1、第一节第一节 E花环试验花环试验Erythrocyte Rosette Test 第二十五章第二十五章 细胞免疫检测技术细胞免疫检测技术豚鼠豚鼠T T细胞表面有细胞表面有E E受体受体=CD2.=CD2.家兔红细胞（家兔红细胞（RBCRBC）表面有表面有CD2CD2的配体，即的配体，即CD58.CD58.将淋巴细胞与将淋巴细胞与RBCRBC按一定比例混合后，在一定条件下按一定比例混合后，在一定条件下就形成一个就形成一个T T细胞结合多个细胞结合多个SRBCSRBC的玫瑰花一样的的玫瑰花一样的花环，即花环，即E-E-花环花环(erythrocyte rosette)(erythrocyte ro
2、sette)，取样，取样涂片染色、镜检计数可得花环形成率。涂片染色、镜检计数可得花环形成率。E-E-花环实验原理花环实验原理 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 第二节 淋巴细胞的功能检测淋巴细胞淋巴细胞T T细胞（负责细
3、胞免疫功能）细胞（负责细胞免疫功能）B B细胞（执行体液免疫功能）细胞（执行体液免疫功能）NKNK和和K K细胞（非特异性免疫作用）细胞（非特异性免疫作用）一、T细胞功能的检测T T细胞增殖试验细胞增殖试验T T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验体内试验体内试验（一）一）T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验1.1.原理：原理：淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母母细胞细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核核染色质疏松染色质疏松2.2.淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物非非特异性刺激物：特异性刺
4、激物：PHA -TPHA -T细胞细胞 ConAConA-T-T细胞细胞 PWM-TPWM-T、B B细胞细胞 LPS -BLPS -B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物：异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原 3.3.检测方法检测方法 形态法：刺激物形态法：刺激物 淋巴细胞（淋巴细胞（4-64-6天）天）母细胞母细胞化化 同位素法：同位素法：PHA PHA 淋巴细胞（淋巴细胞（54h54h）DNADNA合成期合成期 +3 3HTdRHTdR掺入掺入 收集细胞收集细胞 检测检测射线射线 测定细胞内的测定细胞内的3H3HTdRTdR方法学评价：方法学评价：优点：形态学方法简便易行，普通光学显
5、微镜便能观察结果，优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。响，重复性和准确性较差。（1 1）形态学检查法）形态学检查法%100胞数转化和未转化的淋巴细转化的淋巴细胞数转化率（2 2）3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题
6、。射性核素污染问题。均值对照孔A均值试验孔A570nm570nmSI(二二)T)T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定 体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映或基因表达水平，以反映T T细胞功能。细胞功能。（三）T细胞介导的细胞毒试验1.1.原理：原理：靶靶细胞抗原细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶靶细胞细胞形态学方法：淋
7、巴细胞形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞同位素法同位素法 ：淋巴细胞（：淋巴细胞（CTLCTL）+含含51Cr 51Cr 的肿瘤细胞的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 51Cr 51Cr 释放释放 测定测定射线射线2.方法意义：意义：肿瘤患者肿瘤患者CTLCTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 (四四)体内试验体内试验特异性抗原皮肤试验特异性抗原皮肤试验PHAPHA皮肤试验皮肤试验 二、B细胞功能检测B B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验溶血空斑试验溶血空斑试验B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测体内试验体内试验(一一)B)B细胞增
8、殖能力的试验细胞增殖能力的试验抗抗IgMIgM细菌脂多糖细菌脂多糖SACSAC的的SPASPAB B细胞增殖细胞增殖形态学形态学3 3H HTdRTdR掺入法掺入法(二二)溶血空斑试验溶血空斑试验1.1.原理：原理：(三三)B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法1.原理：原理：2应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。体分泌量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检
9、测组织切片中分泌抗体的单个细胞。测组织切片中分泌抗体的单个细胞。(四四)体内试验体内试验体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，分离血清，测定受周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B B细细胞的功能。胞的功能。染色计数染色计数离心取上清离心取上清测测LDHLDH或或AKPA
10、KP离心取沉淀离心取沉淀测活细胞荧光测活细胞荧光测测发光强度发光强度测测CPMCPM值值形态法形态法酶释法酶释法荧光法荧光法同位素法同位素法化学发光法化学发光法三、NK细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞:K562细胞株第三节 吞噬细胞功能检测技术 吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。一、中性粒细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能的检测 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测
11、吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测(一一)细胞运动功能细胞运动功能趋化功能检趋化功能检测测琼脂糖平板法琼脂糖平板法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法）小室法）(二二)吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定 1 1显微镜检查法：显微镜检查法：100(%)计数的白细胞数吞噬细菌的白细胞数吞噬率100(%)计数的白细胞数数胞内含着染菌体的细胞杀菌率2.溶菌法100min0min9060301(%)）菌落数菌落数或、作用（杀菌率3 3NBTNBT还原试验还原试验 二、巨噬细胞功能检测(一一)炭粒廓清试验炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%90
12、%炭粒，炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除脾巨噬细胞约吞噬清除10%10%炭粒。据此给小鼠定量炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁静脉注射印度墨汁(炭粒悬液炭粒悬液)，间隔一定时间反，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。(二二)吞噬功能检测吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞功能，常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠菌、酵母白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞
13、等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。(三三)巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定1 1酸性磷酸酶的测定酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法2 2非特异性酯酶的测定非特异性酯酶的测定 常用常用-萘醋酸法萘醋酸法(四四)细胞毒作用测定细胞毒作用测定 用用IFN-IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其对激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR125I-UdR标记的标记的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀的杀伤活性。伤活性。(五五)巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定 激活的
14、巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经3737预温的正常兔血浆和预温的正常兔血浆和CaCl2CaCl2混合液，加入经混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置3737，即时，即时记录血浆凝固时间。记录血浆凝固时间。反映机体免疫功能状态。反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。第四节第四节 免疫细胞功能检测的临床应用免疫细胞功能检测的临床应用
