可逆从而导致蛋白构
11、象的不可逆变化。一般来说，变化。一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。盐浓度盐浓度 稀盐溶液可促进蛋白的溶解，称为盐溶稀盐溶液可促进蛋白的溶解，称为盐溶作用。作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因因此在提取液中加入少量此在提取液中加入少量NaclNacl等中性盐，一般等中性盐，一般以以 0.15mol/L0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.02-0
12、.05mol/L0.05mol/L磷酸盐或碳酸盐的等渗盐溶液。磷酸盐或碳酸盐的等渗盐溶液。一、蛋白质的分离纯化一、蛋白质的分离纯化（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1.1.蛋白质的盐析蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响，一般在中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度的升高，蛋白质的溶解度增加，低盐浓度下随着盐浓度的升高，蛋白质的溶解度增加，称为称为盐溶盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称为同程度下降并先后析出，这种现象称为盐析盐析。血浆蛋白质的
13、分段盐析硫酸铵的饱和度硫酸铵的饱和度g.(100ml H2O)-1 沉淀的蛋白沉淀的蛋白质质 20 纤维蛋白纤维蛋白 4833 r 球蛋白球蛋白 4046 a 球蛋白球蛋白 50 清蛋白清蛋白 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的是硫酸其中应用最多的是硫酸铵，它的优点是铵，它的优点是硫酸铵分段盐析效果也比其它盐好，硫酸铵分段盐析效果也比其它盐好，不易引起蛋白质变性。不易引起蛋白质变性。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用
14、的办法是中的盐除去，常用的办法是透析透析。此外也可用此外也可用葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G25G25或或G50G50过柱过柱的办法除盐，所用时的办法除盐，所用时间比较短。间比较短。2.2.等电点沉淀法等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的等电点有差别，可利用调节溶液的pHpH，达到，达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合使用。单独使用，可与盐析法结合使用。3.3.有机溶剂提取法有机溶剂提
15、取法 （破坏水化膜和中和电荷）（破坏水化膜和中和电荷）一些和脂质结合比较的蛋白质和酶，它们不溶一些和脂质结合比较的蛋白质和酶，它们不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中。这种情况可用于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中。这种情况可用乙乙醇、丙酮或丁醇等有机溶剂醇、丙酮或丁醇等有机溶剂，它们具有较强的亲脂，它们具有较强的亲脂性，但必须在性，但必须在低温低温下操作。下操作。丁醇提取法：丁醇提取法：一是因为丁醇亲脂性强，溶解磷一是因为丁醇亲脂性强，溶解磷脂的能力强；二是丁醇具有亲水性，在溶解度范围脂的能力强；二是丁醇具有亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性和失活。内不会引起酶的变性和失活。另外丁醇提取法的另外丁
16、醇提取法的pHpH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。料。（二）根据蛋白质分子大小的差别分离方法（二）根据蛋白质分子大小的差别分离方法 1.1.透析及超滤法透析及超滤法 （利用蛋白质的大分子性质不能透（利用蛋白质的大分子性质不能透过半透膜）过半透膜）目目 录录2.凝胶过滤法凝胶过滤法SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(三三)根据蛋白质带电性质进行分离根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同蛋白质在不同pHpH环境中带电性质和电荷数量不同环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。可将其分开。1.1.电泳法电泳法 目目 录录
17、带有带有NHNH3 3+2.2.离子交换层析离子交换层析二、核酸的提取二、核酸的提取（一）（一）DNADNA的提取的提取1.1.组织细胞破碎后，加入组织细胞破碎后，加入0.5mol/LNacl0.5mol/LNacl溶液，离溶液，离心去上清心去上清;2.2.于沉淀中加于沉淀中加1.0molNacl/L1.0molNacl/L溶解溶解;3.3.然后用酚氯仿混合液振摇抽提。离心留取水相然后用酚氯仿混合液振摇抽提。离心留取水相;4.4.加入加入2 2倍体积的乙醇沉淀倍体积的乙醇沉淀DNA;DNA;5.DNA5.DNA制品中的少量的制品中的少量的RNARNA可用纯的可用纯的RNaseRNase水解除去
18、。水解除去。（二）（二）RNARNA的提取的提取 在提取在提取RNARNA时最要紧的问题是防止时最要紧的问题是防止RNaseRNase的降解。的降解。常用的抑制措施有：常用的抑制措施有：低温低温44操作；操作；所用器所用器皿高压消毒，试剂中加入皿高压消毒，试剂中加入RNaseRNase抑制剂；抑制剂；操作中戴操作中戴手套。手套。现在普遍通用的从动物组织和培养细胞中提取完现在普遍通用的从动物组织和培养细胞中提取完整的总整的总RNARNA的方法是的方法是异硫氰酸胍法异硫氰酸胍法，它有很强的抑制，它有很强的抑制RNaseRNase活性的作用，使蛋白质变性效果也很好。活性的作用，使蛋白质变性效果也很好
19、。三、核酸的纯化三、核酸的纯化 核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质。核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质。通常只要用酚氯仿抽提核酸的水溶液即可。通常只要用酚氯仿抽提核酸的水溶液即可。四、核酸的浓缩四、核酸的浓缩 核酸浓缩应用最为广泛的是乙醇沉淀法。核酸浓缩应用最为广泛的是乙醇沉淀法。五、五、DNADNA、RNARNA的定量的定量 准确的方法是紫外分光光度法。用紫外分准确的方法是紫外分光光度法。用紫外分光光度计测定光光度计测定260nm 260nm 和和280mn280mn两个波长处的吸两个波长处的吸光度，然后，光度，然后，1A260=50ug1A260=50ugmlml双链双链DNADNA1A260
20、=40ug1A260=40ugmlml单链单链DNADNA或或RNARNA 260nm 260nm和和280nm280nm两处读数的比值（两处读数的比值（A260A260A280A280），可反映核酸的纯度。），可反映核酸的纯度。DNADNA和和RNARNA纯品的纯品的吸光度比值分别是吸光度比值分别是1.81.8和和2.0 2.0。如果样品中有。如果样品中有蛋白质或酚的污染，则两者比值将明显降低。蛋白质或酚的污染，则两者比值将明显降低。第四节第四节 浓缩、干燥及保存浓缩、干燥及保存 一、样品的浓缩一、样品的浓缩 为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。缩。1
21、.1.减压加温蒸发浓缩减压加温蒸发浓缩 该方法通过降低液面压力使液体沸点降该方法通过降低液面压力使液体沸点降低，加压的真空度愈高，液体沸点降的愈低，低，加压的真空度愈高，液体沸点降的愈低，蒸发愈快。此法适用于一些不耐热的生物大蒸发愈快。此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。分子的浓缩。2.2.空气流动蒸发浓缩空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发，将铺成薄层的溶液，空气的流动可使液体加速蒸发，将铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流。此法浓缩速度慢，不适于大量溶表面不断通过空气流。此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。液的浓缩。3.3.冰冻法冰冻法 溶剂在低温下结成冰，盐类及生物大分子不进
22、入冰溶剂在低温下结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。内而留在液相中。4.4.超滤法超滤法5.5.吸收法吸收法 所用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大所用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇、分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇、蔗糖等。蔗糖等。二、干二、干 燥燥 干燥干燥(drying)(drying)是将潮湿的固体、膏状物、浓缩液及是将潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶剂除尽的过程。液体中的水或溶剂除尽的过程。1.1.真空干燥适用于不耐高温，易于氧化的物质干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化的物质干燥
23、。整个装置包括干燥器、冷凝器及真空泵三部分。干整个装置包括干燥器、冷凝器及真空泵三部分。干燥器内常放一些干燥剂，如五氧化二磷、无水氯化燥器内常放一些干燥剂，如五氧化二磷、无水氯化钙等。钙等。2.2.气流干燥气流干燥 三、保三、保 存存 只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保存在干燥剂）密封，保存在0 044冰箱冰箱内即可；内即可；液态储存也有其优点，首先免去繁杂的干燥液态储存也有其优点，首先免去繁杂的干燥过程，生物大分子的活性和结构破坏较少，过程，生物大分子的活性和结构破坏较少，但液态储存时应注意以下几点：但液态储存时应注意以下几点：1.1.样
24、品不能太稀样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装，必须浓缩到一定浓度才能封装储存，样品太稀易使生物大分子变性。储存，样品太稀易使生物大分子变性。2.2.一般一般需加入防腐剂和稳定剂需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、甲苯、苯甲酸、氯仿氯仿、百里酚等。此外，钙、锌、百里酚等。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。3.3.储存温度要低，储存温度要低，大多数在大多数在00左右冰箱保存，有左右冰箱保存，有的则要求更低，应
25、视不同物质而定。的则要求更低，应视不同物质而定。实实 验验 碱性磷酸酶的分离与纯化碱性磷酸酶的分离与纯化 磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法酶的分离和纯化酶的分离和纯化基本原则：提取过程中避免酶变性而失去基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性活性目的：一是把酶制剂从很大体积浓缩到比目的：一是把酶制剂从很大体积浓缩到比较小的体积；二是把酶制剂中大量的杂质较小的体积；二是把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他大分子物质分离出去。蛋白和其他大分子物质分离出去。衡量指标：衡量指标：总活力的的回收；二是比活力总活力的的回收；二是比活力提高的倍数。提高的倍数。表示提纯过程中酶表示提纯过程中酶的损失情况的损失情况表示提纯方
26、法表示提纯方法的有效程度的有效程度一、一、目的目的 1 1掌握碱性磷酸酶分离纯化的实验方法。掌握碱性磷酸酶分离纯化的实验方法。2 2掌握酶活性测定的一般实验方法。掌握酶活性测定的一般实验方法。二二.原理原理：碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP alkaline phosphatase,AKP 或或 ALP ALP）是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水）是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。活剂。本实验采取有机溶剂沉淀法从肝匀浆液中提取本实验采取有机溶剂沉淀法从肝
27、匀浆液中提取分离碱性磷酸酶分离碱性磷酸酶(AKP)(AKP)，根据用，根据用3030乙醇、乙醇、3333丙丙酮提取时，酮提取时，ALPALP溶于溶于3030乙醇乙醇、3333丙酮丙酮，离心后离心后弃沉淀以除去杂质和杂蛋白，弃沉淀以除去杂质和杂蛋白，再将再将ALPALP用用6060乙醇、乙醇、5050丙酮提取时，丙酮提取时，ALPALP不溶不溶于于6060乙醇、乙醇、5050丙酮，丙酮，离心后弃上清除去杂质和杂蛋白，获得较纯的碱性离心后弃上清除去杂质和杂蛋白，获得较纯的碱性磷酸酶。磷酸酶。ALPALP活性测定采用活性测定采用磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法 碱性磷酸酶酶蛋白含量碱性磷酸酶酶蛋白含量测定采
28、用测定采用 Marion M Marion M bradford bradford 法法，利用考马斯亮蓝与蛋白着色，利用考马斯亮蓝与蛋白着色，(考马考马斯亮蓝斯亮蓝G-250G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色色素结合物在素结合物在595nm595nm波长下有最大光吸收。其光吸收波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定测定。)在一定程度范围内蛋白质含量与颜色深浅在一定程度范围内蛋白质
29、含量与颜色深浅成正比，最后根据测得的酶蛋白毫克数及酶活性单成正比，最后根据测得的酶蛋白毫克数及酶活性单位数计算出比活性，鉴定酶的纯化程度。位数计算出比活性，鉴定酶的纯化程度。三、操三、操 作作 （一）分离纯化（一）分离纯化1.1.匀浆匀浆 称取新鲜兔肝称取新鲜兔肝2g2g，剪碎后置于玻璃匀浆器中，剪碎后置于玻璃匀浆器中加入加入0.01mol/L0.01mol/L醋酸钠醋酸钠(低渗破膜作用低渗破膜作用)及及醋酸镁醋酸镁(有保有保护和稳定护和稳定AKPAKP的作用的作用)混合液混合液6ml6ml，在电动匀浆器中匀，在电动匀浆器中匀浆浆3 34min 4min，匀浆液倒入刻度离心管中，记录体积，匀浆
30、液倒入刻度离心管中，记录体积A A液液。取。取0.1ml0.1ml与另一试管中，加与另一试管中，加4.9ml pH 8.8 Tris4.9ml pH 8.8 Tris醋醋酸镁缓冲液稀释酸镁缓冲液稀释,作为作为A A液待测比活性。液待测比活性。2.2.提取提取 加加2ml2ml正丁醇正丁醇(可使部分杂蛋白变性，释出可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白)于于A A液中液中,用玻棒充用玻棒充分搅拌分搅拌2min,2min,室温放置室温放置30min,30min,单层纱布过滤单层纱布过滤,滤液置滤液置于刻度离心管中。于刻度离心管中。3.3.丙酮沉淀丙酮沉淀
31、滤液中加入等体积的冷丙酮滤液中加入等体积的冷丙酮,立刻混匀后离心立刻混匀后离心3,000r/5min3,000r/5min。离心后将上清液倒弃离心后将上清液倒弃,在在沉淀沉淀中加中加入入0.5mol/L0.5mol/L醋酸镁醋酸镁4ml,4ml,用玻棒充分搅拌使其溶解用玻棒充分搅拌使其溶解,同时记录悬液体积同时记录悬液体积(B B液液)。取取0.1ml0.1ml于另一试管中于另一试管中,加入加入4.9ml pH 8.8 Tris4.9ml pH 8.8 Tris醋酸镁缓冲液混匀醋酸镁缓冲液混匀,作为作为B B液液待测比活性待测比活性。4.4.分步分离分步分离 于混悬的悬液中加入冷于混悬的悬液中
32、加入冷95%95%乙醇乙醇 ,使乙醇使乙醇最终体积分数达最终体积分数达3030 ,混匀后立即离心混匀后立即离心2000 2000 r/min,5min,r/min,5min,离心后将上清液倒入另一离心离心后将上清液倒入另一离心管中管中,弃沉淀弃沉淀 ；在上清液中加入冷在上清液中加入冷95%95%乙醇乙醇 ,使乙醇最终体积分数使乙醇最终体积分数达到达到60%60%,混匀后离心混匀后离心3000r/min,5min,3000r/min,5min,将上清液倒将上清液倒弃弃,于于沉淀沉淀中加入中加入0.01mol/L 0.01mol/L 醋酸镁及醋酸钠混合液醋酸镁及醋酸钠混合液4ml,4ml,充分搅拌
33、充分搅拌 ,使其完全混悬使其完全混悬。5.5.重复上述操作重复上述操作 在悬液中加入冷在悬液中加入冷95%95%乙醇乙醇 ,使乙醇最终体积分使乙醇最终体积分数达数达3030 ,混匀后立即离心混匀后立即离心2000 r/min,5min,2000 r/min,5min,离离心后将上清液倒入另一离心管中心后将上清液倒入另一离心管中 ,弃沉淀弃沉淀 ；在上；在上清液中加入冷清液中加入冷95%95%乙醇乙醇 ,使乙醇最终体积分数达到使乙醇最终体积分数达到60%,60%,混匀后离心混匀后离心3000r/min,5min,3000r/min,5min,将上清液倒弃将上清液倒弃,于于沉淀沉淀中加入中加入0.
34、5mol/L 0.5mol/L 醋酸镁醋酸镁3ml3ml充分混悬充分混悬,并记并记录体积录体积(C C液液),),取取0.1ml0.1ml加入另一试管中加入另一试管中,加加pH 8.8 pH 8.8 TrisTris醋酸镁缓冲液醋酸镁缓冲液0.9ml0.9ml混匀混匀,作为作为C C液液待测比活性待测比活性。6.6.其余悬液中加入丙酮其余悬液中加入丙酮,使丙酮终体积分数为使丙酮终体积分数为33%,33%,混于后离心混于后离心2000 r/min,5min,2000 r/min,5min,弃沉淀弃沉淀,于于上清上清液液中加入冷丙酮中加入冷丙酮 ,使丙酮终体积分数达到使丙酮终体积分数达到50%50
35、%。混匀混匀后离心后离心3000r/min,15min,3000r/min,15min,离心后弃上清液离心后弃上清液,于于沉沉淀淀中加入中加入pH 8.8 TrispH 8.8 Tris醋酸镁缓冲液醋酸镁缓冲液5ml,5ml,混匀后离混匀后离心心3000r/min,5min,3000r/min,5min,上清液即为纯化酶液上清液即为纯化酶液 ,作为作为D D液液用于比活性用于比活性.(二二)碱性磷酸酶的活性测定碱性磷酸酶的活性测定(磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法)1.取试管取试管6只编号只编号,按下表操作按下表操作管号管号 A B C D 标准标准 空白空白各阶段稀释酶液各阶段稀释酶液/ml 0.1
36、 0.1 0.1 0.1 酶标准液酶标准液(0.1mg/ml)/ml 0.1pH 8.8 Tris醋酸镁醋酸镁 缓冲液缓冲液/ml 0.1预热至预热至37复合底物复合底物液液/ml 3.0 3.0 3.0 3,0 3.0 3.0 立即混匀立即混匀 3737水浴中保温水浴中保温15min,15min,保温结束后保温结束后,各管加入各管加入0.5%0.5%铁氰化钾铁氰化钾2ml2ml终止反应终止反应。静置静置1515分钟分钟,显色后显色后510nm510nm波长比色波长比色。2.2.酶活性单位计算酶活性单位计算:37 37保温保温15min,15min,产生产生1mg1mg酚酚,为为1 1个酶活性
37、单位个酶活性单位.故每毫升酶液中的酶活性单位为故每毫升酶液中的酶活性单位为:（三）碱性磷酸酶酶蛋白含量测定三）碱性磷酸酶酶蛋白含量测定1.取试管取试管6只编号只编号,按下表操作按下表操作:碱性磷酸酶酶蛋白含量测定碱性磷酸酶酶蛋白含量测定 试试 剂剂 A液液 B液液 C液液 D液液 对照对照 标准标准 阶段酶液阶段酶液/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 -pH8.8Tris-醋醋 酸镁缓冲液酸镁缓冲液 0.1 蛋白质标准液蛋白质标准液1mg/ml 0.1 显色液显色液/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 各管充分混匀各管充分混匀,2min以后在波长以后在波长595nm处比色
38、处比色.2.蛋白含量计算蛋白含量计算:公式公式:A测测 1 X 标准管蛋白含量标准管蛋白含量 X X 稀释倍数蛋白含量稀释倍数蛋白含量 A标标 0.1(三三)比活性计算比活性计算酶的比活力酶的比活力 代表酶的纯度，比活力代表酶的纯度，比活力用每用每mgmg蛋白质所含的酶活力蛋白质所含的酶活力单位数表示，对同一酶来说，比活力愈大，表示酶的单位数表示，对同一酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。用纯度愈高。用U/mgU/mg蛋白、蛋白、Kat/mgKat/mg蛋白表示。蛋白表示。比活力比活力=每毫升样品的酶活性单位每毫升样品的酶活性单位/每毫升样品蛋白毫克数每毫升样品蛋白毫克数 总活力总活力U U
39、=酶活性单位酶活性单位总体积总体积 酶的纯化倍数：酶的纯化倍数：每次比活力每次比活力 第一次比活力第一次比活力酶的回收率：酶的回收率：100%第一步总活力每一步总活力(四）将实验结果填入表格，计算出各阶段四）将实验结果填入表格，计算出各阶段ALP 的纯化倍数及得率的纯化倍数及得率分离阶段分离阶段 蛋白质（蛋白质（mg/ml）酶活性（酶活性（Uml）比活性（比活性（Uml）纯化倍数纯化倍数 得率得率 A 1 100%B C D 注注 意意 1 1各步加入有机溶剂量要准确。各步加入有机溶剂量要准确。2 2有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低低温温下进行。溶剂应预冷到下进行。溶剂应预冷到l0l01515左右。加入时左右。加入时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。性。3 3加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。避免局部浓度过高而引起升温和变性。4 4加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。即离心。5 5采用短时间的离心以析出沉淀，而且最好采用短时间的离心以析出沉淀，而且最好立即将沉淀溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的立即将沉淀溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。丧失。
