1、第3课时微生物数量的测定第1章微生物技术学习导航1.阅读教材P17内容，概述测定某种微生物数量的方法和步骤。2.结合教材P1517“测定土壤中微生物的数量”实验，掌握使用平板菌落计数法测定土壤中微生物的数量。重难点击1.掌握测定某种微生物数量的方法和步骤。2.学会使用平板菌落计数法测定土壤中微生物的数量。一、微生物数量测定的方法和原理二、土壤中尿素分解菌数量的测定内容索引当堂检测一、微生物数量测定的方法和原理基础梳理微生物数量的测定也是重要的微生物技术之一，平板菌落计数法是一种应用广泛的微生物数量测定方法。1.平板菌落计数法的原理：根据微生物在高度稀释的条件下，培养基上所形成的单个菌落，是由
2、繁殖而成的，即一个菌落代表。2.计算方法：从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是：同一稀释度的菌落平均数0.2稀释度10。固体一个单细胞一个单细胞3.优缺点(1)优点：能测出样品的 数，可用于微生物的选种与 、分离纯化及其他方面的测定。(2)缺点：操作烦琐、时间较长、测定值常受各种因素的影响。4.该方法统计的菌落数比活菌的实际数目低，这是因为_ 。活菌育种当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落1.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？答案答案土壤中各种微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离。问题探究答案答案2.平板菌落计数法(
3、1)平板菌落计数法根据操作步骤的不同可分为哪两种？答案答案涂布平板法：用灭过菌的涂布器将一定量(一般为0.1 mL)的适当稀释过的菌液涂布在琼脂培养基的表面，然后保温培养直到菌落的出现。记录菌落的数目并换算成每毫升样品中的活细胞的数量。倒平板法：将已知体积(0.11 mL)的适当稀释过的菌液加到灭过菌的培养皿内，然后倒入溶化后冷却至45 的琼脂培养基，水平晃动混匀，待凝固后保温培养到出现菌落，然后与涂布平板法同样计数。(2)平板菌落计数法中换算样品的含菌数依据什么数据换算？答案答案依据稀释倍数、取样接种量和菌落数。(3)每隔多少小时统计一次菌落数目？应选取菌落数目何时(稳定时或不稳定时)的记录
4、作为结果？答案答案每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。(4)统计菌落时，要求细菌和放线菌每皿的菌落数目范围是多少？霉菌每皿的菌落数目范围是多少？答案答案若测定细菌和放线菌，要求每皿以30300个菌落为宜，若是霉菌则以每皿10100个菌落为宜。答案归纳归纳总结总结要使平板菌落计数法准确，需要掌握的关键步骤有：严格的无菌操作，否则容易被杂菌污染；稀释液要充分混匀，吸量准确，否则结果不准确；多做几个重复实验，减少误差。拓展应用1.用平板菌落计数法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是A.菌落数量最多的
5、平板B.菌落数量最少的平板C.菌落数量适中的平板D.取若干个平板菌落数量的平均值答案解析解析解析用平板菌落计数法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌体数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌体数的真实值。2.若某一稀释度下，平板上生长的平均菌落数为80，涂布平板时所用的稀释液体积为0.1 mL，稀释液的稀释倍数为106，则每克样品中的活菌数约为A.8108 B.8107C.8105 D.8106解析解析每克样品中的活菌数(800.1)106。答案解析二、土壤中尿素分解菌数量的测定基础梳理土壤中含
6、有种类繁多的微生物，不同微生物的数量有差别，我们通过实验来测定土壤中尿素分解菌的数量。1.下面是土壤中尿素分解菌培养使用的培养基的配方，请分析：下面是土壤中尿素分解菌培养使用的培养基的配方，请分析：成分用量尿素20 g酵母粉0.1 g磷酸二氢钾9.1 g磷酸氢二钠9.5 g酚红0.01 g琼脂20 g加热溶解后，用1 mol/L NaOH溶液调pH至7.27.4，补加蒸馏水定容至1 000 mL(1)在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是 ，提供氮源的是 ，琼脂的作用是 。(2)微生物要利用尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微生物不能利用尿素。因此该培养基对微生物具有选择作用，其选择机制是
7、_ 。酵母粉尿素凝固剂只有能够分泌脲酶从而以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长(3)细菌合成的脲酶分解尿素产生了氨，使培养基的碱性增强，pH上升，使酚红变色，菌落周围变 。可用来鉴定选出的菌落是不是尿素分解菌。红2.结合下图分析实验过程和注意事项结合下图分析实验过程和注意事项步骤实验操作操作提示制备培养基分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以_为唯一氮源的 培养基牛肉膏蛋白胨培养基可以作为 ，用来判断选择培养基是否起到了_制备土壤样品稀释液称取土样 g，放入盛有 mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中，充分摇匀；吸取上清液 mL，转移至盛有 mL的生理盐水的无菌大试管中，按照上图流程进行样品的稀释，依
8、次制成稀释度为101、102、103、104、105、106的稀释液应在 旁称取土样；要充分摇匀尿素选择对照选择作用109019火焰加样取10套无菌培养皿，取 、_和 不同稀释度分别做3个重复平板，留下一个平板做空白对照。每皿接种稀释菌液各0.2 mL实验时要对所用的平板、试管作好 。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、培养物等倒平板将菌液移入培养皿后立即倒入溶化并冷却至 左右的尿素培养基(倒入量为15 mL)，平置，待凝倒平板时要晃动培养皿，使_ 混合均匀培养将涂布好的培养皿放在 温度下培养在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数目，才说明选择培养基有选择作用104105
9、106标记稀释度45菌液和培养基37多于计数当菌落数目 时，选取菌落数在_ 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对 个平板进行重复计数，然后求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目如果学生选取的是同一种土样，结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因稳定303003平均值1.试写出测定土壤中尿素分解菌数量的实验流程。答案答案制备尿素固体培养基制备土壤样品稀释液加样倒平板培养统计菌落数计算样品中的菌数。2.甲、乙两位同学用平板菌落计数法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为23
10、0，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？答案答案不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。问题探究答案(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？答案答案不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。答案(3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。平板稀释度平板1平板2
11、平板3103320360356104212234287105212318答案答案104的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30300之间，计算其平均值为(212234287)/3244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为2440.1104102.44108。答案答案(4)为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低？答案答案当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。答案3.微生物数量测定的实验设计(1)如果平板上长出的菌落不是均匀分散的，而是集中在一起，可能的原因有哪些？答案答案菌体密度太大；倒平板后没有立即摇匀；平板冷凝水太多。(2)同一个稀释度的3个平板上的细菌的数目
12、应该比较接近，如果长出的菌落数差别较大，可能的原因有哪些？答案答案取样不准确；稀释不均匀；倒平板操作时培养基温度差别较大等。(3)实验中的无菌操作主要有哪些？答案答案培养基、锥形瓶、试管、铲子、信封等，需要进行灭菌。称取土壤要在火焰旁进行。稀释土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁进行。归纳归纳总结总结分离尿素分解菌操作中的注意事项(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍稀释液，放线菌一般为103、104、105倍稀释液，真菌一般为102、103、104倍稀
13、释液。(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。拓展应用3.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是答案A.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数一定恰为5号的10倍B.5号试管的结果表明每克该土壤中的菌株数目为1.7108个C.在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时，可用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与无菌水充分混匀D.某一稀释度下至少涂布3个平板，该实验方法统计得
14、到的结果常会比实 际活菌数目高4.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。(1)实验步骤制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。为了得到更加准确的结果，应选用_法接种样品。适宜温度下培养。涂布分离答案(2)结果分析测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是_。A.一个平板，统计的菌落数是230B.两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240C.三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值
15、289D.四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每克样品中的活菌数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_。用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量_(填“多”或“少”)，因为_。答案解析问题导析1.06109个多当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落返回上页答案问题导析问题导析(1)因为题中操作的目的是对大肠杆菌进行数量的测定，所以接种的方法是 。(2)测定活菌数量时，选择的平板越多误差 ，且选择的平板要能形成 个菌落。(3)所做的多个平板中，如果
16、其中一个平板中菌落的数目明显_其他几个平板，则说明该平板不符合要求，应 或舍弃。涂布分离法越小30300多于或少于重做返回上页解析解析(1)若对大肠杆菌进行计数，则需要用涂布分离法接种样品。(2)应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数，取其平均值。2120.21061.06109(个)。因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。一题多变一题多变(1)如果某同学的稀释倍数仅为104，则测定的数值要比题中测定的数值高还是低？为什么？答案答案低。因为稀释倍数太低，则大部分菌落是由多个细菌繁殖而成，所以测定的菌落的数值要偏低。(2)第(2)问第小题C项中菌落数
17、为400的平板不符合要求，试分析该平板中菌落数目多于其他平板的可能的原因。答案答案培养基被污染，一些菌落是由杂菌繁殖而成的；接种过程中由于操作不当感染了杂菌；取菌液时没有摇晃，导致所取菌液中细菌个体浓度偏大等。答案方法链接方法链接用平板菌落计数法计数微生物的方法用平板菌落计数法计数微生物的方法(1)涂布分离法操作要求：按照平行重复的原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30300之间的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。课堂小结平板菌落稀释液倒平板菌落当堂检测1.通常用
18、来作为菌种鉴定的重要依据是A.菌落 B.细菌形态C.细菌体积 D.细菌结构解析解析细菌个体非常小，不易直接观察，不同细菌菌落的形态特征不同，而且可以用肉眼观察，因此常作为鉴定菌种的依据。23451答案解析2.下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、琼脂、水C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、尿素、琼脂、水D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水答案234513.请选出下列正确的操作步骤土壤取样称取10 g土
19、壤，取出放入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布依次制成101、102、103、104、105、106稀释度的稀释液A.B.C.D.答案234514.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是A.将土壤用无菌水稀释，制备103106土壤稀释液B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上C.用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株解析解析从土壤中分离以尿素为氮源的细菌时，将土壤用无菌水稀释，制备土壤稀释液，将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上，用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌；
20、从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株。答案23451解析5.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：23451KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g葡萄糖10 g尿素1 g琼脂15 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL23451(1)此培养基能否用于植物组织培养？_，理由是_。解析解析配制培养基需要根据培养
21、生物的营养需求情况，确定其成分及比例。植物组织培养需要有满足植物细胞生长所必需的营养和植物激素等条件，题目所给培养基中缺少植物激素，不能用于植物组织培养。培养基中加入尿素是为了能够筛选出能分解尿素的细菌，依据用途划分，此培养基属于选择培养基。尿素提供氮源，葡萄糖提供碳源。在实验中振荡培养可增加培养液中的氧含量，为培养的目的菌提供必需的氧气。否缺少植物激素(或缺少植物需要的各种营养)答案解析答案23451(2)培养基中加入尿素的目的是筛选_，这种培养基属于_培养基(依据用途划分)。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的_和_，实验需要振荡培养，原因是_。(4)简述土壤中可分解尿素的细菌的鉴定方法及原理：_。目的菌选择尿素葡萄糖为目的菌提供氧气在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，pH增高，使酚红指示剂变红
