微生物的分类鉴定技术课件.ppt

1、目录目录项目一：普通光学显微镜的操作技术项目二：染色与细菌的细胞形态观察项目三：酵母和霉菌等细胞形态观察项目四：常见微生物群体形态观察项目五：微生物鉴定用常规生化反应试验项目一项目一 普通光学显微镜的操作技术普通光学显微镜的操作技术 显微镜是我们研究微生物重要的也是最基本的工具。我们只有借助于显微镜才能看得清这些微小的生物，观察它们的形态结构才能对它们的种类做个基本的判断。微生物的发现史世界上第一台显微镜是荷兰眼镜商詹森（Hans Janssen）（左图）在1604年发明的。（右图）1665年，英国的物理学家罗伯特胡克（Robert Hooke,16351703）（左图）用自己设计并制造的显微

2、镜（右下图）观察栎树软木塞切片时发现其中有许多小室，状如蜂窝，称为“cella”，这是人类第一次发现细胞，不过，胡克发现的只是死的细胞壁。胡克的发现对细胞学的建立和发展具有开创性的意义，其后，生物学家就用“cell”一词来描述生物体的基本结构。1674年，荷兰布商列文虎克(Antonie van Leeuwenhoek,16321723)（上图）为了检查布的质量，亲自磨制透镜，装配了高倍显微镜（300倍左右）（下图），并观察到了血细胞、池塘水滴中的原生动物、人类和哺乳类动物的精子，这是人类第一次观察到完整的活细胞。列文虎克把他的观察结果写信报告给了英国皇家学会，得到英国皇家学会的充分肯定，并很

3、快成为世界知名人士。列文虎克的一生致力于在微观世界中探索，发表论文402篇，其中列文虎克发现的自然界的秘密是人类关于微生物研究的最早专著。否定了自然发生说 证实发酵由微生物引起（酒精发酵）巴氏灭菌法 免疫学-提出了预防接种措施（制备了狂犬疫苗）法国微生物学家、化学家巴斯德（Louis Pasteur，1822-1895）是近代微生物学的奠基人。柯赫柯赫细菌学的奠基人细菌学的奠基人 提出了柯赫法则 建立固体培养基分离纯化微生物技术 染色观察和显微摄影技术 从列文虎克第一次看到细菌以来，300多年来微生物学从孕育、诞生到发展，以至于今天成为生命科学中的一个不可忽略的重要分支。在这漫长的时间中，一批

4、杰出的科学家在微生物学的各方面作出的贡献，他们是人类认识、利用和驾御微生物伟大成就中的明星。微生物学发展形态学发展阶段生理学发展阶段近代微生物学阶段项目一项目一 普通光学显微镜操作技术普通光学显微镜操作技术项目实训任务单实践操作问题探究知识拓展项目名称显微镜操作技术实训对象高职（五年）/高专(三年)学时2学时实 训目标知识目标：1.了解显微镜构造、性能及原理；能力目标：1.掌握显微镜的基本使用基础和保养方法 2.掌握显微镜油镜的观察情感目标：1.通过自主操作，提高学生发现问题,解决 问题的能力2.养成良好的实验习惯进而形成良好的职业素养学习内容：1.显微镜的构造及原理2.观察前准备3.显微观察

5、4.油镜观察5.显微镜使用后处理重点与难点:显微观察步骤具体要求：1.取出显微镜时应一手握住镜臂一手拖住底座，使显微镜保持直立、平稳。放置在水平桌面.2.初学者遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察过程.3.选择合适观察部位在油镜下得到较清晰图像4.观察完毕镜头擦拭干净放回原处实训材料与仪器：普通光学显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等普通光学显微镜的使用显微镜的安置光源调节确定观察部位浸油观察显微镜使用后处理实践操作实践操作 一手握镜臂，一手托镜座，保持镜体直立。放置水平桌面上。坐姿端正，两眼同时睁开操作，必要时左眼观察，右眼绘图或记录。观察部位的确定观察部位的确定 将标本片放在

6、载将标本片放在载物台上，使标本位于物台上，使标本位于物镜下方。先用低倍物镜下方。先用低倍镜观察，转动粗调节镜观察，转动粗调节螺旋，缓慢提升镜筒螺旋，缓慢提升镜筒（或下降载物台）使（或下降载物台）使物镜与标本距离拉大，物镜与标本距离拉大，当出现物像时，改用当出现物像时，改用细调节螺旋，上下微细调节螺旋，上下微微移动，直至物像清微移动，直至物像清晰后，用推进器找到晰后，用推进器找到理想的观察部位。理想的观察部位。浸油观察的方法浸油观察的方法 找到观察部位后，将找到观察部位后，将镜筒升起，镜筒升起，在观察部位加一滴香柏油，转在观察部位加一滴香柏油，转换油镜换油镜，从侧面注视，用粗调，从侧面注视，用粗

7、调节螺旋缓慢提升载物台，节螺旋缓慢提升载物台，使油使油镜头浸入香柏油中，直到几乎镜头浸入香柏油中，直到几乎与标本片接触为止，与标本片接触为止，然后从目然后从目镜观察视野，当视野见有模糊镜观察视野，当视野见有模糊的物像时，改用细调节螺旋上的物像时，改用细调节螺旋上下微微移动，直到物像清晰为下微微移动，直到物像清晰为止，再用推进器进一步观察标止，再用推进器进一步观察标本。本。如果镜头离开香柏油时，如果镜头离开香柏油时，应重新浸油，重复上述操作过应重新浸油，重复上述操作过程。程。显微镜使用后处理显微镜使用后处理 油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再取一油镜使用完毕，先用擦镜纸擦去镜头上的香

8、柏油，再取一张擦镜纸滴上少量二甲苯把镜头上油擦净，最后再用一张张擦镜纸滴上少量二甲苯把镜头上油擦净，最后再用一张干擦镜纸将镜头上残留的二甲苯擦净。干擦镜纸将镜头上残留的二甲苯擦净。下降聚光器，取下载玻片。下降聚光器，取下载玻片。用擦镜布（绸布）将显微镜各部位擦净，除去灰尘、油污、用擦镜布（绸布）将显微镜各部位擦净，除去灰尘、油污、水汽，以免生霉长锈。水汽，以免生霉长锈。使显微镜各部位恢复回原位，转动转换器，使物镜呈使显微镜各部位恢复回原位，转动转换器，使物镜呈“八八”字形叉开置于载物台上（或将载物台下降到最低点），最字形叉开置于载物台上（或将载物台下降到最低点），最后将显微镜送回箱内。后将显微

9、镜送回箱内。1、普通光学显微镜的构造及原理、普通光学显微镜的构造及原理问题探究问题探究载物台聚光器物镜转换器接物镜弹簧夹虹彩光圈光源镜座电源开关光源滑动变阻器粗调螺旋微调螺旋镜臂镜筒目镜标本移动螺旋普通光学显微镜的成像原理普通光学显微镜的成像原理 光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。供人们提取微细结构信息的光学仪器。表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像，光学显微镜就是利用这一原理把微小

10、物体放大到人眼足以观察的尺寸。像，光学显微镜就是利用这一原理把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。而近代光学显微镜就是采用物镜和目镜两组透镜放大而完成的。显微镜的总而近代光学显微镜就是采用物镜和目镜两组透镜放大而完成的。显微镜的总放大倍率就是物镜放大倍率和目镜放大倍率的乘积。放大倍率就是物镜放大倍率和目镜放大倍率的乘积。B A两次放大后成倒立的虚像BA 而油镜使用的原理，是而油镜使用的原理，是为了减少光线通过玻片为了减少光线通过玻片与镜头之间的空气时的与镜头之间的空气时的损失。损失。由于空气与玻片的密度不同，使光由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视线受到曲折，发生散射，降

11、低了视野的照明度。若中间的介质是一层野的照明度。若中间的介质是一层油（油（其折射率与玻片的相近其折射率与玻片的相近），则），则几乎不发生折射，增加了视野的进几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。光量，从而使物象更加清晰。物镜与油镜系统镜光线通路显微镜使用中的注意事项显微镜使用中的注意事项 1.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度光洁度 2.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使

12、用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。3.拿显微镜时，不可单手拿，更不可倾斜拿。拿显微镜时，不可单手拿，更不可倾斜拿。4.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片腐蚀镜片。5.油镜的擦拭油镜的擦拭知识拓展知识拓展 微生物的发现史 常用的显微镜的类型项目二项目二 染色与细菌细胞形态观察染色与细菌细胞形态观察项目实训任务单实践操作问题探究知识拓展名称名称性质性质发色基发色基助色基助色基用途用途结晶紫（龙胆紫）碱性对位醌-NH2革兰氏染色等番红（沙黄）番红（沙黄）碱性碱性双偶氮双偶氮-NH2革兰氏染色，核染色

13、等革兰氏染色，核染色等碱性复红碱性对位醌-NH2核染色、鉴别结核杆菌等美兰碱性对位醌-NH2活体染色、放线菌染色、氧化还原指示剂中性红碱性醌环-NH2活体染色、鉴别肠道细菌等孔雀绿碱性对位醌-NH2细菌芽孢染色等刚果红酸性双偶氮-NH2细菌负染色、酵母染色等伊红酸性对位醌-OH细胞质染色、细胞的嗜酸性颗粒染色酸性复红酸性对位醌-NH2单染色等荧光素酸性羰基-OH荧光染色黑素（水溶黑素）混合物负染色微生物实验常用染料微生物实验常用染料 微生物染色种类是非常多的，但一般分为微生物染色种类是非常多的，但一般分为单单染色法和复染色法染色法和复染色法两种。两种。前者用一种染料使微生前者用一种染料使微生物

14、染色，利于显微镜下观察但不能鉴别微生物。物染色，利于显微镜下观察但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用，故亦称鉴别染色法。微生物的作用，故亦称鉴别染色法。项目二项目二 染色与细菌细胞形态观察染色与细菌细胞形态观察活活菌菌染染色色简单染色法抗酸染色革兰氏染色复杂染色法普通染色芽孢染色法荚膜染色法细胞壁染色法特殊染色正染色负染色死菌染色细菌染色我们将重点学习革兰氏染色。项目二项目二 染色与细菌细胞形态观察染色与细菌细胞形态观察项目名称细菌革兰氏染色实训对象高职（五年）/高专(三年)学时4学时实 训目标知识目标：1.了解细菌

15、细胞的基本形态,结构；2了解染色的基本原理；3.理解细菌细胞结构、化学组成和生理功能能力目标：1.能熟练进行细菌的染色得到正确的结果情感目标：1.通过自主操作，提高学生发现问题,解决问题的能力 2.养成良好的实验习惯进而形成良好的职业素养学习内容：1.观察制片玻片的准备2.细菌涂片的制作3.制片的染色4.制片的观察重点：细菌观察制片的制作过程难点：染色与脱色步骤具体要求：1.载玻片应洁净无油渍2.涂片应均匀厚薄适宜3.滴加染液适量，控制染色时间，初染1min，媒染1min，脱色30S以内，复染2-3min4.在油镜下应观察到单细胞的颜色及形态。染色应较均匀，不应有大片背景染色区域学生基础要求：

16、1.普通显微镜的使用基础实训材料与仪器：普通光学显微镜、金黄色葡萄球菌固体纯培养物、大肠杆菌液体纯培养物、草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、95%酒精、石炭酸复红、接种环、酒精灯、载玻片、蒸馏水、冲洗架、废液缸（或盘）香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等项目实训任务单项目实训任务单制片玻片准备涂片干燥固定染色初染媒染脱色复染玻片要求洁净、无油渍，否则以酒精擦拭涂片取用活跃生长期的幼龄菌、涂片要匀而薄火焰固定以不烫手为宜实践操作实践操作镜检镜检1 1、制片、制片 涂片：取一环无菌生理盐水于玻片中央，挑取少许菌样，与载玻片上水滴混合均匀，涂成一薄层。干燥：室温下自然干燥 固定：标本面向上，酒精灯外焰上迅速通过

17、2-3次。涂片涂片干燥干燥固定固定实践操作实践操作返回返回为什么要固定？为什么要固定？涂片整个过程应注意什么？涂片整个过程应注意什么？实践操作实践操作 初染初染 在涂片处滴加草酸铵结晶紫染液，滴加量以刚好覆盖整个菌膜为宜，染色1分钟后用水冲洗，直至流下的水无紫色为止。媒染媒染 用革兰氏碘液冲去残水，并用革兰氏碘液覆盖菌膜1分钟后水洗。脱色脱色 用滴管流加95%的乙醇脱色至载玻片下端流下的液体无紫色时，立即水洗。复染复染 用番红液复染1分钟后，水洗。2、染色、染色返回3、镜检 玻片晾干后镜检。低倍镜高倍镜油镜观察问题探究 不同样品染色的结果一致吗?特征特征革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细

18、菌革兰氏阴性细菌硬壁层硬壁层外壁层外壁层厚度（厚度（nm）208023810肽聚糖含量肽聚糖含量占细胞壁干重的占细胞壁干重的40%90%5%10%无无磷壁酸磷壁酸有（或无）有（或无）无无无无脂多糖脂多糖1%4%无无11%22%脂蛋白脂蛋白无无有或无有或无有有细菌细胞壁的结构细菌细胞壁的结构v革兰氏阳性菌细胞壁：革兰氏阳性菌细胞壁：由肽聚糖和磷壁酸组成由肽聚糖和磷壁酸组成 磷壁酸：磷壁酸：G+菌所特有,其主链由数十个磷酸甘油或磷酸核糖醇组成,有的还有由DAla和还原糖组成的侧链。肽聚糖肽聚糖:占4090%,不同菌种中肽聚糖(肽链)组分不同。细菌细胞壁的结构：细菌细胞壁的结构：v细胞壁的基本骨架细

19、胞壁的基本骨架肽聚糖肽聚糖 肽聚糖：肽聚糖：是由是由 N乙酰胞壁酸（乙酰胞壁酸（NAM）和）和N乙酰葡糖胺（乙酰葡糖胺（NAG）以及少数氨基酸短以及少数氨基酸短肽链组成的亚单位聚合而成的大分子复合体。肽链组成的亚单位聚合而成的大分子复合体。肽聚糖单体：肽聚糖单体：是由是由NAG、NAM、肽尾肽尾、肽桥构成。肽桥构成。细胞壁的基本骨架细胞壁的基本骨架肽聚糖肽聚糖细菌细胞壁的结构细菌细胞壁的结构v革兰氏阴性菌细胞壁：革兰氏阴性菌细胞壁：分内壁层和外壁层。分内壁层和外壁层。内壁层：内壁层：紧贴胞膜,仅由12层肽聚糖分子构成,占细胞壁干重5 10%,无磷壁酸。外壁层：外壁层：位于肽聚糖层外部。脂多糖;

20、脂蛋白包括:蛋白质层:基质蛋白 外壁蛋白 磷脂脱色是革兰氏染色的关键步骤。脱色是革兰氏染色的关键步骤。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而误认为革兰氏阴性菌；被脱色而误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为革兰氏阳性菌。一般被误认为革兰氏阳性菌。一般脱色时间控制在脱色时间控制在20-30S。革兰氏染色的步骤草酸铵结晶紫初染碘液媒染95%乙醇脱色番红复染涂片固定 染色看到的细菌形态是什么样的？知识拓展知识拓展 菌体呈球形或近似球形菌体呈球形或近似球形,以典型的二分裂以典型的二分裂殖方式繁殖殖方式繁殖,分裂后产生的新细

21、胞常保持一定分裂后产生的新细胞常保持一定的空间排列方式的空间排列方式.根据细胞分裂的方向及分裂根据细胞分裂的方向及分裂后的各子细胞的空间后的各子细胞的空间排列状态排列状态不同不同,可将球菌可将球菌分为以下几种分为以下几种:单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。菌、葡萄球菌等。球菌球菌(coccus)及其排列状态及其排列状态单球菌单球菌细胞分裂沿一个平面进行，细胞分裂沿一个平面进行，新个体分散而单独存在新个体分散而单独存在.如尿素微球菌如尿素微球菌(Micrococcus ureae)双球菌双球菌细胞沿一个平面分裂，新个体细胞沿一个平面分

22、裂，新个体成对排列成对排列.如肺炎双球菌如肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)链球菌链球菌细胞沿一个平面进行分裂，新个体不细胞沿一个平面进行分裂，新个体不但可保持成对的样子，并可连成链状但可保持成对的样子，并可连成链状.如：如：乳链球菌乳链球菌 （Streptococcus lactis）无乳链球菌（无乳链球菌（Streptococcus agalactiae)溶血链球菌（溶血链球菌（Streptococcus hemolyticus)四联球菌四联球菌细胞分裂是沿两个相垂直的细胞分裂是沿两个相垂直的平面进行，分裂后每四个细平面进行，分裂后每四个细胞特征性地连在一起，呈田胞

23、特征性地连在一起，呈田字形字形.如四联微球菌如四联微球菌（Micrococcus tetragenus）八叠球菌八叠球菌细胞按三个互相垂直的平面细胞按三个互相垂直的平面进行分裂后，每八个球菌特进行分裂后，每八个球菌特征性地连在一起成立方体形征性地连在一起成立方体形.如藤黄八叠球菌如藤黄八叠球菌（Sarcina ureae)葡萄球菌葡萄球菌细胞无定向分裂，多个新个体形细胞无定向分裂，多个新个体形成一个不规则的群体，犹如一串成一个不规则的群体，犹如一串葡萄。葡萄。如：金黄色葡萄球菌如：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)白色葡萄球菌白色葡萄球菌（Staphylcoccus

24、albus)杆菌杆菌(bacillus)及其排列状态及其排列状态杆菌是细菌中种类最多的类型杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。等都有所差异。杆菌的形态：杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状等；按杆菌细胞繁殖后的排列方式有链状、栅状、状等；按杆菌细胞繁殖后的排列方式有链状、栅状、“八八”字状等。字状等。短杆菌长杆菌梭状芽孢杆菌杆菌杆菌(bacillus)及其排列状态及其排列状态双杆菌链杆菌螺旋菌螺旋菌(spirilla)螺旋状的细菌称为螺旋菌。螺旋状的细菌称为

25、螺旋菌。根据其弯曲情况分为：根据其弯曲情况分为：弧菌（弧菌（vibrio)：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌例：霍乱弧菌、逗号弧菌螺旋菌螺旋菌(spirillum)：螺旋满螺旋满26环，螺旋状环，螺旋状 例：干酪螺菌例：干酪螺菌 霍乱弧菌影响细菌形态的因素影响细菌形态的因素 因素：培养时间、培养温度、培养基成分、浓度、pH值。一般处于幼龄阶段和生长条件适宜时，细菌形态正常、整齐，表现出特定的形态。在较老的培养物中，或不正常的条件下，细胞常出现不正常形态，尤其是杆菌，有的细胞膨大，有的出现梨形，有的产生分枝，有时菌体显著伸长以至呈丝状等异常

26、形态。若将它们转移到新鲜培养基中或适宜的培养条件下又可恢复原来的形态。细菌的细胞形态结构与功能显微镜下细菌的形态细菌结构的模式图知识拓展知识拓展 细菌的细胞结构的功能知识拓展知识拓展细胞结构细胞结构功能功能基本构造基本构造细胞壁细胞壁固定菌体外形，保护菌体固定菌体外形，保护菌体细胞膜细胞膜吸收排出新陈代谢物质，能量代谢，多种合成代谢场所吸收排出新陈代谢物质，能量代谢，多种合成代谢场所细胞质细胞质物质的合成分解场所，物质的合成分解场所，细胞核细胞核负载遗传信息负载遗传信息特殊构造特殊构造鞭毛鞭毛细菌的运动器官细菌的运动器官芽孢芽孢抵抗不良环境的休眠体抵抗不良环境的休眠体荚膜荚膜加强细菌的致病力，

27、养料储藏库，抗干燥作用加强细菌的致病力，养料储藏库，抗干燥作用纤毛纤毛使细菌相互黏着或附着在物体上，细菌的交配器官，传递使细菌相互黏着或附着在物体上，细菌的交配器官，传递遗传物质遗传物质知识拓展知识拓展 革兰氏染色是细菌分类鉴定的重要依据。除此之外细菌有无鞭毛,鞭毛着生的位置和数目；有无芽胞,芽胞的部位和形状；有无荚膜等，都是重要的分类依据。课后请同学们自学鞭毛、芽孢、荚膜的染色方法。总结革兰氏染色的注意点涂片时生理盐水不宜过多，涂片必须均匀，不易过厚，以免脱色不全造成假阳性。固定时涂片向上来回穿过火焰外焰2-3次，不能直接放在火焰上烤，否则温度过高细菌形态变形。革兰氏染色的关键是脱色时间，一

28、般维持在20-30S。选用培养18-24h菌龄的细菌为宜。细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌呈阴性菌。项目三 常见酵母霉菌细胞形态观察项目实训任务单实践操作知识拓展问题探究项目名称染色与酵母细胞形态观察 实训对象高职（五年）/高专(三年)学时2学时实 训目标知识目标：1.了解酵母细胞的基本形态；2了解染色的基本原理；3.理解酵母细胞结构、化学组成和生理功能能力目标：1.能熟练进行酵母的染色得到正确的结果情感目标：1.通过自主操作，提高学生发现问题,解决问题的能力2.养成良好的实验习惯进而形成良好的职业素养学习内容：一、酵母观察1.观察制片玻片的准备2.酵母涂片的制作 3.制片的观察二

29、、霉菌观察1.直接制片观察法2.载玻片培养观察重点：酵母霉菌观察制片的制作过程具体要求：1.载玻片应洁净无油渍2.取美蓝染液一滴置于玻片中央3.取样与美蓝混匀盖上盖玻片。防止气泡的生成。4.在显微镜下应观察到单细胞的颜色及形态。染色应较均匀，不应有大片背景染色区域5.直接制片观察尽可能保持霉菌自然生长状态学生基础要求：1.普通显微镜的使用基础项目实训任务单项目实训任务单实践操作实践操作 取美蓝染色液取美蓝染色液1滴，置滴，置于洁净载玻片中央。于洁净载玻片中央。在无菌操作下在无菌操作下,滴加啤酒滴加啤酒酵母少许，置于美蓝染液酵母少许，置于美蓝染液中充分混匀。中充分混匀。盖上盖玻片。取一块盖盖上盖

30、玻片。取一块盖玻片，先将盖玻片的一边玻片，先将盖玻片的一边与染液接触，然后将盖玻与染液接触，然后将盖玻片慢慢放下，再将多余染片慢慢放下，再将多余染液用吸水纸吸干。液用吸水纸吸干。镜检。镜检。在载玻片上加一小滴乳在载玻片上加一小滴乳酸石炭酸溶液。酸石炭酸溶液。以无菌操作，用接种针以无菌操作，用接种针从霉菌菌落边缘挑取少量从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，至已产孢子的霉菌菌丝，至于载玻片上的溶液中。于载玻片上的溶液中。用接种针小心地将菌丝用接种针小心地将菌丝分散开。分散开。盖上盖玻片，置低倍镜盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜下观察，必要时换高倍镜下观察。下观察。酵母形态观察霉菌形

31、态观察问题探究问题探究 1、霉菌水浸法形态观察的原理及注意点、霉菌水浸法形态观察的原理及注意点 直接制片观察法是将培养物置于乳酸石碳酸棉蓝染色液直接制片观察法是将培养物置于乳酸石碳酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。用此染液制片的特点主要是，细胞中，制成霉菌制片镜检。用此染液制片的特点主要是，细胞不变形；具有防腐作用，不易干燥能保持较长时间；能防止不变形；具有防腐作用，不易干燥能保持较长时间；能防止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差。必要时，还可用树胶封孢子飞散；染液的蓝色能增强反差。必要时，还可用树胶封固，制成永久标本长期保存。固，制成永久标本长期保存。在直接制片观察时，挑菌要细心，尽可能保持霉菌

32、的在直接制片观察时，挑菌要细心，尽可能保持霉菌的自然生长状态。尽量挑取菌落边缘的培养物，因为其菌龄自然生长状态。尽量挑取菌落边缘的培养物，因为其菌龄最年轻。在直接制片加盖玻片观察时勿压入气泡，以免影最年轻。在直接制片加盖玻片观察时勿压入气泡，以免影响观察。响观察。2、酵母细胞美蓝染色的特点及注意点 美蓝染色液着色慢，染色时间长但效果清晰。同时酵母活细美蓝染色液着色慢，染色时间长但效果清晰。同时酵母活细胞具有新陈代谢作用，使细胞内氧化还原电位低，且还原力强，胞具有新陈代谢作用，使细胞内氧化还原电位低，且还原力强，当无毒的染料进入活细胞后，可以被还原脱色，但染料进入死细当无毒的染料进入活细胞后，可

33、以被还原脱色，但染料进入死细胞及新陈代谢缓慢的老细胞后，这些细胞因无还原能力而被着色，胞及新陈代谢缓慢的老细胞后，这些细胞因无还原能力而被着色，故可以以此区分死活细胞。故可以以此区分死活细胞。知识拓展知识拓展 1、酵母的形态结构与功能 酵母细胞结构 美兰染色的酵母细胞 2、霉菌的形态结构与功能 霉菌菌丝霉菌菌丝项目四项目四 常见微生物的菌落特征观察常见微生物的菌落特征观察 微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上生长后微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上生长后表现出的群体形态特征。不同的微生物有其固有的培养特表现出的群体形态特征。不同的微生物有其固有的培养特征。在平板上主要观察菌落表面结构

34、，形态及边缘等状况。征。在平板上主要观察菌落表面结构，形态及边缘等状况。区分和识别各类微生物除了从细胞形态（个体形态）外，区分和识别各类微生物除了从细胞形态（个体形态）外，还要从菌落形态（群体形态）两方面进行，菌落形态是无还要从菌落形态（群体形态）两方面进行，菌落形态是无数细胞形态的集中反映，因此，每一大类微生物都有其一数细胞形态的集中反映，因此，每一大类微生物都有其一定的菌落特征，可通过这些特征差异区分和识别之。定的菌落特征，可通过这些特征差异区分和识别之。项目实训任务单实践操作问题探究知识拓展项目四项目四 常见微生物的菌落特征观察常见微生物的菌落特征观察项目名称常见微生物菌落形态观察 实训

35、对象高职（五年）/高专(三年)学时2学时实 训目标知识目标：1.了解酵母霉菌细菌菌落的基本形态；2知道菌落定义能力目标：1.能根据菌落特征对微生物做出初步判定情感目标：1.通过自主操作，提高学生发现问题,解决问题的能力2.养成良好的实验习惯进而形成良好的职业素养学习内容：1.细菌菌落特征2.酵母菌落特征3.霉菌菌落特征重点：对各种菌落进行区别具体要求：1.认真观察各培养物2.规范及时填写记录表 学生基础要求：1.普通显微镜的使用基础实训材料与仪器：普通光学显微镜、放大镜、酵母，细菌，霉菌等平板培养物等项目实训任务单项目实训任务单实践操作实践操作借助放大镜分别观察各类微生物的菌落的大小，表面粗糙

36、及含水分状借助放大镜分别观察各类微生物的菌落的大小，表面粗糙及含水分状况，边缘，致密程度，透明程度及厚度等特征。并填写记录表。况，边缘，致密程度，透明程度及厚度等特征。并填写记录表。根据观察结果总结各类微生物菌落的一般特征。根据观察结果总结各类微生物菌落的一般特征。铜绿假单胞杆菌啤酒酵母金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌青霉链霉菌黑曲霉菌落特征大小表面边缘致密程度厚薄程度透明程度色泽细菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌放线菌链霉菌真菌啤酒酵母青霉黑曲霉问题探究问题探究 群体培养特性是微生物分类鉴定的依据 菌落是指在固体培养基上以母细胞为中心不断分裂繁殖所形成的子细胞群体。而每一大类微生物都有不同的群

37、体形态表现。所以菌落特征是微生物分类鉴定的依据。知识拓展知识拓展 常见微生物菌落特征比较 微生物群体培养的其他形式 在半固体培养基上观察穿刺培养后的生长及运动情况。在液体培养基中，观察液体是否混浊、表面有无菌膜、管底有无沉淀、管中有无气泡、培养液有无颜色变化等。培养特征也作为纯培养是否被污染的参考。不同种属的微生物其酶系统、代谢途径和代谢产物的差异较大，这就为微生物的理化鉴定提供了方便。实践中常通过一些特殊的反应来测定某种产物或酶，如乙酰甲基甲醇试验、甲基红试验、硫化氢生成、过氧化氢酶产生试验等，依据试验结果则可将不同的微生物区别开来。项目五项目五 生理生化鉴定技术生理生化鉴定技术 在微生物鉴

38、定中，一般先根据几项简单的性质，如微生物要求的培养条件、要求的培养基、是否产生色素等，来判断所鉴定的微生物属于哪一大类，然后全面考察这一大群内各属间的异同，选择合适的鉴别特征，制定出鉴定方案。鉴别到属后，再依据各种间的异同，进一步鉴定到种。糖发酵试验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如：大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；沙门氏菌只能分解葡萄糖，产酸不产气，而不能分解乳糖。项目实训任务单 实践操作

39、 问题探究 知识拓展项目名称生理生化鉴定技术（糖发酵试验）实训对象高职（五年）/高专(三年)学时4学时实 训目标知识目标：1.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的作用能力目标：1.掌握糖发酵鉴别不同微生物的方法情感目标：1.通过自主操作，提高学生发现问题,解决问题的能力2.养成良好的实验习惯进而形成良好的职业素养学习内容：1.试验培养基，仪器的准备2.试管编号2.接种3.培养4.观察结果重点与难点:观察结果的鉴别具体要求：1.准备的培养基内小导管中应不气泡。2.编号应清晰符合要求，注明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。学生基础要求：1.了解无菌接种技术实训材料与仪器：大肠杆菌、普通变形杆菌、枯

40、草芽孢杆菌试管斜面、葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管（内装有倒置的德汉氏小管），接种环，试管架等实践操作 编号 用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。接种 取盛有葡萄糖发酵培养基的试管3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。将上述已接种的葡萄糖和乳糖发酵试管和对照管置37温室中培养24小时。观察结果。问题探究 1、结果判定变色培养基遇酸变色变色则为阳性（+）培养基不变色不变色则为阴性（-）若培养基中加有溴麝香草酚蓝遇酸则由蓝变黄；若培养

41、基中加有溴麝香草酚蓝遇酸则由蓝变黄；若是加有溴甲酚紫遇酸则由紫变黄；若是加有溴甲酚紫遇酸则由紫变黄；若是加有酚红遇酸则由红变蓝。若是加有酚红遇酸则由红变蓝。气体若有气体气体产生，则倒立小管出现气泡气泡 动力若接种菌有动力动力，培养物沿穿刺接种线呈弥漫生长 左边两根试管为（+）右边两根试管为（-）2、在放置德汉氏小管时注意不能有气泡，防止影响后面观察。培养液灭菌后产生的气泡这种发酵管不能使用。3、其他糖（醇）类发酵试验结果卫茅醇发酵实验 阳性 阳性 阴性 甘露醇发酵实验阴性 阳性 鼠李糖发酵实验 阴性 阳性 知识拓展知识拓展 1、常规的生理生化鉴定试验 不同种属的微生物其酶系统、代谢途径和代谢产

42、物的差异较大，这就为微生物的理化鉴定提供了方便。实践中常通过一些特殊的反应来测定某种产物或酶，如乙酰甲基甲醇试验、甲基红试验、硫化氢生成、过氧化氢酶产生试验等，依据试验结果则可将不同的微生物区别开来。在微生物鉴定中，一般先根据几项简单的性质，如微生物要求的培养条件、要求的培养基、是否产生色素等，来判断所鉴定的微生物属于哪一大类，然后全面考察这一大群内各属间的异同，选择合适的鉴别特征，制定出鉴定方案。鉴别到属后，再依据各种间的异同，进一步鉴定到种。总的来讲，微生物的理化鉴定技术包括生生长环境特性试验长环境特性试验（生长温度测定、生长pH测定等），营养物质利用能力试验营养物质利用能力试验（碳源的利

43、用试验，氮源的利用试验等），代谢代谢产物试验产物试验（乙酰甲基甲醇试验VP，硫化氢的生成试验，吲哚试验，甲基红试验MR，淀粉水解试验，明胶液化试验等）。2、微生物生理生化特性也被作为细菌鉴定和分类的内容 微生物的分类鉴定除了利用我们前面所提到的形态特征，培养特征，生理生化特征外，还包括微生物的生态特性，化学组成，血清学反应，遗传学特性等，都可作为分类的依据。例如霉菌的细胞壁主要含有几丁质,而细菌细胞主要是肽聚糖等；根据血清学反应的基本原理,用已知菌种、菌型制成抗血清,然后根据它们与待鉴定微生物是否发生特异性的血清学反应,来确定未知菌种或菌型；随着分子生物学的发展和先进技术的应用,微生物的脂肪酸

44、组成、磷脂质组成、细胞色素、酶和蛋白质的电泳图谱、DNA的碱基组成、5S核糖体RNA序列等也都作为微生物的分类依据。分类和鉴定分类和鉴定 分类：是解决从个别到一般或从具体到抽象的问题，亦即通过收集大量有关个体描述的资料，经过科学的归纳，整理成一个科学的分类系统。鉴定：其和分类正好相反，是从一般到特殊或抽象到具体的过程，亦即通过详细观察和描述一个未知名称纯种微生物的各种性状特征，然后查找现成的分类系统，以达到知类辨名的目的。微生物分类和命名简介(一)种以上系统分类单元 在这七级中，在必要时每一级都可有若干辅助单元，故共可有十余级。同时分类系统是不断发展的，特别是 对于系统发育的研究发展迅速，目前

45、存在着五界分类系统、三原界分类系统、二域八界分类系统等。（二）种的概念 一般，同一种微生物，其种内各菌株间的G+Cmol%值可相差2.5%4.0%，相差过少（低于2%），则没有分类学上的意义；若相差在5%以上，可认为已是两个不同的种了。对于G+Cmol%值相差在5%以内的菌株，要通过DNA-DNA分子杂交法来确定它们之间的关系，实验表明菌株间DNA同源性在70%以上者，属于种的水平；在20%以上者，则可能属于属的水平（另，约翰逊1981年的试验指出，DNA-DNA杂交同源性在60%以上的菌株可视为同一个种，同源性低于20%者为不同属的关系，同源性在20%60%之间可视为属内紧密相关的种。）。定

46、义：种是一个基本分类单位，是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有明显差异的菌株的总称。在微生物中，一个种只能用该种内的一个典型菌株作为具体标本，它就是该种的模式种。(例如：Bifidobacterium bifidum,ATCC 29521)（三）学名 命名的方法：国际法规命名，即林奈所创立的双名法。双名法的规则：学名通常由一个属名加一个种的加词构成。由两个拉丁字或希腊字或拉丁化了的其它文字组成，属名在前，为名词，开头字母大写，是该微生物的主要特征。种名在后，为形容词，开头字母小写。两者均须斜体。例：大肠埃希氏菌 Escherichia coli（Migula）Caste

47、llani et Chalmers 1919 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus Rosenbach 1884（四）亚种以下的分类单元1.亚种（subspecies,subsp.,ssp.）2.变种（variety,var.）3.型（form）在亚种以下的“型”曾用于表示细菌菌株，但已经废除。“型”可做后缀使用。亚种以下的各种型5.菌株（strain）食品微生物的分类和鉴定工作，主要涉及鉴定工作。现在人类对各种微生物已经进行了系统的分类。并且建立了对已发现微生物的系统分类表。在鉴定未知微生物时，要具备三个条件：微生物鉴定技术简介1.待鉴定的菌种一定是纯种 如果菌种不纯，

48、所观察到的现象则是混合现象，这样自然不会得到正确的结果。因此，在鉴定之前，首先要将菌种纯化。纯化方法一般有两种：一是平板划线单菌落分离法，一是单细胞分离法。前一种操作简便，效果良好，使用范围广。具体的纯化方法将在模块二中详细介绍。2.根据鉴定对象，选一本比较好的鉴定手册 鉴定时以此手册为标准，开展鉴定工作。根据多数人的经验，在细菌鉴定方面使用伯杰氏鉴定细菌学手册一书较为合适。在具体鉴定时，可参看中国科学院微生物研究所细菌分类组编著的一般细菌常用鉴定方法一书。在放线菌鉴定方面，可以参看中国科学院微生物研究所分类组编著的链霉菌鉴定手册一书。真菌的鉴定，可以参看中国科学院微生物研究所编著的常见与常用

49、真菌一书。3.要有合适的鉴定方法。微生物种类繁多，特征各异，性状有主次之分。因此，在鉴定某种微生物时，要选用合适的鉴定方法，确定主要的测试项目。鉴定的微生物若是霉菌，则菌落形态观察十分重要；若是酵母菌，有性繁殖的方式和生理生化特征中的糖的发酵和同化、硝酸盐的同化就是主要指标。待鉴定微生物的分离纯化形态结构和培养特性观察生理、生化试验蛋白质分析DNA同源性和G+C百分含量23S,16S,5S rRNA 序列相似性分析寡核苷酸编目分析细胞壁组分分析血清型分析细胞脂肪酸分析查阅相关手册，或通过软件用数值分类法分类、定名鉴定的一般步骤为：注意：1.血清学技术可以用于鉴定菌株，而不是鉴定属或种。2.蛋白质电泳模型对于确定种很有用，但不能区分属或科。3.DNA杂交及G+C含量分析可以用于研究种和属。4.化学组成、DNA探针技术、rRNA序列、和DNA 序列能用于定义种、属和科。5.应依据多个性状的信息综合判断。6.对于一般实验室或临床等实践上的菌种鉴定，作常规鉴定时仍沿用传统鉴定中的各种指标，目前已基本采用商品化的鉴定系统。