1、免疫学与口腔疾病口腔免疫研究方法口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病n免疫荧光技术n酶联免疫吸附试验n蛋白质印迹n流式细胞术免疫学研究的主要方法2口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病一、免疫荧光1.免疫荧光概述2.免疫荧光基本原理3.免疫荧光基本操作4.免疫荧光技术的相关应用5.口腔应用实例3口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病 1.概述 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。n该技术的主要优缺点n主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。n主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性
2、不足，技术程序也还比较复杂。4口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病2.基本原理直接免疫荧光法：直接法是将荧光素标记在抗体上，直接测定相应抗原。标记有荧光素的抗体与相应的抗原反应，在紫外光的照射下，用显微镜观察荧光现象。优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点：只能检测一种抗原，灵敏度不高。5口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病 间接免疫荧光法：间接法与间接ELISA相似，引入标记二抗，可以检测抗原，也可以检测抗体。n优点：一抗可以结合多个标记二抗，固灵敏度比直接法高。n缺点：比直接法易出现非特异荧光。6口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病免疫荧光原理示意图免疫荧光原理示意图7口腔免疫研究方法免疫
3、学与口腔疾病3.免疫荧光实验过程 细胞爬片（多聚赖氨酸处理，生长密度细胞爬片（多聚赖氨酸处理，生长密度70-80%70-80%）细胞固定（合适的固定液，如细胞固定（合适的固定液，如4%4%甲醛溶液等）甲醛溶液等）细胞膜穿透（细胞膜穿透（Triton X-100 Triton X-100 等）等）封闭（封闭（3%BSA-PBS3%BSA-PBS等）等）一抗孵育一抗孵育 荧光二抗孵育荧光二抗孵育 胞浆胞浆/核衬染（鬼笔环肽核衬染（鬼笔环肽/DAPI/PI/DAPI/PI）封片荧光显微镜拍照封片荧光显微镜拍照 荧光抗体孵育8口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病4.免疫荧光技术的相关应用抗核抗体抗核抗体(
4、均质型均质型)抗核抗体抗核抗体(斑点型斑点型)抗核抗体抗核抗体(核膜型核膜型)自身抗体检测第八节 口腔免疫学研究的主要方法9口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病 病原体检测细菌（藤黄微球菌细菌（藤黄微球菌 ）寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）第八节 口腔免疫学研究的主要方法10口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病 免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）肿瘤（人肝癌细胞）第八节 口腔免疫学研究的主要方法11口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病5.口腔应用举例天疱疮患者病损部位自身抗体的检测1.取天疱疮患者静脉血2ml，离心分离血清，-20保存。2.取正常皮肤做冰冻切片，加入FITC标记的抗人I
5、g-G、IgA、IgM、C3作间接免疫荧光染色，出现亮绿色荧光为阳性，以显示荧光的血清最大稀释度作为抗体的滴度。12口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病直接免疫荧光IgG 上皮棘层呈翠绿色渔网状荧光13口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病细胞免疫荧光技术组织免疫荧光技术直接法间接法小结14口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病二、酶联免疫吸附试验1.ELISA的原理和基本特点2.ELISA的类型3.ELISA基本操作步骤4.数据处理5.结果判断 6.口腔应用举例15口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病1.ELISA的原理ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA），其免疫学原理:抗原或抗体的固相化及
6、抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。其特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值16口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病2.基本类型 抗体测定法 间接法检测特异性抗体 抗原测定法 直接竞争法检测可溶性抗原 双抗体夹心法检测可溶性抗原 （改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法17口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病间接法检测特异性抗体与待测抗体孵育与酶标抗体孵育加入底物包被已知抗原18口腔免疫
7、研究方法免疫学与口腔疾病优点优点:n只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法n操作简单迅捷缺点缺点：n可重复性差n通常用于抗体效价的检测和某些疾病的早期诊断19口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病双抗体夹心法检测可溶性抗原 双抗夹心法改良双抗夹心法20口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病优点优点：n待测抗原需要2个抗原决定簇，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量5000D以上；n由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良双抗夹心法；只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物就可以建立此法；n重复性较好；缺点：缺点：操作复杂，费时费力21口腔
8、免疫研究方法免疫学与口腔疾病3.ELISA 基本操作步骤p样品的保存p试剂的准备p固相载体p包被p加样p孵育(温育）p洗涤p显色和比色注：每种注：每种ELISA试剂盒均有具体步骤说明试剂盒均有具体步骤说明22口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病4.ELISA 数据处理n根据standard的浓度和对应的OD值计算出线性方程n将所测定样品的OD值代入方程计算出相应的样品的浓度23口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病5.结果判断定性实验:显色反应后，如液体颜色变成蓝色则为阳性；仍为无色液体，则待测样品为阴性。24口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病定量实验1.标准品和待测样品的OD值减去空白孔的OD值2.绘制
9、标准曲线，计算出待测样品浓度 根据绘制的标准曲线以及待测样品的OD值可计算出待测样品浓度。25口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病6.口腔应用实例龈沟液中细胞因子的检测1.龈沟液采集：去除待检牙牙面牙石，隔湿，吹干牙龈并擦干牙面，用2 mm10mm Whatman 3M滤纸条两条，插入取样部位的牙周袋内，30s后取出(若血液和唾液污染，则弃置不用)，3min后在同一位点再次取样，将两条滤纸条作为一个标本置于同一Eppendorf（EP）管中，用龈沟液测量仪测量龈沟液量，在EP管中加入200l PBS-T，置于-70的冰箱内保存。26口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病2.ELISA方法检测龈沟液中细胞
10、因子（如IL-8/IL-4/TNF-等）的浓度：将标本于冰箱内取出，室温解冻，4离心后取上清备用。利用检测试剂盒，ELISA检测龈沟液中细胞因子的浓度。27口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病用途：血清、血浆、细胞上清液、组织匀浆及相关液体样本中免疫炎性因子、抗原和抗体的检测。小结28口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病三、Western Blot1.简介2.原理3.操作流程4.应用5.口腔应用举例29口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病n印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。n1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜
11、）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。n而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法1.简介30口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病2.Western Blot基本原理蛋白质混合样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后分离为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白）。将PAGE胶上的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulose
12、filter membrane，NC膜)，此过程称为印迹，以利于随后检测反应的进行。然后，将NC膜与抗体一起孵育，使抗体（一抗）与待检测的抗原决定簇结合（电泳分离的特异性蛋白条带），再与荧光素、酶或核素标记的二抗反应，即可检测出样品中的待测抗原并能对其定量。31口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病Western blot原理第八节 口腔免疫学研究的主要方法32口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病Anode-内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触Cathode+带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左
13、右即可停止电泳小分子量蛋白跑的比较快小分子量蛋白跑的比较快.蛋白根据分子量大小分开蛋白根据分子量大小分开蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动标本加入到上样孔中33口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病34口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病3.Western Blot操作流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳l 转膜l 封闭l 一抗杂交l 二抗杂交l 底物显色35口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病常用仪器36口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病4.相关应用基础研究：n目的蛋白的表达特性分析n目的蛋白与其它蛋白的相互作用n目的蛋白的组织定位n目的蛋
14、白的表达量分析 37口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病临床：n在艾滋病病毒感染中，根据出现显色线条的位置可以判断有无针对病毒的特异性抗体，以此法作为确诊试验。n使用印迹抗原来测定各种病人的抗体谱已经直接作为临床免疫检验的手段，被称之为确认试验的“金标准”。38口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病5.口腔应用实例基质金属蛋白酶-28（MMP-28）在口腔扁平苔藓中的表达。1.取口腔扁平苔藓患者口腔黏膜，所取新鲜标本立即置于液氮中保存。2.将组织迅速加入预冷的裂解液中，充分剪碎后，超声波细胞粉碎机进一步震碎细胞，置于冰上裂解 30 min，4离心取上清，置于-20保存。3.采用改良 Lowry法测定蛋白
15、浓度。39口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病4.取蛋白分别经10%SDS、5%PAGE凝胶电泳后，抗原转至NC膜。5.放入 5%脱脂奶粉中封闭，PBS洗膜。6.加入一抗（鼠抗人MMP-28多克隆抗体）4过夜，洗涤后加入二抗（兔抗鼠I gG）37下孵育1h，DAB显色，PBST漂洗，密度扫描并拍照。7.对 MMP-28表达与 OLP临床参数进行相关性分析。40口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病n为什么要作蛋白质印迹实验？q研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中q蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。小结41口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾
16、病四、流式细胞术1.流式细胞术概述2.流式细胞仪主要构造和基本工作原理3.流式细胞仪分析数据常见图形4.流式细胞术常规检测时的样本制备5.流式细胞术的应用6.口腔应用举例42口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病1.流式细胞术概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是利用流式流式细胞仪细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒通过荧光标记进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，目前已在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科的科研和临床广泛应用。流式细胞仪（Flow Cytometer，FCM)是集合光电子物理，光电测量技术，计算机技术，细胞荧光化学，抗体技术等现代高科技技术为一体的
17、细胞测量和分析仪器。第八节 口腔免疫学研究的主要方法43口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。流式细胞术的特点细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定性定量44口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。2.流式细胞仪基本工作原理
18、45口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病流式细胞仪台式机FACSCalibur 双激光 488nm 635nm 四荧光参数 分选、浓缩系统46口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病大型机FACSVantage SE 科研型 八荧光参数 高速分选 多路分选47口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病3.流式细胞仪主要构造 （1）液流系统 （2）光学系统 （3）数据处理系统48口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病n由样本和鞘液组成由样本和鞘液组成n待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标记的荧光染料标记的单抗对其染色单抗对其染色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管从样品管进入流动室形成样本流进入流
19、动室形成样本流n鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。（1）液流系统49口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病Injector Tip荧光信号荧光信号聚焦的激光光束聚焦的激光光束鞘液鞘液流动室50口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管51口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病n激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器n分色反光镜：反射长分色
20、反光镜：反射长/短波长，通过短短波长，通过短/长波长长波长n光束成形器：两十字交叉放置的透镜光束成形器：两十字交叉放置的透镜n透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光n滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通n光电倍增管：光电倍增管：FS,SSFS,SS（散射光），（散射光），FL1,FL1,FL2,FL3,FL4FL2,FL3,FL4（荧光）（荧光）（2）光学系统52口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病免疫学与口腔疾病侧向角散射（SSC,Side Scatter）前向角散射光（FSC,Forward Scatter）激光束照射细胞时，光以相对轴较小激光束照射细胞时，光以相
21、对轴较小角度角度(0.5(0.51010)向前方散射的讯号用向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比强弱与细胞体积大小成正比，细胞相对大小及其表面积。激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性，细胞粒度及细胞内相对复杂性。54口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病测得的测得的FSFS与与SSSS信号通过信号通过计算机处理，可得到计算机处理，可得到FS-FS-SSSS图，由此可仅用散射图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基此为血细胞分类的基本
22、原理，但不能分析表本原理，但不能分析表面分子。面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群 55口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病主要由计算机及其软件组成主要由计算机及其软件组成（3）数据处理系统56口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病4.流式细胞仪分析数据常见图形直方图（Histogram Plot）适用于：适用于：单参数分析单参数分析仅需要观察某个荧光仅需要观察某个荧光强度的变化强度的变化57口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病二维点阵图（Dot Plot）适用于双参数分析人外周全血细胞双参数散点人外周全血细胞双参数散点图图58口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病
23、5.常规检测时的样品制备直接免疫荧光标记的样品制备间接免疫荧光标记的样品制备DNA荧光染色的样品制备细胞凋亡检测样品的制备微量全血法免疫荧光标记的样品制备59口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病直接免疫荧光标记的样品制备1.取1106个细胞/100l单细胞悬液。2.一份加入相应量的FITC或PE标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为同型对照样品。3.室温下避光反应1530min。4.加入500l PBS重悬成单细胞悬液上机检测，阳性者表示有相应抗原存在。60口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病间接免疫荧光标记的样品制备 1.取1106个细胞/100l，加入一抗混匀，置室温下避光反
24、应30min。2.PBS洗涤细胞，离心沉淀弃掉上清液。3.用100l PBS重悬细胞，加入FITC或PE标记荧光二抗混匀，室温下反应30min。4.PBS再洗涤细胞，加入500l PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。61口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病DNA荧光染色的样品制备1.将固定过的细胞离心弃上清液，用PBS洗涤。2.用PBS调整细胞浓度，每份为1106个细胞/100l。3.加入1000l DNA 荧光染料，室温下避光染色15min后上机检测。62口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病细胞凋亡检测样品的制备1.将10的结合缓冲液用蒸馏水稀释成为1，冰育。2.悬浮细胞在低温环境中，用PBS洗涤细胞
25、。3.离心后弃上清，加入预冷的结合缓冲液重悬细胞（细胞浓度为105106ml）。4.加入5l Annexin V-FITC和5l PI于细胞悬浮液中，轻轻混匀。5.将试管置于冰上，避光孵育10分钟后上机检测。63口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病微量全血法免疫荧光标记的样品制备微量全血直接荧光染色法1.取肝素或EDTA抗凝全血（100l/份），置1275mm专用塑料试管中。2.加入20l特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作同型对照，室温下避光染色15min。3.置 Q-PREP 仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞，静置5min，上机检测。64口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病微量全血间接荧
26、光染色法 1.取肝素或EDTA抗凝全血（100l/份），置1275mm专用塑料试管中。2.加入50l特异的单克隆抗体（一抗），室温下孵育30min。3.置Q-PREP仪上溶解红细胞，稳定和固定白细胞。4.离心后弃上清液，PBS洗涤细胞。5.加入50l荧光（FITC或PE）标记的第二抗体，室温下避光染色30min，上机检测。65口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病6.相关应用分子生物学细胞生物学免疫学肿瘤学66口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病7.口腔举例牙髓干细胞的初步鉴定1.收集无牙体牙髓疾病的恒牙，将拔除后的恒牙立即放人预冷含高倍双抗-MEM培养基中保存，4h内原代取材。2.体外原代培养的牙髓干
27、细胞放入37、5%CO2培养箱中培养3d后弃去未贴壁细胞，PBS清洗后换液。67口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病3.当第二代牙髓干细胞生长融合成单层后，0.25%胰蛋白酶消化，1：3传代。将扩增到一定数量的第二代细胞消化，PBS混悬后计数，调整细胞浓度（11067/ml），离心后弃去上清。4.PBS混匀后加入FITC-CD34和PE-STRO-1（stromal cell antigen，基质细胞抗原）混匀，冰盒内避光孵育1h后上机分选。68口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA,RNADNA,RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子,PH,PH值值,膜电位膜电位酶活性酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性小结69口腔免疫研究方法免疫学与口腔疾病思考题：影响免疫荧光技术非特异染色的主要因素及消除方法？如何避免Western blot非特异性条带的出现？70口腔免疫研究方法
