1、2022-10-27分子生物学基本技术PCR分子生物学基本技术分子生物学基本技术PCR分子生物学基本技术PCRPCR(Polymerase Chain Reaction)n一、历史及其发展一、历史及其发展n二、二、PCR的基本原理的基本原理n三、三、Primer design引物常规设计原则引物常规设计原则n四、四、PCR反应体系反应体系n五、五、PCR反应条件优化（反应条件优化（PCR optimization)n六、六、PCR反应特点反应特点n七、七、PCR产物的分析产物的分析n八、八、Molecular markern九、九、PCR技术的应用技术的应用分子生物学基本技术PCR 分子生物学
2、技术体系分子生物学技术体系n 基本技术基本技术n基因及产物基因及产物 分子检测技术分子检测技术n基因及产物基因及产物 获取技术获取技术n基因基因 功能研究技术功能研究技术分子生物学基本技术PCR 基本技术基本技术 1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 2.SDS-PAGE 电泳电泳 3.PCR技术技术 4.细菌转化细菌转化分子生物学基本技术PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应-PCR(Polymerase Chain Reaction)一、历史及其发展：一、历史及其发展：n1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。n
3、但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了n1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）n基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制n最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错n耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪分子生物学基本技术PCR1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但
4、每循环一次，仍需加入新酶。n1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。n1993年：年：Mullis与开创了与开创了“寡核苷酸基因定点诱寡核苷酸基因定点诱变变”加拿大籍英国科学家加拿大籍英国科学家Michael Smith共获诺共获诺贝尔化学奖贝尔化学奖分子生物学基本技术PCR Kary Mullis&Michael Smith 穆利斯（穆利斯（Kary Mullis）美国化学家1944史密斯（史密斯（Michael Smith）加拿大化学家1932分子生物学基本技术PCR 二、PCR的基本原理 PCR的基本原理：
5、的基本原理：变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制 PCR三步曲三步曲 Three steps：Denaturation 变性变性 9097 Primer annealing 退火退火 4555 Polymerization 延伸延伸 72分子生物学基本技术PCR原原 理理 类似于类似于DNA的体内复制。首先的体内复制。首先待扩增待扩增DNA 模板加热模板加热变性变性解链，解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发这一温度可使引物与它的靶序列发生生退火退火，再将温度升高使退火引物，再将温度升高使退火引物在在DNA聚合酶作用下得以聚
6、合酶作用下得以延伸延伸。这种热变性这种热变性-复性复性-延伸的过程就是一延伸的过程就是一个个PCR循环，循环，PCR就是在合适条件就是在合适条件下的这种循环的不断重复。下的这种循环的不断重复。分子生物学基本技术PCR回忆：回忆：DNA 的复制的复制分子生物学基本技术PCRDNA解旋解链合成引物子链延长ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶 解链酶回忆：回忆：DNA 的复制的复制分子生物学基本技术PCRRNA引物RNA引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGA
7、CGCTGGATCG35引物酶引物酶DNA解旋解链合成引物子链延长回忆：回忆：DNA 的复制的复制分子生物学基本技术PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3DNA聚合酶DNA聚合酶回忆：回忆：DNA 的复制的复制分子生物学基本技术PCRPCR简要过程图解简要过程图解分子生物学基本技术PCRPCR详细过程图解详细过程图解分子生物学基本技术PCR1234522557294时间（min）温度（）适温延伸
8、3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍分子生物学基本技术PCR模板DNA951分子生物学基本技术PCR50引物1引物2DNA引物2分子生物学基本技术PCR引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶3分子生物学基本技术PCR第1轮结束95第2轮开始4分子生物学基本技术PCR72TaqTaqTaqTaq5分子生物学基本技术PCRPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增分子生物学基本技术PCR三、三、Pr
9、imer design引物常规设计原则引物常规设计原则1.长度：长度：15-37 nt,一般一般20nt左右左右;(仅仅binding,不含接头不含接头)2.G+C 含量含量4060，而且四种碱基的分布最好随机。，而且四种碱基的分布最好随机。3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；4.引物自身不能互补（引物自身不能互补（3个）个）5.引物之间不能互补（引物之间不能互补（5 个）个）6.引物端不能错配引物端不能错配,不能修饰，尽量不用不能修饰，尽量不用T,不能超过个连续的不能超过个连续的G或或C；7.端可变化修饰，附加酶切位点；端可变化修饰，附加酶切位点；8.
10、两引物的两引物的Tm值应比较接近；值应比较接近；9.正链引物：正链引物：mRNA序列照抄；序列照抄；负链引物：先写出负链引物：先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写。序列的互补序列，然后翻转重写。10解链温度解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)=20nt Tm一般一般最佳最佳 PCR反应中结合温度（反应中结合温度（anneaning temperature）T=Tm-5分子生物学基本技术PCRvP+、P-的设计方法的设计方法分子生物学基本技术PCR四、四、PCRPCR反应体系反应体系标准的标准的PCRPCR反应体系：反应体系：10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umo
11、l/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ul分子生物学基本技术PCRnTemplate（模板）：（模板）：ssDNA,dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。nPrimes（引物）：（引物）：每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，增加二聚体的机会。纯化引物在25乙腈溶液中4；冻干引物于-20可保存1-2年，液体状态于-20可保存6个
12、月。不用时应-20保存。ndNTPs：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。分子生物学基本技术PCRnMg2+：for Taq polymerase activity Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol
13、/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。nBuffer：10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8,20)。nTaq DNA polymerase（Taq DNA 聚合酶）：聚合酶）：浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。分离分离:1969年，美国黄石国家公园温泉分子量分子量:94KDa活性：活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200 000U/mg离子需要：离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度50mmol/L。忠实性忠实性:没有校正单核苷酸错配功能-致命弱点。一般
14、出错率为210-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。分子生物学基本技术PCR40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20分子生物学基本技术PCR五、五、PCRPCR反应条件优化（反应条件优化（PCR optimizationPCR optimization)1、变性温度和时间、变性温度和时间n一般情况下，9295 l-5min足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。2、退火、退火(复性复性)温度与时间温度与时间n引物中G、C含量高、长
15、度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55、1-2分钟。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度引物的长度、碱基组碱基组成及其浓度浓度，还有靶基序列的长度靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值值-(510)分子生物学基本技术PCR3、延伸温度和时间、延伸温度和时间温度温度：72，接近Taq酶的最适75，高于90时，DNA合成几乎不能进行 Ta
16、q DNA聚合酶的生物学活性聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子 时间时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。一般：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的 34kb的靶序列需34min 10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。时间要稍长些。4、循环次数、循环次数 PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环过多，
17、非特异性产物大量增加，循环次数决定PCR扩增程度。分子生物学基本技术PCR六、六、PCRPCR反应特点反应特点n1.1.特异性强：特异性强：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。n2.2.灵敏度高：灵敏度高：PCR产物的生成量以指数方式增加n3.3.简便、快速：简便、快速：PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。n4.4.对标本的纯度要求低：对标本的纯度要求低：DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等
18、粗制的DNA扩增检测。分子生物学基本技术PCR七、PCR产物的分析 1、凝胶电泳分析、凝胶电泳分析 通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中。2、PCR产物电泳产物电泳 EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。目前可用SYBR的新型荧光荧光染料染料来替代EB，从而减少了对环境的污染，并可有效保护实验操作者。分子生物学基本技术PCR 3、酶切分析、酶切分析 根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。4、分子杂交
19、、分子杂交 分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状。5、核酸序列分析、核酸序列分析 是检测PCR产物特异性的最可靠方法。分子生物学基本技术PCR八、八、Molecular marker1、传统水平、传统水平：形态标记、细胞学标记、生化标记2、分子水平：、分子水平：第一类第一类：电泳、分子杂交为核心 代表代表：RFLP 第二类第二类：电泳、PCR为核心 代表代表：RAPD、SSR、AFLP 第三
20、类：第三类：DNA序列为核心 代表：代表：单碱基多态性（SNP），DNA序列的单个核苷酸的差别分子生物学基本技术PCR3、应用、应用n种质资源研究n品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定）n构建遗传连锁图n基因定位（QTL）n标记辅助选择n比较基因组研究n基因克隆（图位克隆）n生物起源、进化、医学及法医学分子生物学基本技术PCR（一）（一）RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)n物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。n自从人的
21、RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。n优点优点:共显性，非常稳定n缺点：缺点：检测步骤多，周期长，费时、费钱；用作探针的DNA克隆制备、保存不方便；放射性同位素分子生物学基本技术PCR（二）（二）RAPD（Random Amplified Polymorphism DNA)nRAPD随机多态性随机多态性DNA扩增扩增1、常规PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。RAPD只需一个引物，长度9-10个核苷酸，而且是随机引物。2、RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37。3、RAPD易发现多态性，敏感性高。可找出与靶基因连锁的RAPD
22、标记，进行基因定位。分子生物学基本技术PCR（三）（三）AFLP(Amplified Restriction fragment polymorphism)n基本原理：基本原理：结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR 技术高效性。对基因组DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。分子生物学基本技术PCR九、九、PCRPCR技术的应用技术的应用分子生物学基本技术PCRA分子生物学基本技术PCR HLA系统基因分型 PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-SSP分子生物学基本技术PCR 2022-10-27分子生物学基本技术PCR
