1、第第45讲讲 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术 一、一、DNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定 1DNA的理化性质 (1)DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些成分如蛋白质等却溶于酒精，利用这一原理，可将DNA与蛋白质等进一步地分离。(2)DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而DNA在80以上时才会变性，洗涤剂能够溶解细胞膜，但对DNA没有影响。(3)
2、DNA的热变性 DNA分子在细胞内复制或转录时，在解旋酶的作用下使氢键断裂，而在体外，DNA在80l00的温度范围内变性，即双螺旋解开，成为单链；当温度慢慢降低后，两条彼此分离的单链又会重新结合形成双链。但高温能使DNA聚合酶变性失活，后来发现了耐高温的TaqDNA聚合酶，解决了上述矛盾。2基本原理 (1)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在014 molL的NaCl溶液中的溶解度最低，如下表所示 由上表可以看出，在NaCl溶液物质的量浓度为2 mo1L时，DNA溶解，部分蛋白质发生盐析而生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质；在NaCl溶液物质的量浓度为014 m01L时，DNA析出
3、，过滤可除去溶解的部分蛋白质。(2)DNA不溶于酒精溶液加入体积分数为95的冷却酒精溶液可使DNA析出，除去溶于酒精的蛋白质。(3)DNA不被蛋白酶所水解嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，加入嫩肉粉可使蛋白质水解而DNA不被水解。(4)DNA可被二苯胺染成蓝色向含DNA的试管中加入二苯胺并沸水浴，溶液呈现蓝色可确认DNA。3方法步骤 (1)实验材料的选择 首先选择含有DNA的生物材料。选用DNA含量相对较高的生物组织，成功率较大。(2)破碎细胞获取含DNA的滤液 动物细胞如鸡血细胞在血细胞液中加入蒸馏水，用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。植物细胞用洗涤剂溶解细胞膜，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集滤液。(3
4、)去除滤液中的杂质 方案利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质(用2 molI。NaCl溶液过滤除去不溶的杂质，用014 molI。NaCl溶液析出DNA，过滤，除去溶液中的杂质，再用2 molL NaCl溶液溶解DNA)。方案在滤液中加入嫩肉粉，利用其蛋白酶水解蛋白质。方案将滤液放入6075恒温水浴箱中保温1015 rain，使蛋白质变性。(4)DNA的析出与鉴定 析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液等体积的冷却酒精溶液(体积分数为95)静置，溶液中会出现白色丝状物(此即粗提取的DNA)，用玻璃棒沿一个方向搅拌卷起丝状物。鉴定【例1】关于“DNA的
5、粗提取与鉴定”的实验装置如图(1)实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血。主要原因是鸡血细胞液中 含量较高。(2)在图A所示的实验步骤中加蒸馏水20 mL的目的是 通过图B所示的步骤取得滤液，再在滤液中加入2mol/l NaCl溶液的目的是 图C所示实验中加蒸馏水的目的是 。(3)为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可滴加 溶液，结果丝状物被染成绿色。答案答案(1)DNA(2)使血细胞吸水涨破，放出DNA使滤液中的DNA溶于盐溶液 使DNA析出(3)甲基绿二、二、PCR技术技术 1生物体内DNA复制与PCR反应的区别 体内DNA复制 PCR反应，时期细胞有丝分裂间期或减数第一次分裂间期及无丝
6、分裂、二分裂过程 体外随时进行 场所 细胞内 微量离心管内解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72特点边解旋边复制，半保留复制 体外迅速扩增DNA聚合酶需DNA聚合酶需耐高温的Taq DNA聚合酶循环次数 受生物体自身控制30多次 相同点 需提供DNA复制的模板 四种脱氧核苷酸作原料 子链延伸的方向都是从5端到3端 2PCR技术扩增DNA片段 (1)原理：DNA复制。(2】需要条件：模板DNA、RNA引
7、物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)、离子。(3)方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合、在DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。(4)特点：指数形式扩增。(5)过程：变性、复性、延伸、重复。步骤名称 需要温度 过程 第一步变性9095将反应体系(包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等)加热至9095，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板第二步复性5560将反应体系降温至5560，使两种引物分别与模板DNA链3端的互补序列互补配对，这个过程称为复性第三步延伸合成70
8、75将反应体系升温至7075，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3 7一OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。(6)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2”的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。【例2】2008年5月20日，民政部制订汶川大地震遇难人员遗体处理意见时指出，无法确认遇难者身份的，由公安部门提取可供DNA检验的检材以便后身份辨认。事后的遗体辨认可借助于DNA杂交技术，即从遗体细胞与死者家属提供的死者生前生活用品中分别提取DNA，然后借助DNA杂交
9、技术对遗体进行确认。请回答下列问题：(1)为了确保辨认的准确性，需要克隆出较多的DNA样品，这需要借助PCR技术。使用PCR技术的具体实验操作顺 序是：按配方准备好各组分 离心使反应液集中在离心管底部一设计好PCR仪的循环程序一进行PCR反应。在该操作过程中应特别注意的问题是 (2)如表所示为分别从死者遗体和死者生前的生活用品中提取的三条相同染色体上的同一区段DNA单链的碱基序列，根据碱基互补配对情况进行判断，A、B、C三组DNA中不是同一人的是 (3)为什么从死者体细胞与死者家属提供的其生前生活用品中分别提取的DNA可以完全互补配对?A组 B组 C组遗体中的DNA碱基序列ACTGACGGTT
10、 GGCTTATCGAGCAATCGTGC家属提供的DNA碱基序列TGACTGCCAA CCGAATAGCACGGTAAGACG答案：答案：(1)用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分PCR实验使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌(2)B、C(3)人体所有体细胞均由一个受精卵经有丝分裂产生，其细胞核中均含有相同的遗传物质三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离 1实验原理 (1)蛋白质各种特性(如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等)的差异，可以用来分离不同种类的蛋白质。(2)有效方法凝胶色谱法：根据相对分子质量
11、的大小分离蛋白质。凝胶是由多糖类化合物构成的微小的多孔球体，内部有许多贯穿的通道。相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。(3)电泳：蛋白质等生物大分子都具有可解离的基团，在一定的pH下会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。故电泳可利用待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子
12、的分离。2实验操作程序(2)粗分离透析 将盛有1 mL血红蛋白溶液的透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mm01L的磷酸缓冲液中透析12 h，去除样品中的小分子杂质。(3)纯化采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化(4)纯度鉴定：一般用SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，来测定蛋白质的相对分子质量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。【例3】红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：(1)以上所述的过程即是样品处理，它包括 、分离血红蛋白溶液。(2)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是 。透析的原理是 。(3)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是 。血红蛋白有什么特点?。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义?答案：答案：(1)红细胞的洗涤血红蛋白的释放(2)去除样品中相对分子质量较小的杂质 透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内(3)通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂蛋白除去 血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作
