1、项目二 微生物无菌操作及接种技术无菌操作技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。物品：高压湿热灭菌操作者：无菌工作服、鞋、帽、口罩环境操作一、防污染措施污染途径（一）操作者 人的体表、皮肤和粘膜上长期寄居一些微生物，这种正常的微生物有一定的种类和数量，和宿主、体外环境三者之间保持动态平衡，有益于宿主健康，所以这类微生物我们称为正常菌群，他们保持了人体的微生态平衡。对于我们制药工业来说，在口服药和局部药制备过程中，要求操作人员清洗和消毒双手，穿上专用工作衣帽进行操作，既可减少微生物污染。但在制备无菌要求高的注射剂和眼用、耳用溶液时要求操作人员操作前
2、穿上全套的工作衣帽包括操作衣、裤、靴子、帽、面罩和手套。此外不允许带菌者操作。空气中的微生物（细菌芽孢和霉菌孢子）主要来自灰尘，或者人的皮肤、衣服，或者由我们谈话、咳嗽、打喷嚏时飞沫中带的微生物，人越多的地方，相对微生物数量就多一些，灰尘多的房间比干净的房间微生物多。（二）环境无菌环境无菌室超净工作台无菌环境的要求与保持（1）无菌室的结构：密封、避光，设百叶通气窗，侧面底部设进气孔 应有缓冲间(外间)、操作间 安装拉门1、无菌室无菌环境的要求与保持（2）无菌室内的设备 缓冲间、操作间安装日光灯和紫外灯，紫外灯距地高度2.0-2.2m;缓冲间内放置工作服、鞋、帽、口罩，消毒用药物；超净工作台，内
3、备接种用常用器具;酒精灯、接种环、打火机或火柴、记号笔、镊子、酒精棉球瓶（3）无菌室的消毒和防污染 无菌室内空气测试应基本达到无菌。使用前后紫外线照射均照射30min 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。（4）无菌室空气污染情况的检验 使用前或操作后检查，应无杂菌；若杂菌多为霉菌时，应通风干燥；杂菌多为细菌时，乳酸熏蒸效果较好。（5）无菌室操作规则 操作前打开缓冲间和操作间的紫外灯30min;器材和用品一次性全部放入无菌室，避免在操作过程中进出无菌室或传递物品.进入缓冲间，换好工作服、鞋、帽、口罩，手消毒 无菌操作 操作后收拾台面，紫外灯照射
4、。2、超净工作台 超净工作台是为实验室工作提供无菌操作环境的设施，以保护实验免受外部环境的影响，同时为外部环境提供某些程度的保护以防污染并保护操作者。原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，洁净空气(进滤空气)按设定的方向流动而形成的。以气流方向来分，现有的超净工作台可分为垂直式，由内向外式以及侧向式。垂直流超净工作台 水平流超净工作台水平流超净工作台 垂直流超净工作台垂直流超净工作台 超净台的使用与维护风速保持在0.32-0.48米/秒使用前打开紫外灯照射30-60min开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。使用中，有机玻璃罩受到污染
5、，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物；使用完毕，关闭酒精灯；使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射15min.定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）在火焰上方操作；（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）在接种培养物时，协作应轻、准。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。（三）无菌操作要求接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程。二、微生物接种技
6、术 接种的基本程序 常用接种方法 斜面接种 划线接种 液体接种 穿刺接种（一）接种的基本程序灭菌接种环灭菌接种环沾取标本沾取标本接种接种灭菌接种环灭菌接种环杀灭接种环沾染的微生物，以免污染标本杀灭接种环沾染的微生物，以免污染标本杀灭接种环沾染的微生物，以免污染环境杀灭接种环沾染的微生物，以免污染环境操作需在无菌室或超净工作台内进行无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。实验使用的物品使用前后需严格灭菌斜面接种液体接种穿刺接种平板接种（二）接种的操作方法1.斜面接种 从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的接种方法。用于好气性微生物的接种，可进行好氧微生物的形态观察或菌种保藏
7、1.消毒：手和台面用75%酒精棉消毒2.标记：接种前在距离试管口2-3cm位置注明菌名、接种日期、接种人姓名3.整理台面：左手用的物品放左手边，右手用的物品放右手边，酒 精灯位于中央；无菌物品左手边，用过的放右手边。4.点燃酒精灯。5.接种：（1）手持试管 将菌种管和待接斜面管用大姆指和其他四指握在左手中，中指位于两管之间。斜面向上，尽量放平。（2）旋松管塞（3）接种环灼烧灭菌：见图4-13，三步。（4）拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)（5）取菌:接种环冷却，轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环碰
8、到管壁，取出后带菌接种环不可通过火焰。（6）接种:在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面管。从斜面培养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。(7)塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。(8)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。斜面接种示意图斜面接种示意图由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。操作方法：与斜面法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上
9、棉塞再轻轻摇匀。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种2.液体接种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中的接种方法。用于厌气性细菌培养、检查细菌的运动能力、保藏菌种 只适宜于细菌和酵母的接种培养3.穿刺接种穿刺接种方法：（1）消毒（2）标记（3）整理台面（4）点燃酒精灯（5）接种 1）手持试管 2）旋松棉塞 3）接种针灼烧灭菌，把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼烧灭菌 4）拔出棉塞5）取菌：用冷却接种针的针尖沾取少量菌种6）穿刺：水平法和垂直法。将接种针自培养基中心平稳、快速垂直刺入培养基，至接近试管底部，然后沿接种线拔出7）塞上棉塞8）接种针
10、灼烧灭菌（1）划线接种目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。4.平板接种分区划线法第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环适用于含菌量较多的标本连续划线法连续划线法适用于含菌量较少的标本稀释法：微生物分离、纯化稀释倒平板法:菌悬液稀释不同梯度的稀释液少许与培养基混合摇匀倒培养皿中稀释混合平板法（倾注法）：稀释培养皿中加入不同梯度的菌悬液1mL加45左右的培养基摇匀稀释涂布平板法：倒平板-稀释-接种0.1mL涂布各种接种方法的用途1.斜面接种法用于鉴定和保存菌种。2.液体培养基接种法 可观察细
11、菌在培养基中的生长现象或用作生化反应实验3.半固体培养基接种法穿刺接种法，用于保存菌种或观察细菌动力4.平板划线接种法 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本。连续划线法：适用于含菌量较少的标本。5.涂布接种法：用于分离、测定标本中活菌数和药敏实验细菌接种6.倾注培养法：用于活细菌计数。是将需要的某种微生物从混杂的微生物群体中分离出来，得到只含有一种微生物的培养物。是由一个单细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称纯培养。菌种的分离微生物的纯培养微生物的纯培养 三、菌种的分离方法p 获得纯培养的方法：平板划线分离法平板划线分离法12单细胞
12、挑取法单细胞挑取法3组织分离法组织分离法4 选择培养基分离选择培养基分离 5三、菌种的分离方法稀释平板分离法稀释平板分离法3 3、单细胞挑取法用显微挑取器，从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的方法。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适于较大微生物显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。4 4、组织分离法分离步骤制作培养基并对培养基灭菌。对组织块进行消毒处理：在无菌条件下，用无菌刀片切取小块受病组织，放入0.1%的升汞水中浸泡2-3min，再用无菌水冲洗数次。是用感病的生物体组
13、织来分离微生物得到纯培养物的方法。接种：把组织块分割成小块，放到平板培养基表面。每个平皿中放入3-5个小组织块培养:适温培养到组织块周围长出单菌落转管纯化：将需要的单菌落转接到斜面试管培养基上，经培养后得到纯培养物。此种方法适合于病原微生物的分离。5.选择培养分离法l 使待分离微生物生长特征“突出”；l抑制大多数其它微生物的生长；l使待分离微生物生长更快。微生物群落中数量占少数的微生物得到分离纯化：颜色反应：分离特定的菌株牛奶平板：分离蛋白酶产生菌l 使待分离微生物生长特征“突出”l 高温下培养：分离嗜热细菌l 培养基中不含N：分离固氮菌l 培养基加抗生素：分离抗性菌l 抑制大多数其它微生物的
14、生长富集培养:利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，仅使待分离微生物旺盛生长，在群落中的数量大大增加，从而更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。l 使待分离微生物生长更快。几种分离方法的应用范围划线：不需稀释，简便，用于分离稀释混合平板法：分离、活菌计数涂布平板法：分离，可得到比较多的单菌落，方便筛选。单细胞挑取法：高度专业选择培养：分离生理类型特殊的微生物工业生产中培养的菌种接入种子罐时，一般先制成菌悬液。常用的接种方法有压差法、火焰封口法等。1.火焰封口法 种子罐的接种口周围设有沟槽，接种时先在沟槽里 注入少量酒精，然后用火焰点燃酒精，使接种口被 包围在一堆火焰之中，
15、接着将菌悬液倒入种子罐中 即可。五、工业生产中的微生物接种2、压差法、压差法 先用棉花球蘸消毒剂覆盖在种子罐接种口的橡皮塞上，先用棉花球蘸消毒剂覆盖在种子罐接种口的橡皮塞上，消毒消毒5 10min，将连接在盛有菌悬液的容器上的接种，将连接在盛有菌悬液的容器上的接种针头迅速插入接种口的橡皮小孔中，然后平衡种子罐与针头迅速插入接种口的橡皮小孔中，然后平衡种子罐与盛菌悬液的容器之间的压力，接着降低种子罐的压力，盛菌悬液的容器之间的压力，接着降低种子罐的压力，菌悬液就会注入到种子罐里。接种完后，再用消毒剂拭菌悬液就会注入到种子罐里。接种完后，再用消毒剂拭净接种口的小孔。净接种口的小孔。工业生产中的微生
16、物接种工业微生物的培养方法 从少量培养从少量培养大规模培养大规模培养 从浅层培养从浅层培养厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养 从固体培养从固体培养液体培养液体培养 从静止式液体培养从静止式液体培养通气搅拌式的液体培养通气搅拌式的液体培养 从单批培养从单批培养连续培养连续培养多级连续培养多级连续培养 从分散的微生物细胞从分散的微生物细胞固定化的细胞集团固定化的细胞集团 从微生物细胞从微生物细胞动、植物细胞大规模培养；动、植物细胞大规模培养；从野生型菌种从野生型菌种突变株、遗传工程菌株；突变株、遗传工程菌株；从单菌发酵从单菌发酵多菌发酵；多菌发酵；从低密度
17、培养从低密度培养高密度培养；高密度培养；从人工控制的发酵罐从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐等。化发酵罐等。微生物培养技术的发展特点：微生物培养技术的发展特点：一、实验室培养法一、实验室培养法（一）固体培养法（一）固体培养法（二）液体培养法（二）液体培养法好氧菌的固体培养好氧菌的固体培养厌氧菌的固体培养厌氧菌的固体培养好氧菌的液体培养好氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养（一）实验室固体培养法1.好氧菌的固体培养试管斜面:形态观察、菌种保藏平板:分离、活菌计数克氏瓶2.厌氧菌的固体培养实验室中培养厌氧菌特殊的培养装置或器皿配制特
18、殊的培养基六种营养要素加入还原剂和氧化还原势的指示剂高层琼脂柱：培养基中加入还原剂，装入试管中灭菌后，只有表层有一些溶解氧，越是深层，其氧化还原电位势越低，有利于厌氧菌的生长。如韦荣氏管（Veillon tube）：长25cm，内径1cm，两端可用橡皮塞封闭的玻璃管。厌氧培养皿：Brewer皿：利用凹形皿盖制造狭窄空间，加上还原性培养基达到厌氧环境。Spray或Bray皿：利用焦性没食子酸+NaOH反应造成无氧环境。厌氧罐：常规的不很严格的厌氧技术；对厌氧罐反复抽真空、灌氮气，剩余氧在钯催化剂的催化下，与灌入混合气体中的氢气还原成水而除去，从而形成良好的无氧环境。Hungate滚管技术：严格厌
19、氧技术利用除氧铜柱在350下与氧反应来制备高纯度氮，再用此高纯度氮去驱除培养基配制、分装过程中各种容器和小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及接种、稀释、培养、观察、分离、移种和保藏等操作的全过程始终处于高度无氧的环境。从而保证了严格厌氧菌的存活。厌氧手套箱：严格厌氧条件箱内始终充满成分为N2：CO2：H285：5：10（V/V）的气体，并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状态。通过塑料手套进行操作，外界物体进出通过交换室。（二）实验室液体培养液体培养法：l好氧菌：确保培养液中含有较高的溶解氧浓度是关键。试管液体培养；三角瓶浅层液体培养：仅适用于兼性厌氧菌 摇瓶培养：又称振荡培养；
20、台式发酵罐：几升至几十升，使用方便l厌氧菌：放入厌氧罐或厌氧手套箱中；培养基中加入巯基乙酸、半胱氨酸等有机还原剂。一般情况下（一般情况下（1.013105 Pa，20），氧在），氧在水中的溶解度仅为水中的溶解度仅为6.2 mLL（0.28 mmolL），），这些氧只能保证氧化这些氧只能保证氧化8.3 mg（即即0.046 mmolL）葡萄糖，仅相当培养基中常用葡萄糖浓度的葡萄糖，仅相当培养基中常用葡萄糖浓度的1。氧的供应是好氧菌生长、繁殖中的限制因子。氧的供应是好氧菌生长、繁殖中的限制因子。提高溶氧速率的具体措施：浅层液体静止培养；利用往复式或旋转式摇床作摇瓶培养；在发酵罐的底部通入加压空气，
21、并用气体分布器使其产生均匀、密集的微小气泡；对培养液进行机械搅拌，并在发酵罐的壁上设置阻挡装置等。厌氧罐或厌氧手套箱厌氧罐或厌氧手套箱液体培养厌氧菌液体培养厌氧菌不必提供额外的培养措施不必提供额外的培养措施单独放在有氧环境下培养单独放在有氧环境下培养有机还原剂有机还原剂加入能显著降低氧化还原电位的铁丝等加入能显著降低氧化还原电位的铁丝等巯基乙酸、半胱氨酸、维生素巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C C或疱肉等或疱肉等加加入入无机还原剂无机还原剂用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林-石蜡油石蜡油台式发酵罐台式发酵罐实验室培养法实验室培养法固体培养法固体
22、培养法好氧菌的固体培养好氧菌的固体培养好氧菌的液体培养好氧菌的液体培养厌氧菌的固体培养厌氧菌的固体培养厌氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养液体培养法液体培养法试管斜面试管斜面培养皿琼脂平板培养皿琼脂平板克氏扁瓶克氏扁瓶茄子瓶茄子瓶高层琼脂柱高层琼脂柱厌氧培养皿厌氧培养皿厌氧罐厌氧罐亨盖特滚管技术亨盖特滚管技术厌氧手套箱厌氧手套箱试管液体培养试管液体培养三角瓶浅层液体培养三角瓶浅层液体培养摇瓶培养摇瓶培养台式发酵罐台式发酵罐严格厌氧严格厌氧二、微生物工业培养法（一）工业固态培养法：l好氧菌：曲法培养。依制曲容器的形状和规模分为：瓶曲、袋曲、盘曲、帘子曲、转鼓曲、通风曲等。酱油酿造l厌氧菌：堆积培养法
23、。白酒生产曲曲根据制曲的容器形状和规模的大小分类瓶曲瓶曲袋曲袋曲（用塑料袋制曲）（用塑料袋制曲）盘曲盘曲（用木盘制曲）（用木盘制曲）帘子曲帘子曲（用竹帘子制曲）（用竹帘子制曲）转鼓曲转鼓曲（用大型木质空心转鼓横向转动制曲）（用大型木质空心转鼓横向转动制曲）通风曲通风曲（厚层制曲）（厚层制曲）机械化程度和生产效率较高的现代化制曲技术，酱油酿造业广泛使用。食用菌制种和培养食用菌制种和培养小小曲曲红红曲曲挂挂曲曲（二）（二）工业液体培养法工业液体培养法液体培养法：l好氧菌：浅盘培养：早期青霉素与柠檬酸发酵；深层液体通气培养：大型发酵罐+搅拌。糖化酶生产l厌氧菌：液体静止培养法：液体培养基置于发酵罐中，不通气，不搅拌，静置保温培养，简化了工艺，节约了能源。啤酒生产大型发酵罐大型发酵罐
