1、实验六实验六 现代免疫学检测技术：现代免疫学检测技术：ELISA ELISA 11.1.了解了解ELISAELISA的原理及其优点，的原理及其优点，2.2.掌握掌握试剂盒试剂盒的使用。的使用。3.3.学习学习ELISAELISA的实验操作过程及其应用。的实验操作过程及其应用。一、实验目的一、实验目的 2免疫酶技术免疫酶技术 （酶免疫测定法）（酶免疫测定法）免疫酶技术免疫酶技术:将将抗原抗体抗原抗体反应的特异性，与反应的特异性，与酶反应酶反应的敏的敏感性相结合的一种方法。它以感性相结合的一种方法。它以酶酶作为作为标记物，与抗体（或抗标记物，与抗体（或抗原，抗抗体）原，抗抗体）联结联结，形成，形成
2、酶标抗体酶标抗体（抗原，抗抗体），其与（抗原，抗抗体），其与相应的抗原（或抗体）作用后，通过相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应进行底物的颜色反应进行抗抗原（抗体）的原（抗体）的定性定性和和定量（酶标测定仪）定量（酶标测定仪），亦可用于组织中，亦可用于组织中抗原或抗体的抗原或抗体的定位定位研究，即酶免疫组织化学技术。研究，即酶免疫组织化学技术。目前目前应用最多应用最多的免疫酶技术的免疫酶技术是是酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验（ELISAELISA）。）。二、实验原理二、实验原理 3ELISAELISA简介简介 1971 1971年年瑞典瑞典学者学者 Engvall Engvall
3、和和PerlmannPerlmann，荷兰荷兰学者学者Van WeemanVan Weeman和和 Schuurs Schuurs分别报道将免分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为定方法，称为酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验（ELISAenzyme-linked immunosorbent assay）4ELISAELISA基本的实验过程基本的实验过程 包被包被：将已知：将已知抗原或抗体抗原或抗体通过物理吸附到通过物理吸附到固相固相载体载体表面，使抗原或抗体表面，使抗原或抗体固相化。固相化。抗原抗体反应抗原抗体反应：先后加入
4、：先后加入被检标本被检标本和和酶结合物酶结合物，使之使之与固相抗原与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合或抗体发生免疫反应而被结合固定。固定。酶促反应酶促反应：在反应体系中：在反应体系中加入加入酶作用的酶作用的底物底物，使发生酶促反应而使发生酶促反应而显色显色。5ELISAELISA：根据检测目的和操作步骤不向，：根据检测目的和操作步骤不向，有以下有以下三种类型三种类型的常用方法。的常用方法。酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验间接法间接法 双抗夹心法双抗夹心法 竟争法竟争法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法6 (1)包被包被固相抗体固相抗体（室（室温放置，厂家完成）温放置，厂家完成）
5、(2)加入待检加入待检样品（抗原）样品（抗原）抗体抗体抗原抗原ELISAELISA检测检测双抗体夹心法双抗体夹心法（测抗原）（测抗原）放大的反应小孔放大的反应小孔7酶标抗体酶标抗体 (4)(4)加入酶反应底物后显色加入酶反应底物后显色 （HRP HRP酶与底物反应后酶与底物反应后,显兰色）显兰色）底物底物(3)(3)加入酶标抗体试剂加入酶标抗体试剂 （夹心饼干形成夹心饼干形成!）ELISAELISA检测检测双抗体夹心法双抗体夹心法（测抗原）（测抗原）8ELISAELISA检测检测双抗原夹心法双抗原夹心法（测抗体测抗体）与双抗体夹心法区别：与双抗体夹心法区别：（1 1）包被抗原包被抗原（2 2）
6、检测样品）检测样品待测抗体待测抗体，如血清等。，如血清等。（3 3）酶标抗原酶标抗原9酶标板酶标板10酶标仪11三、实验内容三、实验内容1.1.采用采用双抗原双抗原夹心法夹心法,测定测定乙型肝炎表面乙型肝炎表面抗抗体（体（HBsAbHBsAb）,学习乙型肝炎学习乙型肝炎表面抗体表面抗体诊断诊断试剂盒试剂盒的使用方法。的使用方法。2.2.采用采用双抗体双抗体夹心法夹心法,测定测定乙型肝炎表面乙型肝炎表面抗抗原原（HBsAgHBsAg）,学习乙型肝炎学习乙型肝炎表面抗原表面抗原诊断诊断试剂盒试剂盒的使用方法。的使用方法。121 1乙肝病毒表面抗体乙肝病毒表面抗体(HBsHBsAbAb)诊断试剂盒。
7、诊断试剂盒。预包被预包被微孔条微孔条（包被（包被纯化纯化HBsAgHBsAg）酶结合物酶结合物：辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶标记标记HBsHBsAgAg （HBsHBsAgAg-HRP-HRP ）抗抗HBsHBs阳性对照阳性对照抗抗HBsHBs阴性对照阴性对照洗涤液洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释浓缩液，用前以蒸馏水稀释，按说明，按说明)底物底物A A（H H2 2O O2 2 ）、）、底物底物B B（四甲基联苯胺（四甲基联苯胺）和）和终止液终止液（HClHCl及及2 mol/L H2 mol/L H2 2SOSO4 4）。）。四、实验材料四、实验材料132 2乙肝病毒表面抗原乙肝病毒表面抗
8、原(HBsHBsAgAg)诊断试剂盒。诊断试剂盒。预包被微孔条预包被微孔条（包被（包被纯化纯化HBsHBsAbAb）酶结合物酶结合物：辣根过氧化物酶标记：辣根过氧化物酶标记HBsHBsAbAb （HBsHBsAbAb-HRP-HRP ）HBsAgHBsAg阳性对照血清阳性对照血清 HBsAgHBsAg阴性对照血清阴性对照血清洗涤液洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀，按说明浓缩液，用前以蒸馏水稀，按说明)底物底物A A、B B和终止液和终止液。3 3微量加样器，吸水纸等微量加样器，吸水纸等。四、实验材料四、实验材料14 1.1.待检测样品待检测样品 待测待测血清血清4 4种种：1 1号、号、2 2号
9、、号、3 3号、号、4 4号号 注意：待测血清是从医院采集的正常血清注意：待测血清是从医院采集的正常血清(人为加进去乙肝表面抗原或者抗体人为加进去乙肝表面抗原或者抗体)，但，但是并不表示血清中不含有可传染的疾病，是并不表示血清中不含有可传染的疾病，所以实验中要所以实验中要注意安全注意安全。五、实验步骤五、实验步骤152.2.分组分组：每：每4 4人一组人一组，每组有检测，每组有检测HBsAgHBsAg和检测和检测抗体（抗体（抗抗HBsAgHBsAg）的的2种试剂盒种试剂盒。反应条反应条各各1 1条条,每条含每条含6 6个反应孔。个反应孔。1 1个孔做阳性对照，个孔做阳性对照，1 1个孔阴性对照
10、，个孔阴性对照，4 4个做样个做样品检测。品检测。本实验本实验空白对照孔空白对照孔不设。不设。五、实验步骤五、实验步骤163.3.检测方法检测方法 （1 1）加样：）加样：每孔加每孔加待检血清待检血清50ul50ul,每次实验各做每次实验各做1 1个个阴性对照阴性对照和和阳性对阳性对照照。注意：注意：每位同学选择一种待测血清进每位同学选择一种待测血清进行检测行检测（见下图）（见下图）。五、实验步骤五、实验步骤17阴性阴性 阳性阳性 待检血清待检血清1 1号号,2,2号号,3,3号号，4 4号号.对照对照 对照对照 1 1号同学号同学取待测取待测血清血清1 1号号阴性阴性 阳性阳性 待检血清待检
11、血清1号号,2号号,3号，号，4号号.对照对照 对照对照 1 1号同学号同学取待测取待测血清血清1 1号号2 2号同学号同学取待测取待测血清血清2 2号号2 2号同学号同学取待测取待测血清血清2 2号号（1 1）加样：）加样：其他按说明书操作！各各50ul50ul血清血清18(2)(2)每孔加每孔加1 1滴滴酶结合物酶结合物,充分充分混匀混匀，3737孵育孵育30min30min。(3)(3)甩弃甩弃孔内孔内液体液体（在水池中甩弃，不要在（在水池中甩弃，不要在实验室中随地甩弃）；实验室中随地甩弃）；(4)(4)每孔加满洗涤液每孔加满洗涤液,静置静置1min,1min,甩干甩干。同同上上洗涤重复
12、洗涤重复4 4次次，拍干拍干。五、实验步骤五、实验步骤19(5)(5)每孔每孔加显色液加显色液A,BA,B各各1 1滴滴,充分充分混匀混匀，置，置373715min15min（水浴锅的盖子上面水擦干净）（水浴锅的盖子上面水擦干净）。按以下方法按以下方法,进行肉眼观察结果进行肉眼观察结果:阴性阴性对照孔对照孔无色无色,阳性阳性对照孔对照孔蓝色蓝色;待测孔待测孔显显蓝色蓝色,为为阳性阳性,否则为否则为阴性阴性。（记录颜色！）（记录颜色！）(6)(6)加终止液加终止液：各孔加：各孔加终止液终止液1 1滴，反应条取出，滴，反应条取出，放入消毒缸。放入消毒缸。五、实验步骤五、实验步骤204.4.实验结果
13、及结论实验结果及结论五、实验步骤五、实验步骤阴性对阴性对照孔照孔阳性对阳性对照孔照孔待测待测1 1待测待测2 2待测待测3 3待测待测4 4结果结果结论结论5.5.作业：作业：按实验报告要求写出并上交实验报告。按实验报告要求写出并上交实验报告。21 HBVHBV属于嗜肝属于嗜肝DNADNA病毒科，是乙型肝炎的病原体。病毒科，是乙型肝炎的病原体。在在中国中国，HBVHBV感染或携带者已超过感染或携带者已超过1.31.3亿，发病人亿，发病人数超过数超过30003000万人。万人。HBVHBV基因组为双链环状基因组为双链环状DNADNA，其，其中有一个单链区。中有一个单链区。HBVHBV的抗原组成的
14、抗原组成由表面抗原（由表面抗原（HBsAgHBsAg）、核心抗原）、核心抗原(HBcAg)(HBcAg)和和e e抗原抗原(HBeAg)(HBeAg)组成。三种抗原具有其相组成。三种抗原具有其相应抗体：应抗体：HBsAb HBsAb（抗表面抗原抗体）、（抗表面抗原抗体）、HBeAb HBeAb（抗（抗e e抗原抗体）、抗原抗体）、HBcAb HBcAb（抗核心抗原抗体）。（抗核心抗原抗体）。知识介绍知识介绍22 HBsAgHBsAg为二聚体糖蛋白，大量存在于感染者血液中，为二聚体糖蛋白，大量存在于感染者血液中，为为HBVHBV感染的主要标志；感染的主要标志；HBcAgHBcAg存在于存在于Da
15、neDane颗粒核心结构表面，为内壳成分，颗粒核心结构表面，为内壳成分，其外被其外被HBsAgHBsAg覆盖，不易在血循环中检出，但能刺覆盖，不易在血循环中检出，但能刺激机体产生抗激机体产生抗-HBc-HBc，抗抗-HBc IgM-HBc IgM的存在提示的存在提示HBVHBV处处于复制状态；于复制状态；HBeAgHBeAg游离于血中，其消长与病毒体消长及游离于血中，其消长与病毒体消长及DNADNA多多聚酶消长基本一致，故聚酶消长基本一致，故HBeAgHBeAg为为HBVHBV复制及具有强复制及具有强感染性的一个指标；感染性的一个指标；知识介绍知识介绍23 HBeAgHBeAg刺激机体产生的抗
16、刺激机体产生的抗-HBe-HBe能与受染肝能与受染肝细胞表面的细胞表面的HBeAgHBeAg结合，通过补体介导破坏结合，通过补体介导破坏受染肝细胞，受染肝细胞，抗抗-HBe-HBe的出现是预防后良好的出现是预防后良好的象征。的象征。HBVHBV的主要感染源是患者或无症状的的主要感染源是患者或无症状的HBsAgHBsAg携带者，通过血液、体液、母婴传播。携带者，通过血液、体液、母婴传播。本实验只检测本实验只检测HBsAg及其抗体及其抗体HBsAb知识介绍知识介绍24HBsAgHBsAg（本（本实验实验测）测）HBeAgHBeAg抗抗-HBs-HBs（本实（本实验测）验测）抗抗-HBeHBe抗抗-
17、HBcHBc结果分析结果分析+-HBVHBV感染或无症状携带者感染或无症状携带者+-急慢性乙肝或携带者急慢性乙肝或携带者+-+“大三阳大三阳”急慢性乙肝患者（传染急慢性乙肝患者（传染性强）性强）+-+“小三阳小三阳”急慢性乙肝感染，趋向急慢性乙肝感染，趋向于恢复于恢复-+既往感染恢复期既往感染恢复期-+既往感染或既往感染或“窗口期窗口期”-+-既往感染或接种过疫苗既往感染或接种过疫苗乙肝两对半检测的结果判断方法乙肝两对半检测的结果判断方法25【注意事项】【注意事项】1 1试剂盒应于试剂盒应于44存放，在有效期内使用。存放，在有效期内使用。2 2微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时微孔条须密封防
18、潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。者及时封存。3 3滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。试剂滴在孔壁上。4 4洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。酶未能洗净。5 5待测标本不可用待测标本不可用NaNNaN3 3防腐。所有样品都应防腐。所有样品都应按传染源处理。按传染源处理。知识介绍知识介绍26临床临床ELISAELISA测定中可
19、能会出现的问题及测定中可能会出现的问题及可能的原因可能的原因（非试剂盒本身的原因）（非试剂盒本身的原因）1 1弱阳性样本检测不出弱阳性样本检测不出 温育的时间或温度不够；显色反应时温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题问题。272 2测定的重复性差测定的重复性差（相同样本两次测定结果不一致）（相同样本两次测定结果不一致）这是这是典型的由测定操作引起的问题，包括典型的由测定操作引起的问题，包括（1 1）加样本及试剂量不准；孔间不一）加样本及试剂量不准；孔间不一致；致；（2 2）加样过快，孔间发生污染；）加样过快，孔间发生污染；（3 3
20、）加错样本；）加错样本；（4 4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；被区；（5 5）不同批号试剂盒中组分混用；）不同批号试剂盒中组分混用；28 （6 6）温育时间、洗板、显色时间不一致；）温育时间、洗板、显色时间不一致；（7 7）孔内污染杂物；）孔内污染杂物；（8 8）酶标仪滤光片不正确；）酶标仪滤光片不正确；（9 9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。现假阳性反应等。2 2测定的重复性差测定的重复性差29 3 3白板白板（阳性对照不显色）（阳性对照不显色）（1 1）漏加酶结合物；）漏加酶结合物；（2 2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。（3 3）漏加显色剂）漏加显色剂A A或或B B；（4 4）终止剂当显色剂使用。）终止剂当显色剂使用。30 4 4全部板孔均有显色全部板孔均有显色（1 1）洗板不干净；）洗板不干净；（2 2）显色液变质；）显色液变质；（3 3）加底物的吸光受酶污染；）加底物的吸光受酶污染；（4 4）洗板液受酶等污染。）洗板液受酶等污染。31
