1、常规组织病理技术常规组织病理技术常规石蜡切片制作程序组织固定 取材 固定 脱水 透明 浸腊 包埋 切片 染色 封片 观察 1.组织固定的意义防止组织细胞自溶和腐败保持组织细胞正常生活时的形态结构沉淀和凝固各种物质,硬化组织便于制片和染色后的观察2.固定的注意事项一般应在离体30分钟内固定,越及时越好,并将组织上的血液,分泌物冲洗干净固定剂的量一般不少于组织块总体积的4倍以上固定的时间应视组织的不同和大小决定,一般小组织4-6小时,大组织18-24小时或更长有特殊要求的须用特殊的固定剂不同组织在固定时应注意特殊的处理方法3.常用的固定剂甲醛(10%福尔马林)甲醛 100ml 水 900ml中性甲
2、醛 甲醛 100 ml Na2HPO4 6.5g NaH2PO4 H2O 4g 蒸馏水至 900 ml 乙醇-甲醛(AF液)甲醛 100 ml 95%乙醇 850 ml 冰醋酸 50 ml 其他 4%多聚甲醛:多聚甲醛4g,加蒸馏水50ml,加热至60度,搅拌加入1mol/L NaoH数滴,直至溶液变清,冷却后用0.1mol/L PBS(PH7.4)加至100ml.Carnoy氏液(糖原,DNA,RNA,尼氏小体固定用,小组织20-40分钟,不超过3-4小时)冰醋酸 10 ml 氯仿 30 ml 无水乙醇 60 ml 1.外科的活体组织取材 临床手术取材(大标本)注意肿瘤的部位 形状 大小 颜
3、色及周边组织的关系,有无完整包膜,测量体积,包括长度 宽度 高度.手术大标本必须进行预取材 预固定.活体小组织(小标本)组织标本体积小,在取材时应特别小心,用伊红让标本着色,并用插镜纸包裹,以防丢失,应标明粒数.多瓶组织应将附号标清楚.2.动物标本取材:动物致死法 麻醉法,空气栓塞法,断头法,击头法,股动脉放血法等,要求动作迅速,及时解剖,取材与固定 动物取材注意事项:准备好锋利的刀剪,固定液,取材应新鲜,最好是心脏还在跳动时取材,并立即投入固定液.组织块厚度不超过3mm(应将组织上的血液,渗物,粘液粪便等用生理盐水冲洗干净,选好组织块的切面,切除不需要的部分,再固定),应尽可能维持组织原形,
4、对神经肌肉皮肤组织,可将其两端固定在木板或硬纸板上,然后再固定.脱水的目的:组织最终将包埋在石蜡中,才能进行切片,为达到这一目的,首先须将组织内的水分置换出来,以利于透明剂渗入,这一过程为脱水.(一般情况下,应将大小标本分别脱水.标本脱水从低浓度开始,一般人标本从70%或75%乙醇,动物标本从50%乙醇开始)脱水方法及注意事项:常用试剂为乙醇,某些情况下用丙酮.快速石蜡切片常用丙酮为脱水剂,尸体解剖标本一般在无水乙醇后加丙酮 因为脱水剂的新旧影响脱水时间,必须灵活掌握,根据本实验室情况,定时更换脱水剂.透明的目的:因为大多数脱水剂不能和石蜡相混合,组织内的水份脱干净后,必须通过透明剂的作用,才
5、能便于浸蜡包埋.常用透明剂种类及注意事项:二甲苯 甲苯 松节油 苯 透明要注意的关键是时间,透明时间不够,石蜡不能完全进入组织,影响到包埋 切片.但是如果透明过度,组织发硬发脆影响切片质量.特别是肝脾等组织.目的和注意事项 组织经过透明后要浸入石蜡(火棉胶 碳蜡 明胶)内,目的是去除组织中的透明剂(二甲苯)而代之以石蜡,并渗入组织内部,把软组织变为有适当的硬度,以利切片.一般浸蜡须经过2到3次,石蜡的溶点为56-58度左右,目前常用的脱水机上是两个蜡缸.浸蜡时要注意掌握好石蜡的温度和浸蜡的时间 注意事项:控制好包埋用石蜡的温度和组织块的温度,注意组织块包埋的方向,切面朝下,组织应尽量平整.蜡块
6、冷却后将组织外围的石蜡进行修整,以便利于连续切片.1.准备工作:清洗干净的玻片 恒温烤片箱 毛笔 眼科弯镊 染片架 锋利的切片刀 制备好的蛋白甘油 石蜡块预先冷却 2.注意事项:熟练掌握切片机的性能 展片箱的水温控制在45度左右 固定好蜡块和切片刀 切片附贴好后,放入65-70度烤箱中烤片 20-30分钟 目的:将组织切片浸入染色剂内,使组织或细胞等成分染上不同的颜色 产生不同的折射,以便在光学显微镜下观察.方法:苏木素-伊红染色称常规染色,又称HE染色.其他染色方法称特殊染色(特染).步骤:1.将切好的组织切片经烤片后入二甲苯脱蜡各约5分钟左右,然后入无水乙醇洗去二甲苯,约1-2分钟,依次入
7、95%乙醇,80%乙醇 70%乙醇至自来水,蒸馏水.2.将切片浸入配置好的苏木素液内5-10分钟左右,自来水洗1分钟,75%盐酸乙醇分化约30秒,返蓝1-2分钟 自来水洗5-10分钟 3.95%乙醇1分钟后入酸化的伊红10秒至1分钟,入95%乙醇各1分钟 无水乙醇各1分钟,电吹风吹干.染色结果:胞核呈蓝色,胞浆淡红色,结缔组织鲜红色,红细胞橙红色.染色液配置:苏木素是世界上唯一较好的常规细胞核染色剂,配置方法很多,各有特点,常用的有:Harris苏木素 Ehrlich苏木素 Mayer苏木素等.在日常工作中,我教研室用Gill改良苏木素:苏木素2g溶于无水乙醇250 ml中,再将硫酸铝17.6
8、g溶于蒸馏水750 ml中,两液溶解后将其混匀,加入碘酸钠0.2g,最后加入冰醋酸20 ml 特点:配置简单,色泽鲜艳,染液耐用.伊红Y染料是胞浆较理想的染色剂.介绍一种沉淀酸化伊红Y乙醇液:伊红Y20g与蒸馏水500 ml充分溶解后加浓盐酸10 ml搅拌放置过夜析出沉淀,过滤后弃去滤液,蒸馏水洗涤沉淀,反复三次,将沉淀物连同滤纸一起放到恒温箱中干燥,用95%乙醇1000 ml配成饱和液备用.用时取饱和液一份加95%乙醇1-2份即成工作液染色注意事项:1.切片脱蜡必须干净彻底2.按操作步骤进行操作应严格掌握盐酸分化的时间 分化后的切片应立即入自来水洗3.注意染色液的情况,掌握染色时间4.按配方配置染色液.染色液配置的好坏是染色是否 成功的关键之一 国产中性树胶 封片,注意树胶量适中,掌握封片手法,防止气泡.
