1、郑州牧业工程高等专科学校郑州牧业工程高等专科学校 主讲人：张长兴主讲人：张长兴 动物繁殖新技术系列讲座l第一节第一节 胚胎工程概述胚胎工程概述l第二节第二节 胚胎移植的原理胚胎移植的原理l第三节第三节 胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序l第四节第四节 牛的胚胎移植牛的胚胎移植动物繁殖新技术系列讲座1.胚胎移植的历史胚胎移植的历史2.胚胎移植技术的应用胚胎移植技术的应用3.胚胎移植的成本胚胎移植的成本4.胚胎移植的经济效益胚胎移植的经济效益l1.1初始阶段：初始阶段：1890-1900 W.Heape将安将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，
2、分别获得仔兔利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只。只。l1.2初级阶段：初级阶段：1900-1950 主要由英美科主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率究，成功率35%左右。左右。l1.3发展阶段：发展阶段：1950-1970 日本首次在牛日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手胚胎移植上成功，之后日、美采用非手术法移植成功。胚胎移植成功率达术法移植成功。胚胎移植成功率达70-80%l1.4实用化初始阶段：实用化初始阶段：1970-1980 加美开加美开始成立牛胚胎移植公司，始成立牛胚胎移植公司，1973年牛冻胚年牛冻胚移植成功（英）移植
3、成功（英）l1.5实用化研究阶段：实用化研究阶段：1982-大规模胚胎移植、大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。l在家畜改良方面的应用在家畜改良方面的应用l在特定品种扩繁上的应用在特定品种扩繁上的应用l在动物生物多样性上的应用在动物生物多样性上的应用l其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外受精受精l人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀种公畜的配种效能。但对优秀母畜来说，受其种公畜
4、的配种效能。但对优秀母畜来说，受其产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力较低的畜种更是如此。力较低的畜种更是如此。l通过超数排卵和胚胎移植技术（通过超数排卵和胚胎移植技术（multiple ovulation and embryo transfer:MOET)牛羊牛羊的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高80%和和70%；产奶性状提高；产奶性状提高33%。l牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种群体需要群体需要7-8个世代，个世代，15-20年。而采用年。而采用MEOT法，一
5、次就可获得一个纯种群体法，一次就可获得一个纯种群体l80年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉牛年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉牛品种均采用胚胎移植技术扩繁品种均采用胚胎移植技术扩繁l2000年前后，我国的波尔山羊也是采用胚胎移年前后，我国的波尔山羊也是采用胚胎移植进行扩繁的植进行扩繁的l在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越越来发挥出重要作用。越来发挥出重要作用。l冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或生冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或生殖细胞，但该种动物雌性个体
6、的减少，也是这殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也是这种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验，家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验，并取得一些成功。如斑马胚胎移植给马，蒙古并取得一些成功。如斑马胚胎移植给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛。马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛。l胚胎移植是克隆技术的必须过程胚胎移植是克隆技术的必须过程l体外受精必须借助胚胎移植实现体外受精必须借助胚胎移植实现“试管婴儿的试管婴儿的继续发育继续发育l转基因及动物生物反应器的研究也必须借助胚转基因及动物生物反应器的研
7、究也必须借助胚胎移植胎移植l种母畜购入或培育成本及饲养费，胚胎成种母畜购入或培育成本及饲养费，胚胎成本分摊本分摊l配种费配种费l激素：激素：FSH、LH、PGl手术费：手术药品及耗材、手术辅助人员手术费：手术药品及耗材、手术辅助人员报酬等报酬等l技术费：技术人员约定报酬技术费：技术人员约定报酬l其它：实验室配置、差旅费、招待费其它：实验室配置、差旅费、招待费 胚胎移植是一个技术过程复杂，各个环节环环胚胎移植是一个技术过程复杂，各个环节环环相扣，任何一个不能出现失误的系统工程。相扣，任何一个不能出现失误的系统工程。影响胚胎移植成功率的因素很多，同时，其运影响胚胎移植成功率的因素很多，同时，其运作
8、成本较高。这使其应用中存在经济效益上的高风作成本较高。这使其应用中存在经济效益上的高风险性。险性。如果不是基于急需扩群、供体高经济价值、育如果不是基于急需扩群、供体高经济价值、育种目的，一般尽量采用自然繁殖。在特殊情况下，种目的，一般尽量采用自然繁殖。在特殊情况下，如供种初始阶段，少量优秀个体的扩增，胚胎移植如供种初始阶段，少量优秀个体的扩增，胚胎移植可创造较好的经济效益。可创造较好的经济效益。l1.胚胎移植的生理学基础胚胎移植的生理学基础l2.胚胎移植的基本原则胚胎移植的基本原则l成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育
9、和外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十数个排卵数可达十数个l每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育l早期胚胎处于游离状态早期胚胎处于游离状态l胚胎发育不存在免疫问题胚胎发育不存在免疫问题l胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组联系联系l胚胎的遗传性不受受体的影响胚胎的遗传性不受受体的影响l胚胎移植前后所处的环境的同一性胚胎移植前后所处的环境的同一性供体和受体在分类学上的相同属性供体和受体在分类学上的相同属性动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性上的同期性动物
10、解剖位置上的一致性：空间环境的一致性动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性l胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内l胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响中不受不良因素的影响至目录l1.供体和受体的选择供体和受体的选择l2.超数排卵处理超数排卵处理l3.供体母畜的配种供体母畜的配种l4.胚胎的收集胚胎的收集l5.胚胎的检查胚胎的检查l6.胚胎的保存与培养胚胎的保存与培养l7.胚胎的移植胚胎的移植l8.供体和受体的术后观察供体和受体的术后观察l供体应具有相当高的育种价值供体应具有相当高的育种价值
11、l供体生殖机能应处于较高的状态：产后供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以天以上，无生殖系统疾病，体质强健上，无生殖系统疾病，体质强健l受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种强，体型中上等，非优良品种l受体健康状况良好，已进入发情季节受体健康状况良好，已进入发情季节l供受体发情时间应接近或一致供受体发情时间应接近或一致l意义：让每个供体提供更多的胚胎意义：让每个供体提供更多的胚胎l处理时间：处理时间：牛：预计自然发情时间的前牛：预计自然发情时间的前4天，或发情天，或发情周期的第周期的第16-17天天羊：发情周期的第羊：发情
12、周期的第12-15天，促性腺激素天，促性腺激素处理的第二天或第三天，注射处理的第二天或第三天，注射PGl必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束小时进行一次配种，直到发情结束l配种前应对种公畜的精液进行质量检查配种前应对种公畜的精液进行质量检查l可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，可优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精精l胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布布林斯特液林斯特液SOF合成输卵管液合成输卵
13、管液l手术法收集胚胎手术法收集胚胎输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚子宫角冲胚子宫角冲胚l非手术法收集胚胎非手术法收集胚胎二路法二路法三路法三路法l收集到的冲洗液静置，冲洗液分离收集到的冲洗液静置，冲洗液分离l拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中拣胚：将胚胎移至培养液或保存液中l胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别胎级别l胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其体外生存时间体外生存时间l体外培养：将胚胎置于体温条件下，在体外培养：将胚胎置于
14、体温条件下，在培养液中，使其继续发育培养液中，使其继续发育l胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胎降温冷冻后，保存于液氮中胎降温冷冻后，保存于液氮中l手术法移植手术法移植l非手术法移植非手术法移植l供体和受体的抗炎处理供体和受体的抗炎处理l健康状况检查健康状况检查l返情状况检查返情状况检查l妊娠检查及妊娠确定妊娠检查及妊娠确定l1.1.应符合本品种标准，具有较高的生产性能。应符合本品种标准，具有较高的生产性能。l2.1.52.1.5 8 8岁，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常。岁，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常。l3.3.产犊记录清楚，无流产史，产后有
15、两次正常发情记录。产犊记录清楚，无流产史，产后有两次正常发情记录。l4.4.生殖器官正常，无繁殖疾病。生殖器官正常，无繁殖疾病。l5.5.重复超数排卵间隔重复超数排卵间隔6060d d左右。最多连续处理左右。最多连续处理4 4次后，自然次后，自然繁殖后再使用。凡繁殖后再使用。凡2 2次超数排卵反应差的母牛不再用作供次超数排卵反应差的母牛不再用作供体。体。l6.6.供体牛的超数排卵处理应在情期的第供体牛的超数排卵处理应在情期的第9 91313d d进行。凡黄进行。凡黄体发育不良，卵巢静止的母牛不宜用。体发育不良，卵巢静止的母牛不宜用。l7.7.应选择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。应选择性情温
16、顺的母牛作供体，以便于操作。牛的胚胎移植牛的胚胎移植牛的胚胎移植牛的胚胎移植1.1.良好的营养状况良好的营养状况:要保证给供体牛足够的优质要保证给供体牛足够的优质干草、青贮或多汁饲料、精料以及维生素和矿干草、青贮或多汁饲料、精料以及维生素和矿物质，并供给清洁的饮水和盐，做到合理饲养，物质，并供给清洁的饮水和盐，做到合理饲养，精心管理。精心管理。l2 2供体牛在采卵前后要特别注意保持良好的供体牛在采卵前后要特别注意保持良好的饲管环境，不得任意变换饲草；饲料和管理程饲管环境，不得任意变换饲草；饲料和管理程序，避免因过强的应激所造成的神经紧张状态。序，避免因过强的应激所造成的神经紧张状态。牛的胚胎移
17、植牛的胚胎移植 促卵泡素促卵泡素(FSH)FSH)减量注射法：供体牛在发情后减量注射法：供体牛在发情后的的9 9 1313d d肌注肌注FSHFSH，早晚各一次，间隔早晚各一次，间隔1212h h，分分4 4d d减量注射。在第减量注射。在第3 3d d时同时宫注时同时宫注PGFPGF222.02.02.4mg2.4mg或或氯前列烯醇氯前列烯醇0.60.6mgmg。如使用国产如使用国产FSHFSH总剂量为总剂量为325325单单位时，处理方法如附图所示。超排剂量根据不同位时，处理方法如附图所示。超排剂量根据不同厂家激素确定适宜剂量，国产激素厂家激素确定适宜剂量，国产激素320320360360
18、单位，单位，进口激素进口激素28283636mgmg。（三）采卵 激素的选择与鉴定激素的选择与鉴定孕马血清促性腺激素孕马血清促性腺激素(PMSG)PMSG)处理法处理法在情期的在情期的11111212d d，一次肌注一次肌注PMSG2500PMSG250030001U30001U，48h48h后宫注后宫注PGFPGF222.4mg2.4mg。发情后约发情后约1818h h肌注等量肌注等量的抗的抗PMSGPMSG。PGF PGF22处理后处理后40404848h h，大部分处理牛发情。大部分处理牛发情。通常要求从注通常要求从注PGPG第第2 2d d傍晚开始观察发情，至少早傍晚开始观察发情，至少
19、早晚各观察一次。在观察到接受爬跨后晚各观察一次。在观察到接受爬跨后4 46 6h h进行进行第一次输精，间隔第一次输精，间隔1212h h后第二次输精。每次有效后第二次输精。每次有效精子数不得少于精子数不得少于505010106 6，输入两侧子宫角或子，输入两侧子宫角或子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。宫体。注意输精时不得触摸卵巢。以发情日为第以发情日为第0 0d d，在第在第5 56 6d d检查卵巢检查卵巢确定黄体数，以便于安排受体头数。第确定黄体数，以便于安排受体头数。第7 7d(d(或第或第6 68 8d)d)非手术回收卵。非手术回收卵。灭菌处理过的冲卵管用灭菌处理过的冲卵管用PBSPB
20、S液冲洗液冲洗2 23 3次，次，插入钢芯，检查气球。在无菌间用导管连接吊瓶插入钢芯，检查气球。在无菌间用导管连接吊瓶和集卵杯灌流装置。装入和集卵杯灌流装置。装入PBSPBS液的吊瓶在液的吊瓶在3737水水浴中预温待用。准备好必要的麻醉剂、注射器、浴中预温待用。准备好必要的麻醉剂、注射器、酒精棉球和冲洗消毒剂等。酒精棉球和冲洗消毒剂等。供体牛保定完毕后，在第一、二尾椎骨供体牛保定完毕后，在第一、二尾椎骨间酒精消毒，用间酒精消毒，用2%2%普鲁卡因普鲁卡因3 35 5mlml作硬膜作硬膜外麻醉，或肌注外麻醉，或肌注2%2%静松灵静松灵l mll ml。（三）采卵 麻醉后将牛尾竖直绑在保定架上，清
21、除粪便，用清麻醉后将牛尾竖直绑在保定架上，清除粪便，用清水冲洗会阴部及外阴，再用高锰酸钾液冲洗消毒，水冲洗会阴部及外阴，再用高锰酸钾液冲洗消毒，用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。助手将准备好的冲卵管交给术者的右手，术者左手助手将准备好的冲卵管交给术者的右手，术者左手食指和拇指压开阴门插入冲卵管，再将左手伸入食指和拇指压开阴门插入冲卵管，再将左手伸入直肠，仔细小心地诱导冲卵管经子宫颈进入一侧直肠，仔细小心地诱导冲卵管经子宫颈进入一侧子宫角至大弯处，抽出少许钢芯，再将冲卵管向子宫角至大弯处，抽出少许钢芯，再将冲卵管向前推，使其尖端靠近子宫角深部
22、。由助手持前推，使其尖端靠近子宫角深部。由助手持3030mlml注射器一次推入注射器一次推入1010mlml空气，然后按术者要求，以空气，然后按术者要求，以1 1mlml计数充气。根据子宫大小及冲卵管在子宫的计数充气。根据子宫大小及冲卵管在子宫的位置确定充气量，一般青年牛充气位置确定充气量，一般青年牛充气14141616mlml，经经产牛为产牛为18182525mlml。冲卵管固定后抽出钢芯，开始冲卵管固定后抽出钢芯，开始灌流。灌流。（三）采卵 将吊瓶挂在距外阴部将吊瓶挂在距外阴部1.01.0m m高处，接通三通管高处，接通三通管(Y Y型型)和冲卵管。术者用右手控制进流和出流开关，每和冲卵管
23、。术者用右手控制进流和出流开关，每次灌注次灌注30305050mlml，由少到多，每侧总量为由少到多，每侧总量为300300500500mlml。左手通过直肠辅助按摩子宫角。每侧子左手通过直肠辅助按摩子宫角。每侧子宫角冲宫角冲8 81010次。或者用次。或者用5050mlml注射器，每次注入注射器，每次注入30305050mlml的的PBSPBS冲卵液，分次冲洗子宫角，回收冲卵液，分次冲洗子宫角，回收后注入加盖量筒。另一侧子宫角的冲洗是由术者后注入加盖量筒。另一侧子宫角的冲洗是由术者右手拉直冲卵管，助手小心插入钢芯。术者的左右手拉直冲卵管，助手小心插入钢芯。术者的左手在直肠内诱导钢芯插稳后，给
24、气球放气。术者手在直肠内诱导钢芯插稳后，给气球放气。术者再将冲卵管插入另一侧子宫角，用同样的方法冲再将冲卵管插入另一侧子宫角，用同样的方法冲洗。全过程需在室温洗。全过程需在室温(20(20左右左右)操作。操作。（三）采卵（三）采卵 两侧子宫角冲卵完成后，从气球放出一部分两侧子宫角冲卵完成后，从气球放出一部分空气，将冲卵管抽至子宫体灌注土霉素溶空气，将冲卵管抽至子宫体灌注土霉素溶液液(3(3g g土霉素粉溶于土霉素粉溶于100100mlml灭菌双蒸水或生灭菌双蒸水或生理盐水理盐水)或或1010mlml青霉素青霉素(80(80万万u)u)和链霉素和链霉素(100(100万万u)u)，拔出冲卵管。拔
25、出冲卵管。（三）采卵 （三）采卵 回收结束后，用带回收结束后，用带4 4G G针头的注射器冲洗滤网针头的注射器冲洗滤网2 23 3次，吸去杯中的泡沫，置实体显微镜次，吸去杯中的泡沫，置实体显微镜下检查。下检查。（三）采卵 滤去冲卵液，将过滤杯中留下的滤去冲卵液，将过滤杯中留下的30305050mlml倒倒入平皿，用冲卵液冲洗过滤杯入平皿，用冲卵液冲洗过滤杯2 23 3次，一次，一并倒入平皿，置镜下检查。并倒入平皿，置镜下检查。（三）采卵 将回收的冲卵液注入将回收的冲卵液注入10001000mlml量筒，在量筒，在20202525下静置下静置20203030min(min)min(min)，用导
26、管吸去用导管吸去上层液体。或者按好滤网，用导管在滤网上层液体。或者按好滤网，用导管在滤网上吸去上部冲卵液，将残留的上吸去上部冲卵液，将残留的8080100100mlml倒入平皿内检卵。倒入平皿内检卵。（三）采卵 在酒精灯上拉好内径为在酒精灯上拉好内径为200200300300umum的玻璃吸的玻璃吸管和玻璃棒，在吸管上连接乳胶管管和玻璃棒，在吸管上连接乳胶管(也可也可用用1 1mlml一次性注射器与一支采血管接一起一次性注射器与一支采血管接一起)。在小培养皿内做好含在小培养皿内做好含10%10%或或20%20%牛血清的牛血清的PBSPBS保存液液滴保存液液滴3 35 5个，覆盖上液体石蜡个，覆
27、盖上液体石蜡油，作好编号，放入培养箱待用。油，作好编号，放入培养箱待用。（三）采卵 用玻璃棒清除卵外围的粘液、杂质。用吸管将卵移用玻璃棒清除卵外围的粘液、杂质。用吸管将卵移至培养皿的液滴内，同一供体牛的卵放于同一液至培养皿的液滴内，同一供体牛的卵放于同一液滴内。然后用吸管先吸入少量第二液滴的滴内。然后用吸管先吸入少量第二液滴的PBSPBS保保存液至第一液滴，吸入全部卵，防止吸入黏液、存液至第一液滴，吸入全部卵，防止吸入黏液、杂质，移至第二液滴，依次冲洗卵杂质，移至第二液滴，依次冲洗卵3 35 5次。室温次。室温20202525，需，需2 2人进行检卵及胚胎鉴定。人进行检卵及胚胎鉴定。（三）采卵
28、（三）采卵 在在100100200200倍实体解剖镜下观察受精卵倍实体解剖镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等。况等。凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的，凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的，均列为未受精卵。均列为未受精卵。（三）采卵 （三）采卵 （三）采卵 通常受精后通常受精后6 68 8d d非手术回收的正常受精卵发非手术回收的正常受精卵发育情况如下：育情况如下：桑椹胚一发情后第桑椹胚一发情后第5 56 6d d回收的卵，只能观察到回收的卵，只能观察到球状的细胞团，分
29、不清分裂球，占据透明带内球状的细胞团，分不清分裂球，占据透明带内腔的大部分。腔的大部分。致密桑椹胚：发情后第致密桑椹胚：发情后第6 67 7d d回收的卵，细胞团回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔变小，占透明带内腔60%60%70%70%。（三）采卵 （三）采卵 早期囊胚：发情后第早期囊胚：发情后第7 78 8d d回收的卵，细胞的一回收的卵，细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明带内腔部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明带内腔70%70%80%80%，难以分清内细胞团和滋养层。，难以分清内细胞团和滋养层。囊胚：发情后第囊胚：发情后第7 78 8d d回收，内细胞团和滋养层回收，内细胞团和滋
30、养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。扩大囊胚：发情后第扩大囊胚：发情后第8 89 9d d回收，胚泡腔明显扩回收，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的大，体积增大到原来的1.21.21.51.5倍，与透明带之倍，与透明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的1/31/3。孵育胚：一般在发情后孵育胚：一般在发情后9 91111d d，由于胚泡腔继由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出。凡在发情后第凡在发情后第6 68 8d d回收的回收的1616细胞以下的受精卵细胞
31、以下的受精卵均应列为非正常发育卵，不能用于移植或冷冻保均应列为非正常发育卵，不能用于移植或冷冻保存存（三）采卵（三）采卵 胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度。胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度。如：发情后第如：发情后第7 7d d回收的受精卵在正常发育时应处回收的受精卵在正常发育时应处于致密桑椹胚至囊胚阶段。凡在于致密桑椹胚至囊胚阶段。凡在1616细胞以下的受细胞以下的受精卵及变性细胞超过一半的胚胎均属等外。精卵及变性细胞超过一半的胚胎均属等外。A A级级胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，大小均匀，结构
32、紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。无附着的细胞和液泡。（三）采卵 B B级级 一轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见一轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到一些附着的细胞和液泡，变性细胞约占到一些附着的细胞和液泡，变性细胞约占10%10%30%30%（三）采卵 C C级级 轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达游离的细胞或液泡较多，变性细胞达30%30%50%50%。（三）采卵（三）采卵 塑料细管的编号：剪一段塑料细管的编号：剪一段(2(2cm)0.5mlcm)0.5ml的的塑料细管作为标记外套，内装色纸，写上塑料细管作为标记
33、外套，内装色纸，写上供体品种、牛号、胚胎发育阶段及等级、供体品种、牛号、胚胎发育阶段及等级、制作日期制作日期(年、月、日年、月、日)，并在外套管上写，并在外套管上写明序号备查。明序号备查。（三）采卵 3.胚胎的标记胚胎的标记（三）采卵 年龄在年龄在3 38 8岁，健康，无疾病，体格较大，膘岁，健康，无疾病，体格较大，膘度好。度好。繁殖性能正常，产后繁殖性能正常，产后6060d d以上，并有两次以上的以上，并有两次以上的正常自然发情记录。正常自然发情记录。泌乳性能好，无难产史。不使用两次人工授精泌乳性能好，无难产史。不使用两次人工授精未孕的牛。未孕的牛。（三）采卵 做到精心管理，合理饲养，环境清
34、洁，饲草、做到精心管理，合理饲养，环境清洁，饲草、饲料、饮水要新鲜，补充食盐和必要的添加剂。饲料、饮水要新鲜，补充食盐和必要的添加剂。组成一定数量的牛群。圈舍内防止过挤，以便于组成一定数量的牛群。圈舍内防止过挤，以便于发情观察。发情观察。农户长期舍饲的母牛要注意加强运动。农户长期舍饲的母牛要注意加强运动。防止在移植前后因饲料及环境改变造成的应激防止在移植前后因饲料及环境改变造成的应激反应。反应。（三）采卵 自然发情自然发情根据受体牛的发情观察，与供体牛发情前后根据受体牛的发情观察，与供体牛发情前后相差一天内的牛，可作为受体。相差一天内的牛，可作为受体。（三）采卵 使用使用PGFPGF22。(一
35、次宫注一次宫注)诱发发情诱发发情一般在供体牛注射一般在供体牛注射PGFPGF22前一天，给处于情期前一天，给处于情期8 81515d d且直检黄体好的受体牛一次宫注且直检黄体好的受体牛一次宫注PGFPGF222mg2mg诱诱发发情。发发情。两次两次PGFPGF22处理处理在不考虑发情周期的情况下，可间隔在不考虑发情周期的情况下，可间隔1111d d，前后两前后两次宫注次宫注PGFPGF22受体牛的处理日程安排应与供体牛受体牛的处理日程安排应与供体牛超排处理相吻合。超排处理相吻合。（三）采卵 原则上根据母牛接受爬跨确认发情，早、晚各观察原则上根据母牛接受爬跨确认发情，早、晚各观察3030minm
36、in发情情况。对发情牛需做直检以确认卵泡，发情情况。对发情牛需做直检以确认卵泡，次日上午或晚上确定是否排卵。次日上午或晚上确定是否排卵。若在发情后若在发情后3636h h以后排卵的牛不能用作受体。以后排卵的牛不能用作受体。（三）采卵 供体牛、受体牛的发情日差供体牛、受体牛的发情日差移植胚胎时，如果供体和受体牛的发情周期不一致，移植胚胎时，如果供体和受体牛的发情周期不一致，则难以受胎。要求两者的子宫环境相一致。受体则难以受胎。要求两者的子宫环境相一致。受体牛的发情日比供体牛早一天为牛的发情日比供体牛早一天为+1+1，晚一天为，晚一天为-1-1，同日发情为同日发情为0 0。超过。超过2 2d d不
37、能用于移植。不能用于移植。按胚胎发育情况选受体牛的发情日差按胚胎发育情况选受体牛的发情日差可将致密桑椹胚移植给发情可将致密桑椹胚移植给发情6 6d d的受体牛，将早期囊的受体牛，将早期囊胚移植给发情胚移植给发情7 7d d的受体牛，将囊胚和扩大囊胚移的受体牛，将囊胚和扩大囊胚移植给发情植给发情8 8d d的受体牛。的受体牛。（三）采卵 仿西德式金属移植器，先将移植枪、枪头及金属保仿西德式金属移植器，先将移植枪、枪头及金属保护外套分别用纸包扎好，高压消毒。塑料卡苏式护外套分别用纸包扎好，高压消毒。塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。移植时，先用移植枪需经气体灭菌。移植时，先用70%70%酒精棉酒精棉球
38、消毒装有胚胎的塑料细管，然后剪掉封口一端，球消毒装有胚胎的塑料细管，然后剪掉封口一端，装入移植枪内，套上保护外套。装入移植枪内，套上保护外套。（三）采卵 胚胎移植时可用胚胎移植时可用0.250.25mlml细管分三段吸入细管分三段吸入PBSPBS保存液，中间由两个气泡隔开，中段保存液，中间由两个气泡隔开，中段含有胚胎。也可用小气泡分成多段装管，含有胚胎。也可用小气泡分成多段装管，胚胎在中段。一步细管法解冻脱甘油后，胚胎在中段。一步细管法解冻脱甘油后，用酒精棉球多次消毒细管，剪去封口即可用酒精棉球多次消毒细管，剪去封口即可用于移植。用于移植。（三）采卵 （三）采卵 胚胎装管示意图胚胎装管示意图
39、将受体牛保定，清除粪便，肌注将受体牛保定，清除粪便，肌注2%2%静松静松灵灵l mll ml或用或用2%2%的普鲁卡因的普鲁卡因3 3mlml在在1 1、2 2尾椎尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴，用高锰酸钾水间硬膜外麻醉。清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉球消毒。球消毒。（三）采卵 术者用左手压开外阴，右手持移植器插入术者用左手压开外阴，右手持移植器插入阴道。然后左手伸进直肠，移植器到达子宫颈口阴道。然后左手伸进直肠，移植器到达子宫颈口时，右手用力将移植枪捅破外套填片，插入子宫时，右手用力将移植枪捅破外套填片，插入子宫颈。左手在直肠内诱导
40、使枪头轻轻稳妥地插入黄颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体侧子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎，体侧子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。缓慢旋转地抽出移植枪。（三）采卵 （三）采卵 （三）采卵 通常在移植后三个月开始检查。妊娠通常在移植后三个月开始检查。妊娠9090d d时，子宫继续增大，落入腹腔，可感时，子宫继续增大，落入腹腔，可感觉到胎儿的浮动，孕角出现孕脉，子宫壁觉到胎儿的浮动，孕角出现孕脉，子宫壁可触到子叶。可触到子叶。（三）采卵 对妊娠对妊娠2525d d以上的受体牛可用以上的受体牛可用B B超检查。利用探头超检查。利用探头通过直肠轻轻地在子宫角滑动，在荧光屏上便可通过直肠轻轻地在子宫角滑动，在荧光屏上便可观察到周围黑色中间有一个长观察到周围黑色中间有一个长1 12 2cmcm灰白色图像，灰白色图像，即是胎儿。胎儿即是胎儿。胎儿6060日龄时为日龄时为6 67 7cmcm长，长，9090日龄时日龄时为为14141717cmcm长。长。使用使用B B超探头检查时要特别注意，防止动作过重，超探头检查时要特别注意，防止动作过重，检查过度，以免引起流产。检查过度，以免引起流产。（三）采卵（三）采卵 胚胎移植产出的犊牛谢谢！谢谢！The End
