1、常用分子生物学技常用分子生物学技术的原理及应用术的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology:The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and ApplicationPrinciple and Application生物化学教研室 分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization&Molecular Hybridization&Blotting TechnologyBlotting Technology第第 一一 节节例：例：变性引起紫外吸收
2、值的改变变性引起紫外吸收值的改变DNADNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNADNA变性时其溶液变性时其溶液A A260260增高的现象。增高的现象。热变性热变性解链曲线：解链曲线：如果在连续加热如果在连续加热DNADNA的过程中以温度的过程中以温度对对A A260260（absorbanceabsorbance，A A，A A260260代表溶液在代表溶液在260nm260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。Tm：(m e l t i n g temperature)变性是在一个变性是在一个相当窄的温度范相当窄的温度范
3、围内完成，在这围内完成，在这一范围内，紫外一范围内，紫外光吸收值达到最光吸收值达到最大值的大值的50%50%时的时的温度称为温度称为DNADNA的的解链温度，又称解链温度，又称融解温度融解温度。其大小与其大小与G+CG+C含量成正比。含量成正比。（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization)(nucleic acid hybridization)在在DNADNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNADNA单链分子放在同一溶液中，或把单链分子放在同一溶液中，或把DNADNA与与RNARNA放在一起，只要在放在一起，只要在DNADNA或或
4、RNARNA的单链分子之间有一定的碱基配对的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链化双链(heteroduplexheteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理DNA-DNADNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNADNA分子分子核酸分子杂交核酸分子杂交 (hybridization)(hybridization)复性复性RNADNA核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用研究研究DNADNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置鉴定两种核酸分子间的
5、序列相似性鉴定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础 （二）探针技术（二）探针技术 探针探针 (probe)(probe)一小段用同位素、生物素或荧光一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在列的多聚核苷酸，与固定在NCNC膜上膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。核酸分子存在。放射性：放射性：3232P P、3535S S和和3 3H H 非放射性：非放射性：生物素、地高辛素、生物素、
6、地高辛素、荧光素荧光素 (二、印迹技术二、印迹技术（印迹杂交）（印迹杂交）将在凝胶中分离的生物大分子转移将在凝胶中分离的生物大分子转移（印迹）或直接放在固定化介质上并（印迹）或直接放在固定化介质上并 加以检测分析的技术。加以检测分析的技术。广泛应用于广泛应用于DNADNA、RNARNA、蛋白质检测蛋白质检测电转移印迹技术、真空吸引转移印迹电转移印迹技术、真空吸引转移印迹印迹技术的分类及应用印迹技术的分类及应用（一）（一）DNADNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting)(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNADNA、重组质粒重组质粒和噬菌体的分析。和噬
7、菌体的分析。（二）（二）RNARNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting)(Northern blotting)用于用于RNARNA的定性定量分析。的定性定量分析。其他其他斑点印迹斑点印迹 (dot blotting)(dot blotting)原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)(in situ hybridization)DNADNA点阵点阵 (DNA array)(DNA array)DNADNA芯片技术芯片技术 (DNA chip)(DNA chip)（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)Weste
8、rn blotting)用于蛋白质定性、定量及相互作用用于蛋白质定性、定量及相互作用 研究。研究。用于基因组用于基因组DNADNA、重组质粒和噬菌体的分析。重组质粒和噬菌体的分析。DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labl
9、ed DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody,Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography分子杂交实验分子杂交实验 实验操作实验操作 1 1 细胞裂解物的准备；细胞裂解物的准备；
10、2 2 细胞裂解物的蛋白定量；细胞裂解物的蛋白定量；3 3 细胞裂解物的细胞裂解物的SDS-PAGESDS-PAGE；4 4 蛋白质的转移；蛋白质的转移；6 6 目的蛋白质的检测。目的蛋白质的检测。免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量 测定相对含量时，需要内参照测定相对含量时，需要内参照 选择合适的反应条件：选择合适的反应条件：SDS-PAGESDS-PAGE胶浓度；胶浓度；转移膜的选择；转移时间的选择转移膜的选择；转移时间的选择 注意电极的正负极注意电极的正负极 抗体反应时，注意驱除反应袋内气泡抗体反应时，注意驱除反应袋内气泡 操作要轻柔。操作要轻柔。三种印迹
11、技术的比较三种印迹技术的比较12月24日上午9：00分子杂交实验分子杂交实验放放射射自自显显影影照照片片DNA点阵点阵1、印迹技术的分类、印迹技术的分类第二节第二节PCR是体外模拟天然是体外模拟天然DNADNA复制过程的核酸扩增技术。复制过程的核酸扩增技术。PCR类似于类似于DNADNA在细胞内的复在细胞内的复制过程，可以将微量目的基因扩增制过程，可以将微量目的基因扩增一百万倍以上。一百万倍以上。原理原理 类似于类似于DNADNA的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增DNADNA模板加热模板加热变性变性解链，随之将反应混合物解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的冷却
12、至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生靶序列发生退火退火，再将温度升高使退火引物，再将温度升高使退火引物在在DNADNA聚合酶作用下得以聚合酶作用下得以延伸延伸。这种这种热变性热变性-复性复性-延伸延伸的过程就是一个的过程就是一个PCRPCR循环，循环，PCRPCR就是在合适条件下的这种循环的就是在合适条件下的这种循环的不断重复。不断重复。一、一、PCRPCR反应体系反应体系MgMg2+2+模板模板DNADNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶dNTPsdNTPsn1 1、DNADNA聚合酶聚合酶nTaqTaq DNA DNA聚合酶：聚合酶：水生栖热菌水生栖热菌(the
13、rmusthermus aquaticus,Taqaquaticus,Taq)的的DNADNA聚合酶聚合酶 作用：作用：553DNA3DNA聚合酶活性；聚合酶活性；无无3355外切酶活性外切酶活性，3535轮轮0.25%0.25%错配错配，与原始模板有差别；与原始模板有差别；最适温度：最适温度：7272，选择，选择7272延伸延伸半衰期：半衰期：92.5 130min 92.5 130min 95 40min 95 40min 97.5 5 97.5 56min6min 延伸温度（延伸温度（7272）9595使其在使其在整个扩增循环中保持足够活性整个扩增循环中保持足够活性作用：作用：5 53
14、3DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 3 355外切酶活性外切酶活性优点：优点：耐热、耐热、精确度精确度 pfu Taqpfu Taq不足：不足：但但pfupfu扩增效率通常比扩增效率通常比TaqTaq酶略差酶略差 文献报道：文献报道：Taq+pfuTaq+pfu 会起到较好效果会起到较好效果 n 2 2.引物引物n 人工合成短寡核苷酸人工合成短寡核苷酸20bp-25bpTm=55-6020bp-25bpTm=55-60，nTmTm值要相近，每条值要相近，每条10-50pmol/10010-50pmol/100 l l n 设计原则：设计原则：（1 1）靠近靠近55上游上游PrimerPrime
15、r与双链与双链DNADNA正链相同正链相同 （2）Primer 本身不要出现内部互补序列形成本身不要出现内部互补序列形成 loop环，内部二级结构环，内部二级结构 （3）注意减少注意减少Primer间互补序列间互补序列 导致导致2个个Primer形成形成dimer 一般不要超过一般不要超过3个互补个互补bp （4）Primer 5未端可修饰、突变未端可修饰、突变 （5）primer 5端增加碱基端增加碱基 3.3.模板：模板：可选：可选：DNADNA mRNAmRNA逆转录逆转录cDNAcDNA DNADNA包括：包括：质粒质粒 噬菌体噬菌体 染色体染色体DNADNA 模板用量模板用量 Pla
16、smid:lngPlasmid:lng Chromosome:300-500ng Chromosome:300-500ng 注意：注意：防止交叉污染防止交叉污染4.dNTP4.dNTP：四种脱氧核苷酸：基本原料四种脱氧核苷酸：基本原料终浓度：终浓度：5050 M M 注意：不稳定，保存时间长会失效注意：不稳定，保存时间长会失效 5.Mg5.Mg2+2+TaqDNATaqDNA聚合酶作用时需要聚合酶作用时需要MgMg2+2+不同的酶需不同不同的酶需不同MgMg2+2+外界影响：外界影响：EDTAEDTA鳌合鳌合MgMg2+2+选较低浓度选较低浓度TE(10mM TE(10mM Tris,1mME
17、DTA)Tris,1mMEDTA)；DNADNA模板、引物和模板、引物和dNTPdNTP 的磷酸基团均可与的磷酸基团均可与MgMg2+2+结合，结合，降低降低MgMg2+2+有效浓度。有效浓度。如果扩增如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的产物或效率不理想，要注意调整合适的MgMg2+2+浓浓度度 （1 1）变性温度：）变性温度：94-9594-95 GCGC比例高、长度很长，比例高、长度很长，T T （2 2）退火：退火：温度越高，扩增特异性越好温度越高，扩增特异性越好取决于取决于TmTm值：值：TmTm退火退火TT；TmTm退火退火TT若若TmTm较高，可使退火和延伸在同一温度较高，可
18、使退火和延伸在同一温度（3 3）延伸：）延伸：500nt-1min 500nt-1min 500nt500nt3min3min一般：一般：404060sec60sec6.6.温度温度二、二、PCRPCR技术的工作原理技术的工作原理变性变性95C延伸延伸72C72C退火退火TmTm5C5C5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 基本工作原理基本工作原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩
19、大可以扩大100万倍以上。万倍以上。（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNADNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析三、三、PCRPCR技术的主要用途技术的主要用途（一）反转录（一）反转录PCRPCR技术技术（二）原位（二）原位PCRPCR技术技术（三）实时（三）实时PCRPCR技术技术 利用实时荧光定量利用实时荧光定量PCRPCR的原理，对的原理，对DNADNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测系靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测系统。该方法精确、灵敏、
20、污染途径小。是国统。该方法精确、灵敏、污染途径小。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。际公认的核酸分子定量的标准方法。它是在它是在PCRPCR体系中加入荧光基团，利用体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个荧光信号积累实时检测整个PCRPCR过程，最后过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。法。它已逐渐代替了它已逐渐代替了NortherNorther blot blot 以及以及semiRTsemiRT-PCR-PCR技术。技术。Real-time PCR实时实时PCRPCR技术原理技术原理本节要点1、PCR技术的基本原理技术的基本原理
21、核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法 (Maxam-GillbertMaxam-Gillbert法法)DNADNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (sangersanger法法)设法产生带标记的不同长度的成套设法产生带标记的不同长度的成套DNADNA片片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的使待测的DNADNA链中的相应每个核苷酸处都有断链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过裂或终止。通过PAGEPAGE电泳，能够将相差一个电泳，能够将相差一个核苷酸的核苷酸的DNADNA片段分开，放射自显影后，根据片段分开
22、，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的长短排列，根据特定末端碱基的DNADNA片段就可片段就可读出待测读出待测DNADNA的碱基序列。的碱基序列。酶法酶法 化学法化学法 测序技术进展测序技术进展 酶酶反反应应电电泳泳方方向向模板模板CCGGTAGCAACT3 5 GG5 3 引物引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGT
23、GGCCATCGTTA C G TAGTTGCTACC3 5 TCAACGATGG5 3 读出模板读出模板互补序列互补序列读出模板读出模板序列序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGC 读出模板互读出模板互补序列补序列dNTP 凝胶电泳凝胶电泳 较大片段较大片段 较小片段较小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反应混合物反应混合物Klenow酶酶 未知序列的单链未知序列的单链DNA 读出待测读出待测序列序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3 放射性标记的引物放射性标
24、记的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 computer analysis凝胶中凝胶中DNA移动方向移动方向样品槽样品槽激光器激光器输入光学系统输入光学系统成象透镜成象透镜聚焦透镜聚焦透镜高灵敏度相机高灵敏度相机旋光镜旋光镜/棱镜组件棱镜组件 反应试剂反应试剂G反应：硫酸二甲酯反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸反应：甲酸T+C反应：肼反应：肼C反应：反应：NaCl+肼肼一、化学裂解法一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)基本原理基本原理基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNADNA链在链在1
25、1个或个或2 2个个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的的DNADNA片段，将这些片段经电泳分离。片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNADNA的的5 5 末端，经放末端，经放射自显影即可在射自显影即可在X X胶片上读出胶片上读出DNADNA链的序列。链的序列。二、二、DNADNA链末端合成终止法链末端合成终止法爱咪出版社公司内部档案数据目录 爱
26、咪出版社公司内部档案数据目录 三、三、DNADNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实采用荧光替代放射性核素标记是实现现DNADNA序列分析自动化的基础。用不同序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行进行SangerSanger测序反应，反应产物经电测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小通过四种激光激发不同大小DNADNA片段上片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定光，检测器采集荧
27、光信号，并依此确定DNADNA碱基的排列顺序碱基的排列顺序。DNADNA自动测序结果举例自动测序结果举例第四节第四节基因组基因组DNADNA文库文库 (genomic DNA library)cDNAcDNA文库文库 (cDNA library)基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列的克隆群体。序列的克隆群体。基因组基因组DNA文库文库第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的
28、全部件下所表达的全部mRNAmRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、二、cDNA文库文库 第五节第五节 生物芯片技术生物芯片技术Biological Chip Technology是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段或片段或cDNAcDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上于单位面积的支持物上 ，然后与待测的，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用激光荧光标记样品进行杂交，杂交后用激
29、光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一探针位点的荧光通过计算机系统对每一探针位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。得出定性和定量的结果。一、基因芯片一、基因芯片(gene chip)目目 录录基因芯片技术原理基因芯片技术原理 是将高度密集排列的蛋白分子是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和
30、定量分析的一种技术。白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片第六节第六节生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是一
31、个基于亲和标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。用的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。胞内与融合蛋白相结合的未知分子。标签融标签融合蛋白合蛋白沉淀实沉淀实验流程验流程示意图示意图（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途n酵母双杂交系统的应用酵
32、母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。用的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BDBD基因融合基因融合成为成为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选ADAD基因融基因融合的合的“猎物猎物”基因表达文库，筛选未知的相基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。互作用蛋白质。电泳迁移率变动测定电泳迁移率变动测定(electro
33、phoreticelectrophoretic mobility shift assaymobility shift assay，EMSA)EMSA)或称凝胶迁移变动或称凝胶迁移变动实验实验(gel shift assay)gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNADNA结合蛋结合蛋白与相应白与相应DNADNA序列间的相互作用，可用于定性和定序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究前这一技术也被用于研究RNARNA结合蛋白和特定结合蛋白和特定RNARNA序列间的相互作用。序列间
34、的相互作用。二、二、DNA-DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图染色质免疫沉淀技术染色质免疫沉淀技术(chromatin(chromatin immunoprecipitationimmunoprecipitation assay,assay,ChIPChIP)是是目前可以研究体内目前可以研究体内DNADNA与
35、蛋白质相互作用与蛋白质相互作用的主要方法。的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图遗传修饰动物模型的建立及应用遗传修饰动物模型的建立及应用The Establishment and Application of The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model Heredity-Modified Animal Model 第七节第七节n转基因技术转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精采用基因转移技术使目的基因整合入受
36、精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。宫，使之发育成个体。转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物(transgenic animal)(transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术n核转移技术核转移技术 即即动物整体克隆技术动物整体克隆技术，将动物将动物的一个体细胞核全部导入另一个体的一个体细胞核全部导入另一个体的去胞核的的激活的卵细胞内，使的去胞核的的激活的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆之发育成个体，即克隆(clone)(clone)。二、核转移
37、技术二、核转移技术n基因剔除技术基因剔除技术(gene knock out)(gene knock out)也称也称基因靶向基因靶向(gene targeting)(gene targeting)灭活灭活，有目的去除动物体内某种基因有目的去除动物体内某种基因的技术。的技术。三、基因剔除技术三、基因剔除技术将灭活的基因放入胚胎干细胞将灭活的基因放入胚胎干细胞(embryonic stem cell(embryonic stem cell，ES)ES)中，使这一灭中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显筛选到基因已
38、定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。体小鼠。n操作方式操作方式n建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-function(gain-of-function mutation)mutation)多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型四、基因转移和基因剔除在医学四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用发展中的作用第第 八八 节节克隆疾病相关基因的策略克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克
39、隆（一）功能性克隆(functional cloningfunctional cloning)（二）定位克隆（二）定位克隆(positional cloning)(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略(position-(position-independent candidate gene independent candidate gene approaches)approaches)（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略(positional (positional candidate gene approaches
40、)candidate gene approaches)定义定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。克隆该致病基因。（一）功能性克隆（一）功能性克隆应用应用 生化机制已明确、基因表达产物较易生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。得到部分纯化的遗传性疾病。克隆方式克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNAcDNA文库；文库；根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选酸作探针，筛选cDNAcDNA文库。文库。功能互补试验功能互补试验 (functional compl
41、ementation assay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析(确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常(缺失、易位等缺失、易位等)分析、基分析、基因文库的筛选与基因克隆因文库的筛选与基因克隆（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候
42、选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。病基因。（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。致病基因。基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗第九节第九节Gene Diagn
43、osis and Gene Therapyn定义定义直接检测基因结构及其表达水平是否正直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。常，从而对疾病作出诊断的方法。一、基因诊断一、基因诊断(Gene Diagnosis)(Gene Diagnosis)n特点特点以基因作为检查材料和探察目标，属于以基因作为检查材料和探察目标，属于“病因诊断病因诊断”。针对特定基因，特异性强。针对特定基因，特异性强。所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高。所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高。适用性强，诊断范围广。适用性强，诊断范围广。1.1.DNADNA序列分析序列分析用于基因突变类型已经明确的遗
44、传用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断病的诊断及产前诊断 。2.2.PCRPCR技术技术 快速检出样品中的痕量病原微生物。快速检出样品中的痕量病原微生物。微量微量DNA DNA 样品中的基因及基因变异分析。样品中的基因及基因变异分析。用于个体识别、亲缘关系鉴定、器官移用于个体识别、亲缘关系鉴定、器官移植术前组织配型、基因连锁分析等等。植术前组织配型、基因连锁分析等等。u样品中痕量病原微生物的迅速检出、分类样品中痕量病原微生物的迅速检出、分类及分型。及分型。u同时分析样品中可能存在的多种不同基因同时分析样品中可能存在的多种不同基因变异方式。变异方式。u分析样品中耐药菌株的存在和个体对
45、药物分析样品中耐药菌株的存在和个体对药物或毒物的敏感性。或毒物的敏感性。u分析个体的疾病易感状态，如肿瘤、自身分析个体的疾病易感状态，如肿瘤、自身免疫病发生的预警。免疫病发生的预警。3.3.基因芯片基因芯片(gene chip)(gene chip)将某种遗传物质转移到患者将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用细胞内，使其在体内发挥作用,以治疗疾病的方法，以治疗疾病的方法，称为称为基因治基因治疗。疗。二、基因治疗二、基因治疗(Gene Therapy)Gene Therapy)n定义定义（一）基因治疗的基本策略（一）基因治疗的基本策略1.1.缺陷基因精确的原位修复基因增补缺陷基因精
46、确的原位修复基因增补 基因失活基因失活 基因疫苗基因疫苗 基因矫正基因矫正基因置换基因置换（二）基因治疗的基本程序（二）基因治疗的基本程序 治疗性基因的选择治疗性基因的选择 基因载体的选择基因载体的选择 靶细胞的选择靶细胞的选择 基因转移基因转移病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞间接体内疗法间接体内疗法直接体内疗法直接体内疗法 教学目的教学目的n掌握：掌握：PCRPCR技术的原理与应用技术的原理与应用n熟悉：分子杂交与印迹技术熟悉：分子杂交与印迹技术n了解：核酸序列分析、基因文库、疾病相了解：核酸序列分析、基因文库、疾病相 关基因的克隆与坚定、遗传修饰动关基因的克
47、隆与坚定、遗传修饰动 物模型的建立及应用、生物芯片技物模型的建立及应用、生物芯片技 术、蛋白质相互作用研究技术术、蛋白质相互作用研究技术 思考题思考题1 1、简述、简述PCRPCR反应的基本步骤反应的基本步骤2 2、试述、试述SouthernSouthern印迹杂交的基本印迹杂交的基本步骤步骤选择题选择题1、一般影响核酸变性的温度可选在：、一般影响核酸变性的温度可选在：A5060 B6070 C7080 D8090 E901002、鉴别、鉴别DNA靶分子的杂交称靶分子的杂交称 ASouthern印迹杂交印迹杂交 B Northern印迹杂交印迹杂交 C 原位杂交原位杂交 D斑点印迹斑点印迹 E免疫印迹免疫印迹3、有关、有关PCR的描述，哪个不对的描述，哪个不对 A.是一种酶促反应是一种酶促反应 B.引物决定扩增的特异性引物决定扩增的特异性 C.扩增的对象是扩增的对象是DNA序列序列 D.扩增的对象是氨基酸序列扩增的对象是氨基酸序列 E.PCR技术是技术是1985年由美国年由美国 科学家科学家Kary B Mullis建立的建立的 多选题多选题4、PCR反应体系含有反应体系含有 A.耐热的耐热的TaqDNA聚合酶聚合酶 B化学合成的寡核苷酸引物化学合成的寡核苷酸引物 C.4种种dNTP D合适的缓冲液体系合适的缓冲液体系 E模板模板DNA
