1、METHODS AND TECHNIQUES内容提要内容提要 一、一、细胞显微技术细胞显微技术（一）光学显微镜（一）光学显微镜（二）电子显微镜（二）电子显微镜（三）显微操作技术（三）显微操作技术 二、二、细胞生物化学与分子生物学技术细胞生物化学与分子生物学技术 三、三、细胞分离技术细胞分离技术 一一.显微技术显微技术 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。（）光学显微镜）光学显微镜 1.构成：照明系统 光学放大系统 机械装置 2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。普通光学显微镜普通光学显微镜Light Pathway of Microscope 3.分辨
2、力：指分辨物体最小间隔的能力。光学显微镜的分辨力光学显微镜的分辨力 R=0.61/NA 其中其中为入射光线波长；为入射光线波长；NA为镜口率为镜口率 sin/2，n=介质折射率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。表一、几种介质的折射率 显微镜的几个光学特点：显微镜的几个光学特点：介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好。sin /2的最大值小于1；油镜介质为香柏油，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400700nm，光镜分辨力约为0.2m，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。荧光显微镜 Fluorescent microscope特点：光源为短波光；有两个特殊的滤
3、光片；照明方式通常为落射式。Fluorescence image,DNA in blue and Microtubules in green 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。激光共聚焦扫描显微境激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope,LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。laser confocal scanning microscope,LCSM激光共聚焦扫描显微镜光路图LCSM Ima
4、ge of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton(green)and the nucleus(blue)http:/www.itg.uiuc.edu/暗视野显微镜暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野背景是黑的，物体边缘是亮的。可观察 4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。
5、1.环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。2.相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。（五）相差显微镜（五）相差显微镜原理（六）偏光显微镜（六）偏光显微镜polarizing microscope 用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。载物台是可以旋转。淀粉（七）微分干涉差显微镜（七）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast
6、 microscope（DIC）1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。物镜与照明系统颠倒；用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。（九）当代显微镜的发展趋势 采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。（二）电子显微镜（二）电子显微镜 原理原理 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50120KV)的平方根成反比。由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。分
7、辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（小于0.2m）。透射电子显微镜透射电子显微镜transmission electron microscope,TEM表二、不同光线的波长表二、不同光线的波长TEM LIGHT PATHWAY透射电子显微镜透射电子显微镜TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM制样技术 1）超薄切片）超薄切片 用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。2）负染技术
8、）负染技术Negative Stained Archaebacteria 3）冰冻蚀刻）冰冻蚀刻 freeze-etching 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。an onion root tip cell with no etching.断面的三种处理方法：蚀刻（etching）、不蚀刻（no etching）、深度蚀刻（deep etching）培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示 Clathrin衣被网格蛋白(clathrin)是一种进化上高度保守的蛋
9、白质，由分子量为180kDa的重链和分子量为3540kDa的轻链组成二聚体,三个二聚体形成包被的基本结构单位-三联体骨架(triskelion),称为三腿蛋白(three-legged protein)。20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为610nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。扫描电子显微镜扫描电子显微镜Scanning electron microscope（SEM）工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由
10、探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。SEM LIGHT PATHWAY人类红细胞人类红细胞酵母酵母人类精子人类精子扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM 原理：根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子
11、水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。扫描隧道显微镜原理引自http:/www.iap.tuwien.ac.at STM image of a DNA molecule原子力显微镜原子力显微镜Atomic Force Microscope(AFM)基本原理基本原理 将探针装在一弹性微悬臂的一端，微悬臂的另一端固将探针装在一弹性微悬臂的一端，微悬臂的另一端固定，当探针在样品表面扫描时，探针与样品表面原子间定，当探针在样品表面扫描时，探针与样品表面原子间的排斥力会使得微悬臂轻微变形，这样，微悬臂的轻微的排斥力会使得微
12、悬臂轻微变形，这样，微悬臂的轻微变形就可以作为探针和样品间排斥力的直接量度。一束变形就可以作为探针和样品间排斥力的直接量度。一束激光经微悬臂的背面反射到光电检测器，可以精确测量激光经微悬臂的背面反射到光电检测器，可以精确测量微悬臂的微小变形，这样就实现了通过检测样品与探针微悬臂的微小变形，这样就实现了通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。Schematic drawing of AFM（三）显微操作技术（三）显微操作技术micromanipulation technique 是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或
13、早期胚胎操作的一种方法。包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。显微操作仪显微操作仪转基因显微操作过程 三三.细胞生物化学与细胞生物化学与 分子生物学技术分子生物学技术（一）细胞化学技术（一）细胞化学技术 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。成，从形态上区别死
14、、活细胞是困难的。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。要检查活力，了解冻存和复苏的效果。培养细胞活力测定 1台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；方法：(1)将细胞悬液以0.5ml加入试管中；(2)加入0.5ml 0.4
15、%台盼兰染液，染色2一3分钟；(3)吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；(4)镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。台盼蓝法 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。2四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD
16、值；MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。操作步骤：（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5 CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时；操作步骤：（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。组织化学和细胞化学染色方法用于对某些细胞成分进行定性和定位研
17、究。固定方法固定方法1.物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。2.化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。显示方法显示方法1.金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2.Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。3.联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。4.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。5.茚三酮反应：显示蛋白质。（二）免疫细胞
18、化学（二）免疫细胞化学 immunocytochemistry 是利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。免疫荧光法（immunofluorescent technique）：如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）：如辣根过氧化物酶。免疫金法（Immunogold technique）ABC法（Avidin-Biotin Complex）亲和素Avidin又称卵白蛋白，是一种分子量为68KD的糖蛋白。它与生物素Biotin(又称维生素H)之间会发生非共价性反应，具有高度亲和力。这种亲和
19、力要超过抗体对大多数抗原亲和力100万倍。所以，Avidin对Biotin的结合是不可逆的。同时,Avidin有4个结合位点可与Biotin结合。因此,在免疫酶技术中可利用Avidin与Biotin之间的这种反应特性，以Biotin标记抗体或与酶结合,再通过Avidin-Biotin的架桥把酶与抗体连接起来,以提高检测方法的敏感度。ABC法（Avidin-Biotin Complex）免疫荧光技术免疫荧光技术 利用某些荧光素，如FITC、R-PE(R-phycoerythrin藻红蛋白)等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定
20、波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。细胞膜蛋白分子的检测 原理：细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量（1）直接法直接法：细胞荧光素标记的抗CD分子的抗体 4C反应30-60 min 荧光显微镜观察或流式细胞计分析。（2）间接法：间接法：细胞抗CD分子的抗体 4C 反应30-60 min 荧光素标记的二抗 4C 反应30-60 min 荧光显微镜观察或流式细胞计分析悬浮细胞：用P
21、BS洗二次后再做染色贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色1 细胞膜细胞膜CD分子的检测分子的检测 2 Annexin V检测技术 (检测细胞凋亡的一个常规指标)磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。原理原理样本处理和
22、染色方法（1）悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.51106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。（2）贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。（3）爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
23、Table 1.Flow cytometric analysis of Annexin-V and PI double stained HeLa cellsTime after 2P photo-induce(h)Percentage of Apoptosis Necrosis0261.70 1.008.54 1.5654.14 13.68 Control 2P/4M,2h 2P/4 M,6hQiao et al.,unpublished data细胞内蛋白分子的检测细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白TFAR19的检测等。操作过程：操作过程：（1）直接法：细胞 3多聚甲醛固定和 渗透化 封闭
24、荧光素标记的 抗体 洗涤 荧光显微镜观察或流式细胞计分析 （2）间接法：细胞 3多聚甲醛固定和渗透化 封闭 针对蛋白的特异 抗体 洗涤 荧光素标记的二抗 洗涤 荧光显微镜观察或流式细胞计分析 凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19（PDCD5）促进细胞凋亡。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象。凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一
25、步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。1 悬浮细胞的染色：悬浮细胞的染色：（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.51106），PBS洗2次，（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm10min。（3）加入PBS-T溶液，37C孵育15min，PBS洗2次，（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。（5）加入 FITC标记的TFAR19单抗(3A3)，4C反应30min（6）洗液洗细胞2次，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中
26、的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。2 贴壁细胞的原位染色贴壁细胞的原位染色（1）贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。（2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。（3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ul）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。Staurosporin(e),星孢菌素（三）放射自显影术（三）放射自显影术 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。原理：将放
27、射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。由于有机大分子均含有碳、氢原子，一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。均为弱放射性同位素，的射线：能量低、射程短、电离作用强；半衰期长，14C半衰期为5730年，3H为12.5年。（四）分子杂交技术（四）分子杂交技术 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是
28、否具有互补关系。1.原位杂交（原位杂交（in situ hybridization）。）。用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 2.核酸杂交 Southern杂交：是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。Northern杂交：将RNA转移到薄膜上，用探针杂交。（五）（五）PCR 技术技术 PCR即：polymerase chain reaction。
29、反应体系：样品DNA；引物（primer），约15-20个核苷酸；4种dNTP；Tag DNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermus aquaticus，最适作用温度7580，短时间在95下不失活。缓冲体系和Mg2+。反应过程：变性：约90-95；复性：约60左右；延伸：70-75；重复“变性复性延伸”过程20-30次循环。PCR原理三三.细胞分离技术细胞分离技术（一）离心技术 是分离细胞器及各种大分子基本手段。转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89K者称为超速离心机。超速离心机的最高转速可达100kr/min，离心力超过500Kg。差速离心差速离心
30、 Differential centrifugation 特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。Low speedHigh speedDifferential centrifugation密度梯度离心密度梯度离心 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密
31、度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。1、速度沉降 velocity sedimentation 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。2.等密度沉降等密度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时
32、间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。Velocity(A)and Equilibrium(B)sedimentation二、流式细胞术二、流式细胞术 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。三、细胞电泳三、细胞电泳 原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。用途：检测细胞生理状态、分离不同种类的细胞。拟南芥 Arabidopsis thaliana
