1、会计学1三代基因组编辑技术三代基因组编辑技术第1页/共31页第2页/共31页第3页/共31页第4页/共31页第5页/共31页Genetics,Vol.188,773782第6页/共31页第7页/共31页第8页/共31页第9页/共31页第10页/共31页n发现：1989年，植物病原体黄担保菌属（Xanthomonas spp.）avrbs3基因n发展：2007年，发现其序列特异性核酸结合特性，avvrBs3-TA.2009年，TAL effector 氨基酸序列与核酸靶序列的密码被破译、n应用：2011年，Nature Biotechonlogy同时发辫四篇TALEN基因敲除文章和一篇综述第11
2、页/共31页Functional domains of Xanthomonas TAL effectorspN-端包括一个移位子信号端包括一个移位子信号pC-端包括一个核定位信号和转录激活域端包括一个核定位信号和转录激活域p中间的重复序列决定其特异性中间的重复序列决定其特异性 The number of repeats in TAL effectors varies between 1.5 and 33.5 The general repeat length is 34 aaTAL 效应蛋白的不同结构功能域第12页/共31页l一系列（12或以上）串联重复序列构成识别元件l每个重复有34个氨基酸
3、残基l除12和13位其余都高度保守l重复序列可变的双氨基酸残基(repeat-variable diresidues,RVD)NI-A,HD-C,NN-G/A,and NG-T第13页/共31页Structure of the FokI dimer第14页/共31页16第15页/共31页.利用TALEN在特定位点创造DSB.利用细胞HR（同源重组）修复机制实现基因修饰.利用细胞NHEJ（非同源性末端接合）修复机制实现基因修饰第16页/共31页第17页/共31页第18页/共31页第19页/共31页CasCas蛋白是一种双链蛋白是一种双链DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAgui
4、de RNA引导下对靶位点进行切割。它引导下对靶位点进行切割。它与与folkfolk酶功能类似，但是它并不需要形酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。成二聚体才能发挥作用。第20页/共31页第21页/共31页p CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR 簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。pCRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas 蛋白对目标DNA
5、 进行断裂和降解。第22页/共31页Guide RNA:crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating crRNA）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物。通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（short guide RNA）Cas9:复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分，Ruvc结构域剪切未配对的链。HNHRuvCN代表任意DNA碱基蛋白质：核酸聚合物蛋白质：核酸聚合物第23页/共31页第24页/共31页第25页/
6、共31页第26页/共31页ZFNTALENCRISPR/Cas9系统大小1 kb 2 3 kb 2 4.2 kb(Cas9 from Streptococcus pyogenes)+0.1 kb(sgRNA)识别模块Zinc-finger proteins Transcription activator-like effectorscrRNA or sgRNA 识别序列长度1836 bp3040 bp 22 bp(total length 23 bp)识别序列限制性G-rich Start with T and end with A(owing to the heterodimer structure)End with an NGG or NAG(lower activity)sequence(that is,PAM)切割模块FokIFokICas9切割效率Low or variable(10%)High(20%)High(20%)脱靶效应High Low Variable 细胞毒性Variable to high LowLow第27页/共31页第28页/共31页第29页/共31页Potential off target of CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9的潜在脱靶效应第30页/共31页
