1、分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术PCRPCR技术及其应用技术及其应用申川军申川军广州中医药大学生物化学教研室广州中医药大学生物化学教研室分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术参考书参考书美美CW迪芬巴赫迪芬巴赫GS德弗克斯勒德弗克斯勒本书由美国冷泉港实验室出本书由美国冷泉港实验室出版社组织国际权威实验室的版社组织国际权威实验室的专家共同研讨并撰稿，是对专家共同研讨并撰稿，是对其其10年前广受赞誉的第一版年前广受赞誉的第一版的全新修订。全书共的全新修订。全书共8篇，篇，分别介绍了分别介绍了PCR方法基本原方法基本原理，样品制备，引物设计，理，样品
2、制备，引物设计，PCR产物的检测，产物的检测，PCR介导介导的克隆，的克隆，PCR法制备突变体，法制备突变体，以及利用以及利用PCR进行基因的差进行基因的差异表达分析，异表达分析，RNA样品的样品的PCR方法等。方法等。70元元分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术背景背景由由Khorana及其同事于及其同事于1971年提出年提出：“经过经过DNA变性，与合适引物杂交，用变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸
3、引物，且当时物，且当时(1970年年)Smith等发现了等发现了 DNA限限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使以，使Khorana等的早期设想被人等的早期设想被人 们遗忘。们遗忘。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术年，在公司工作的年，在公司工作的Mullis着手解决着手解决用简单的方法鉴定某一段的技术问题，有一天晚用简单的方法鉴定某一段的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州号高速公路上，灵机一动想上他驱车在北部加州号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段的简单方法，到了一个实际上可以无限扩增某段的简单方法，
4、即。即。在年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。这么做。给了给了Mullis一万美元的奖金，随后一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。被许多科学家视为近十年来分子生高技术公司。被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。物学领域最重要的一项技术突破。年，
5、年，Kary Mullis因此获得诺贝尔化学奖。因此获得诺贝尔化学奖。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术 PCR只是一个简单的不起眼玩艺只是一个简单的不起眼玩艺 凯利凯利穆利斯（穆利斯（Kary Mullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。的技术，后者又上升成为新的概念。它最大的特点就是能不断推出新形式。它最大的特点就是能不断推出新形式。Paul Rabinow分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子
6、杂交技术PCRPCR技术技术聚合酶链反应聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称，是一项在短时间内大量简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。扩增特定的片段的分子生物学技术。在模板在模板DNA、引物和、引物和4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸（dNTP）存在的条件下，由耐热）存在的条件下，由耐热DNA聚合聚合酶（如酶（如Taq DNA聚合酶）在体外反复酶促合聚合酶）在体外反复酶促合成双链成双链DNA的反应称为聚合酶链式反应。的反应称为聚合酶链式反应。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术#PCR 反应五要素：反应五要素：低。低。dNTP
7、 dNTP：100M200M分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术反应反应pHpH值值,盐离子浓度盐离子浓度稳定剂稳定剂,增强剂增强剂Mg Mg 2 2浓度浓度过高非特异性严重过高非特异性严重过低无扩增产物过低无扩增产物浓度适当浓度适当避免反复冻融避免反复冻融*反应体系对反应体系对PCRPCR扩增的影响扩增的影响分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术#反应分为三步：反应分为三步：DNA模板模板变性变性(denaturing)单链单链DNA模板与引物模板与引物退火退火(annealling)55引物引物延伸延伸(extension)70-72左右，为左
8、右，为Taq酶最适反应温度。酶最适反应温度。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术#PCR原理：原理：分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术*30 30次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCycles Copiesof122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amp
9、licon7 cycle=128 Amplicon8 cycle=256 Amplicon分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术#PCR实验方法实验方法1.向无菌的向无菌的200或或500l Eppendorf管中依次加入以下溶液管中依次加入以下溶液反应物反应物 体积体积 10buffer 2.5l dNTP(1mM)2.5l MgCl2 (25mM)2.5l引物引物 2l 模板模板(20ng)4lTaq酶酶 (1U/ul)1l无菌水无菌水 10.5l总体积总体积 25l分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术2.反应体系混匀，离心反应体系混匀，离心3
10、.在在PCR仪上设定以下程序：仪上设定以下程序：4.取取20l反应液加反应液加4l Loading buffer在在1.2琼琼脂糖凝胶上脂糖凝胶上90-120V，电泳，电泳30-50min。5.在凝胶自动成像系统上观察记录实验结果在凝胶自动成像系统上观察记录实验结果 94预变性预变性3-5min94变性变性30s55退火退火30s30个循环个循环72延伸延伸1min72延伸延伸10min分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术#PCR的种类的种类 逆转录逆
11、转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）反向反向PCR（inversePCR）嵌套式嵌套式PCR（nestingPCR）原位原位PCR（insituPCR）荧光定量荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）多重多重PCR（multiplexPCR）实时实时PCR（Real-timePCR）多重等位基因多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）不对称不对称PCR（asymmertricPCR）锚定锚定PCR（anchoredPCR）长片段长片段PCR（longfragmentPCR）分子生物学分子生物学 第五章第五章
12、分子杂交技术分子杂交技术逆转录酶DNA聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增RT-PCRRT-PCR分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术反向反向PCR-PCR-cDNA cDNA 5-端的快速扩增/5-RACE分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术5RACE的实验方法的实验方法-PSPtetRNA的的5末端末端1.1.体外转录体外转录PSPtet RNAPSPtet RNA。2.2.配制配制PSPtet RNAPSPtet RNA和人总和人总RNARNA的混合样品。的混合样品。3
13、.3.设计合成设计合成5 5条引物。条引物。4.4.使用使用5 RACE5 RACE法获取法获取PSPtet RNAPSPtet RNA的的55末末端。端。5.5.切胶回收目的切胶回收目的DNADNA片段。片段。6.6.进行进行DNADNA测序确认序列结果。测序确认序列结果。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术PSPtetRNA的电泳结果的电泳结果1：PSPtetRNAM：DL2,000Marker1 M分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术RNAMixture的配制的配制将将PSPtet
14、 RNAPSPtet RNA与人总与人总RNARNA按按1 1：10105 5 的比例混合，此混的比例混合，此混合物用于合物用于5 RACE5 RACE实验。实验。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术人总人总RNA的电泳结果的电泳结果1M1:HumanTotalRNAM:HindIIIMarker分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术PSPtetRNA的的5端序列端序列AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTA
15、ACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCC
16、GTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTG
17、AGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术五条引物与五条引物
18、与PSPtetRNA的位置关系图的位置关系图未知未知序列序列53分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术5条引物的详细序列条引物的详细序列RTPrimer：5-(p)AAAATGACCCAG-3F1Primer：5-GTCCTGTGGATCCTCTACGC-3R1Primer：5-AGCCACTATCGACTACGCGAT-3F2Primer：5-AGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTG-3R2Primer：5-CTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATA-3分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术Step1.反转录反应反转录反应
19、RNAMixture10RTBufferRNaseInhibitor(40U/m ml)AMVReverseTranscriptaseXL(5U/m ml)5磷标记反转录引物磷标记反转录引物(200pmol/m ml)RNaseFreedH2Oupto3010分钟分钟5030分钟分钟802分钟分钟4保存保存1.1.反应液组成反应液组成:2.2.反应条件反应条件:3.0m mg1.5m ml0.5m ml1.0m ml1.0m ml15m ml分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术Step2.HybridRNA的分解的分解1stStrandcDNA反应液反应液5Hybrid
20、RNADegenerationBufferRNaseH(60U/m ml)dH2Oupto30;1小时小时乙醇沉淀乙醇沉淀1.1.反应液组成反应液组成:2.2.反应条件反应条件:15m ml15m ml1m ml75m ml分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术Step3.单链单链cDNA的自身连接反应的自身连接反应Step2的的cDNA沉淀物沉淀物5RNA(ssDNA)LigationBufferdH2O40%PEG#6000T4RNALigase(40U/m ml)16;过夜反应过夜反应1.1.反应液组成反应液组成:2.2.反应条件反应条件:8m ml12m ml20
21、m ml1m ml分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术Step4.PCR反应反应(1stPCR)Step3的连接反应液的连接反应液10LAPCRBufferIIdNTPMixture(2.5mMeach)PrimerF1(20mM)PrimerR1(20mM)TaKaRa LA Taq(5U/m ml)dH2Oupto1.1.反应液组成反应液组成:2.2.反应条件如下反应条件如下:1.0m ml5.0m ml8.0m ml0.5m ml0.5m ml0.5m ml50m ml943min9430sec5530sec7230sec25Cycles分子生物学分子生物学 第五
22、章第五章 分子杂交技术分子杂交技术Step4.PCR反应反应(2ndPCR)1stPCR 反应液反应液10LAPCRBufferIIdNTPMixture(2.5mMeach)PrimerF2(20mM)PrimerR2(20mM)TaKaRa LA Taq(5U/m ml)dH2Oupto1.1.反应液组成反应液组成:2.2.反应条件如下反应条件如下:1.0m ml5.0m ml8.0m ml0.5m ml0.5m ml0.5m ml50m ml9430sec5530sec7230sec30Cycles分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术2ndPCR反应结果反应结果M
23、 1M 1M:DL2000Marker1：PCR产物产物分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术切胶回收电泳结果如下切胶回收电泳结果如下1：回收回收DNA片段片段M：DL2000Marker1MStep5.目的目的DNA片段的切胶回收片段的切胶回收分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术Step6.DNA片段的序列测定片段的序列测定分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术未知未知序列序列53测序结果与测序结果与五条引物五条引物间的关系间的关系分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术PSPtetRNA的的5端序列端序
24、列AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCG
25、GAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCC
26、TTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAA
27、GCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术差异显示差异显示PCR又名又名mRNA 差异显示差异显示PCR（mRNA differential display PCR，DD-PCR）又名差异显示反转录又名差异显示反转录PCR（differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR）分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术某组织总某组织总mRNA12种种3锚定引物锚定引物（T12MA、T12MG、T1
28、2MC、T12MT）反转录酶反转录酶12种种cDNA第一链第一链2426种种5十聚随机引物分别与十聚随机引物分别与第一链进行第一链进行PCR反应反应(288312次次)Taq聚合酶聚合酶cDNA双链双链可获得哺乳动物细胞内所有可获得哺乳动物细胞内所有cDNA的片的片段段M=G、C、A分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术（荧光）定量（荧光）定量PCR概念：概念：以以外参或内参为标准，通过对外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或终产物的分析或PCR过程的监过程的监测，对测，对PCR起始模板量的定量。起始模板量
29、的定量。分类：分类：分为三大类，即分为三大类，即外标方法外标方法、动动力学方法力学方法、内标共扩增方法内标共扩增方法。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术 外标法定量外标法定量PCRPCR：分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术原理原理Taq酶：酶：用于荧光定量用于荧光定量 PCR 的的Taq酶不酶不仅具有仅具有DNA 聚合酶活性（延伸聚合酶活性（延伸DNA引物），而且具有引物），而且具有 5 3 核酸外核酸外切酶活性，可以在延伸过程中实现切酶活性，可以在延伸过程中实现链替换，并将被替换的单链切断。链替换，并将被替换的单链切断。外标法外标法TaqM
30、an 实时荧光定量实时荧光定量PCR：分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术 5端标记端标记信号基团或信号基团或报告基团报告基团(Reporter,R)，单单独存在时可以发光独存在时可以发光(FAM、VIC)3端标记荧光抑制基团端标记荧光抑制基团（Quencher，Q），），Q基团对基团对R基团有抑制作用，基团有抑制作用，存在时可抑制存在时可抑制R基因的基因的功能，不产生发光现象功能，不产生发光现象 当溶液中有当溶液中有PCR产物时，该探针可与模板的特异序产物时，该探针可与模板的特异序列结合，结合位点在两条引物之间列结合，结合位点在两条引物之间 当当Taq酶靠近探针时，酶
31、靠近探针时，激活了激活了Taq酶的外切酶活性，酶的外切酶活性，将探针将探针5的的R切下，切下，R基团发出荧光基团发出荧光 根据荧光强度计算初始模板的数量（同步指数增长）根据荧光强度计算初始模板的数量（同步指数增长）原理原理荧光标记的基因探针：荧光标记的基因探针：分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术 信信号号基基因因R抑制基因抑制基因分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术 Rn值是表示在各个反应循环数仪器所检测的荧光信号值值是表示在各个反应循环数仪器所检测的荧光信号值分子生物学分子生物学 第
32、五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术PCR高灵敏性高灵敏性光谱技术光谱技术高精确性高精确性高灵敏性高灵敏性高特异性高特异性高精确性高精确性DNA杂交杂交高特异性高特异性特点特点：分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术致突变致突变PCRM.Smith加拿大生物化学家加拿大生物化学家发现发现“定点突变定点突变”源头创新、革命性、突破性。源头创新、革命性、突破性。对基因学、基因组学及蛋白对基因学、基因组学及蛋白组学的研究具有巨大影响组学的研究具有巨大影响1993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术随心所欲地在已知随心所欲地在
33、已知DNA序列中序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，改变原有序列的特征。酸片段，改变原有序列的特征。定向性、可选择性、定向性、可选择性、无无(少少)干扰性、干扰性、可靠性、高效率、可靠性、高效率、简易性、可重复性简易性、可重复性特点：特点：定义：定义：分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术原位PCR Hasse等于等于1990年建立。年建立。是指在组织细胞里进行是指在组织细胞里进行PCR反应，它结合反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特了具有细胞定位能力的原位杂交和
34、高度特异敏感的异敏感的PCR技术的优点。技术的优点。原位原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，分子水又能标出靶序列在细胞内的位置，分子水平和细胞水平研究并重。平和细胞水平研究并重。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术 分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术 组织处理有何要求：组织处理有何要求：处理后的标本，既要保持组织，细胞处理后的标本，既要保持组织，细胞的形态结构，并增加细胞膜通透性，又要的形态结构，并增加细胞膜通透性，又要充分暴露拟扩增的目的充分暴露拟扩增的目的DNA或或RNA，使引
35、，使引物、探针能有效进入胞浆中发生反应。物、探针能有效进入胞浆中发生反应。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术 原位原位PCR的实验过程：的实验过程：实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞胞玻片玻片上滴加上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在体石蜡后，在原位原位PCR仪仪上进行上进行PCR循环扩增，循环扩增，PCR扩增结束后用标
36、记的探针进行原位杂交，最扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。后显微镜观察结果。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术1）预处理：）预处理：（1）切片常规脱蜡；）切片常规脱蜡；（2）0.2mol/LHCl处理处理10min；（3）5g/ml蛋白酶蛋白酶K消化组织消化组织3710min；（4）Nase消化组织消化组织3730min；（5）梯度酒精脱水，室温干燥。）梯度酒精脱水，室温干燥。2）原位扩增：）原位扩增：（1）切片滴加特异性序列引物）切片滴加特异性序列引物30LPCR扩增反应液，覆扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；盖硅化盖玻片，石蜡油封边；（
37、2）PCR热循环：热循环：94，1min；55，1min；72，1.5min，共，共2530个循环，个循环，72延伸延伸10min；（3）氯仿洗去盖玻片，）氯仿洗去盖玻片，4多聚甲醛后固定多聚甲醛后固定10min，梯度，梯度酒精脱水，干燥。酒精脱水，干燥。3)原位杂交：原位杂交：（1）加标记探针的杂交液，）加标记探针的杂交液，98变性变性10min，-20退火退火5min，42杂交过夜。杂交过夜。（2）杂交后）杂交后2SSC洗洗10min/3次，次，1SSC洗洗10min/3次次（3）缓冲液洗涤）缓冲液洗涤10min，3次；次；（4）加）加AP标记的羊抗地高辛抗体复合物，标记的羊抗地高辛抗体复
38、合物，37，2h；（5）缓冲液洗涤）缓冲液洗涤5min，3次；次；（6）NBT、BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色。暗处显色，镜下控制，终止显色。（7）常规脱水：透明、封固。）常规脱水：透明、封固。分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术PCR技术的应用技术的应用 基础研究：基础研究：扩增目的基因和鉴定重组子扩增目的基因和鉴定重组子克隆基因克隆基因基因功能和表达功能研究基因功能和表达功能研究基因组测序基因组测序制备单链模板制备单链模板致突变致突变分子生物学分子生物学 第五章第五章 分子杂交技术分子杂交技术PCR技术的应用技术的应用 临床医学：临床医学：法医学：法医学：遗传病诊断遗传病诊断肿瘤癌症诊断肿瘤癌症诊断病原体检测病原体检测基因分型：基因分型：PCR-SSOP/PCR-SSCP/RAPD-PCR
