1、临床输血与检验临床输血与检验 红细胞血型检测红细胞血型检测.1主要内容 输血前免疫学检查输血前免疫学检查 盐水介质试验技术盐水介质试验技术 酶处理试验技术酶处理试验技术 抗球蛋白试验技术抗球蛋白试验技术 聚凝胺介质试验技术聚凝胺介质试验技术 微柱凝集试验技术微柱凝集试验技术 吸收放散技术吸收放散技术 凝集试验技术凝集试验技术 红细胞血型分子生物学检测技术红细胞血型分子生物学检测技术.2第一节第一节 输血前免疫学检查输血前免疫学检查目的：使输入的血液成分在受血者的体内发挥其有效作用.在正常情况下，输入的红细胞在受血者体内不溶血，输入的的血浆成分不破坏受血者的红细胞。主要程序：受血者血液标本的处理
2、、ABO血型和RhD血型鉴定、红细胞同种抗体筛查和鉴定、交叉配血。.3一、受血者标本的处理一、受血者标本的处理（一）标本的采集 输血除了需要达到预期的治疗效果外，必须确保输血安全。血样由临床护士完成，应严格遵守一次只能为一位受血者抽取标本，标本不得从输液管或输液侧筋脉中抽取。（二）标本的接收 输血科技师接收血样标本时，应认真核对受血者的相关信息，尽可能了解受血者有无输血史、药物史、妊娠史等情况。如果有输血史，这有必要进一步了解最后一次输血的日期，若3个月内输过血，那么供血者的红细胞没有完全代谢消失，可能依然存在于血液循环中，导致血型定型试验中出现混合凝集的结果。.4（三）标本的要求1.对输血前
3、检查的血液标本应严格要求能代表受血者当前的免疫学状况，标本还需经鉴定和标记，保证其准确无误地来自受血者和供血者，应和血液申请单上的内容一致。2.防止受血者血液标本稀释和（或）溶血，若采集过程中发生溶血则不能使用。3.受血者配血试验的血液标本必须是输血前3天内采集的。4.若受血者使用右旋糖酐、PVP等治疗，应注意洗涤被检红细胞。5.每次输血后，受血者和供血者的标本必须保存于28至少7天。.5二、受血者和供血者二、受血者和供血者ABOABO和和RhRh定型定型 （一）、原理 根据红细胞膜表面上有无A 抗原或B抗原，将血型分为 A型、B型、AB型、O型4种。A型人血清中含有抗-B抗体，B型人血清中含
4、有抗-A抗体，O型人血清中含有抗-A抗体和抗-B抗体，AB型人血清中不含ABO抗体。正定型：用抗-A及抗-B试剂与被检红细胞反应，检测红细胞 表面是否存在A抗原或B抗原。反定型：用标准A细胞及B细胞与被检血清反应，检测血清中是否存在抗体。由于ABO血型系统抗体多数为IgM类，在室温盐水介质中就能出现明显的凝集反应。.6.7 正反定型不符分析的基本程序：1、重新采集标本 2、查询受血者既往病史、输血史和用药史等 3、新鲜生理盐水多次洗涤标本和试剂红细胞 4、应用抗-AB、抗-A1和抗-H检测红细胞 5、分析O型筛选细胞检测结果.8 反定型的意义：1、复检正定型结果的准确性 2、发现具有弱抗原的亚
5、型 3、纠正因红细胞抗原减弱而造成的血型错误 4、排除获得性抗原和冷凝集现象的干扰 5、发现一些亚型中的不规则抗体.9ABO定型 最适的反应温度为4，但在室温反应良好，所以常规的ABO定型试验仅在室温进行。1、定型方法：正、反定型的试管离心方法目前仍被认为是最可信赖的ABO定型方法。1)定型试剂：有些ABO血型诊断试剂是以人的血清汇聚而制成的，但必须具备以下条件：第一，高效价(1：128)的IgM抗A或抗B。第二，具较好的亲和性并不含冷凝集素。第三，必需具有检测A2，A2B血型的能力。第四，血清必须通过HIV，HCV，HBV等检查或经病毒灭活。另外一些ABO定型试剂是由来自培养细胞株的单克隆抗
6、体所制成。.102)ABO亚型的鉴定：ABO亚型的鉴定通常使用下列试剂：抗A、抗B、抗A1、抗H、抗AB、A1红细胞、A2红细胞、B型红细胞和O型红细胞。有些工作者在定型试验中，常规地选择应用抗AB抗血清，以避免错误地把弱反应性A或B型红细胞分类为O型。一般抗AB试剂对Ax型红细胞可增加凝集反应的强度。.11ABO定型试验中的常见问题：造成这种正反定型不一致的原因主要有：1)技术和管理错误：这是ABO定型中产生异常结果的主要原因，包括：标本或试剂搞错；器材不洁；试剂污染或失效；离心过度或不足；阳性反应产生溶血现象未能识别；漏加试剂；结果记录或判断错误；细胞与血清间比例不适当。2)血清异常：血清
7、蛋白引起缗钱状形成，影响反定型结果。3)红细胞致敏：受免疫球蛋白致敏的红细胞，在含高蛋白介质的试剂中，可发生凝集。4)异常基因型：ABO亚型的检查中，A、B抗原可能为弱抗原，难以检出。.125)近期输血：试验前曾输入过其它ABO血型不一致的血液，使血液标本成为混合血型的红细胞悬液，定型时显示“混合外观凝集”现象。6)嵌合体血型：这种血型者体内有两类血型红细胞群体，定型时可以出现“混合外观凝集”现象。7)疾病因素导致抗原减弱：某些白血病患者和难治性贫血患者中，ABO血型系统的抗原性可受到抑制，检出困难。8)红细胞多凝集现象：红细胞因遗传或获得性的表面异常，发生多凝集现象。9)获得性B：由于革兰阴
8、性杆菌的作用，红细胞可获得“类B”的活性。.1310)血型特异性物质过高：一些卵巢囊肿病例，血型物质的浓度很高，可中和抗A和抗B定型试剂，要得到正确的正定型结果，必须洗涤红细胞多次。11)近期内进行大量的血浆置换治疗：由于使用大量的非同型的血浆作置换治疗，标本血清中含有所输供体提供的抗A或抗B抗体，造成反定型错误。12)异常的血浆蛋白：受检者血浆中异常的白蛋白、球蛋白比例和高浓度的纤维蛋白原等导致缗钱状形成，造成假凝集现象。13)不规则抗体的存在：受检者血浆中，含有ABO血型抗体以外的不规则抗体，与试剂红细胞上其他血型抗原系统的抗原起反应。.14 14)低丙种球蛋白血症：低丙种球蛋白血症(丙种
9、球蛋白量减低)病例，可能会因免疫球蛋白水平下降而使血清定型时不凝集或弱凝集反应。15)药物等因素：药物、右旋糖醉及静脉注射某些造影剂可引起红细胞凝集或类似凝集。16)年龄因素：免疫系统尚未健全的婴儿、由母亲被动获得抗体的婴儿，或抗体水平下降的老人，试验时可出现异常的结果。17)防腐剂因素：患者体内可能含有对防腐剂中的成分或对混悬介质的抗体，导致ABO定型差错。.15Rh(D)定型和定型试验中应注意的问题：Rh定型主要鉴定D抗原（IgG抗D和IgM抗D）。Rh系统是最为复杂得多一个系统，涉及临床的主要有D、C、c、E、e五个抗原，其中D抗原的免疫原性最强，仅次于A或B抗原。Rh血型鉴定方法有：玻
10、片法、试管法、微量板法、微柱凝胶法等，试管法最为经典。目前大部分医院都使用微柱凝胶卡式血型鉴定，方法简便快捷，准确度较高。.16.17导致Rh血型鉴定可能出现假阳性的原因：1)受检细胞已被免疫球蛋白致敏，或标本血清中含有引起红细胞凝集的因子。2)受检细胞与抗血清孵育的时间过长，含高蛋白的定型试剂会引起缗钱状形成。3)标本抗凝不当，受检过程中出现凝血或小的纤维蛋白凝块，误判为阳性。4)定型血清中含有事先未被检测的其它特异性抗体，造成假阳性定型结果。5)多凝集细胞造成定型的假阳性。6)鉴定用器材或抗血清被污染，造成假阳性。.18 可能出现假阴性的原因 1)受检细胞悬液浓度太高，与抗血清比例失调。2
11、)漏加或错加定型血清。3)定型血清的使用方法错误，没有按说明书进行。4)离心后重悬细胞扣时，摇动用力过度，摇散微弱的凝集。5)抗血清保存不当，导致失效。.19 弱D型(Du型)血型及其鉴定：Du型抗原是RhO(D)的弱抗原，这种抗原通常与大部分盐水抗D试剂不产生直接凝集反应，而与部分的IgG抗D血型用间接抗球蛋白试验反应阳性。因此当我们初次得到Rh阴性结果时，必须进行作Rh阴性确认试验，即用三种不同批号的IgG抗D定型，如果全部阴性方可认为该被检者为Rh阴性，否则，只要有一批为阳性，则可认为是Du型。弱D人群作为献血者按照RhD阳性对待，其血液只能给Rh阳性受血者输注；作为受血者按照RhD阴性
12、对待，只能接受RhD阴性血液。.20三、不规则抗体筛选和鉴定三、不规则抗体筛选和鉴定定义：不规则抗体是指血清中抗-A、抗-B以外的其他血型抗体，也称意外抗体。不规则抗体包括同种抗体和自身抗体。自身抗体：受血者体内产生的抗体，针对自己本身的红细胞抗原。同种抗体：不只针对自身抗原，也会同种异型抗原发生反应。.21不规则抗体的筛查方法不规则抗体的筛查方法 抗体筛选试验的原则是让受检的血清与已知血型的试剂红细胞即筛选红细胞起反应，以发现在37中有反应的抗体1.盐水介质法：主要用于IgM类抗体的筛查。优点是：方法简单、操作简单、成本低廉。缺点是：灵敏度低2.聚凝胺法：优点：与水盐介质法比灵敏度有所提高。
13、3.抗球蛋白试验：缺点：操作繁琐、工作量大、耗时等。4.酶法：能暴露隐蔽抗原，增强一些稀有抗原检测。但可能 会破坏有些抗原，影响检测。目前临床是已不常使用。5.微柱凝胶卡式检测法.22不规则抗体的鉴定不规则抗体的鉴定 一旦抗体被检出，应作抗体鉴定试验，以确定其特异性。抗体鉴定实验包含以下主要内容：(1)自身细胞检查：观察患者(受者)的血清与患者(受者)自身细胞的反应情况，确定血清内是否有自身抗体或自身抗体和同种抗体二者同时存在。(2)普红细胞：使用试剂细胞中的谱细胞，应用各种抗体检查技术，检测患者的血清，确定其抗体的特异性。.23四、交叉配血试验四、交叉配血试验要求和内容要求和内容 交叉配血的
14、要求：交叉配血的要求：.24 交叉配血试验的内容交叉配血试验的内容.25 交叉配血的目的交叉配血的目的.26结果的解释及处理1.抗体筛查阴性，交叉配血相容：绝大部分标本抗体筛查阴性，交叉配血也是相容的。2.抗体筛查阴性，主侧交叉配合试验阳性（1）复查血型（2）主侧凝集类B抗原（3）血清中可能含有一种ABO抗体，必要时可以做ABO亚型鉴定.273.抗体筛查试验阳性，主侧交叉配合试验阳性（1）自身对照试验阴性：受血者体内有同种不规则抗体。（2）自身对照试验阳性：受血者血清内可能有自身抗体或同时存在不规则抗体。.28影响因素影响因素 离子干扰 温度 操作不规范 离心不当 .29第二节第二节 盐水介质
15、实验技术盐水介质实验技术 盐水介质试验技术常用于血型鉴定、血清中IgM类抗体的筛查和鉴定、盐水介质的交叉配血等。基本方法基本方法1.平板法 用于ABO血型和RhD抗原的定型 特点：简单、快速，但易污染环境。2.试管法 为定型试验方法，也可于半定量试验。是输血 前检验最常用的试验方法。特点：简单、快速、易学，结果准确、可靠。3.微孔板法 为定性试验方法。.30 盐水介质配血方法盐水介质配血方法患患者者献献血血者者主主侧侧次次侧侧.31.32第三节第三节 酶处理实验技术酶处理实验技术 原理：在酶的作用下切断带有负电荷的羧基基团的唾液酸，降低Zeta电位，缩短红细胞之间的距离。增强IgG抗体对红细胞
16、的凝集。常用对的酶：木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，无 花果蛋白酶等.33 酶介质配血方法酶介质配血方法.34.35结果的判断结果的判断（1）阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管凝集为阳性，不出现凝集判定为阴性。（2）阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，实验失败分析原因，重新实验。.36第四节第四节 抗球蛋白实验技术抗球蛋白实验技术基本原理基本原理 抗球蛋白试验（Coombs实验）主要用于检测血清中的不完全抗体如：IgG、IgA和（或）补体如：C3、C4。在盐水介质中，不完全抗体只能致敏红细胞，而不能使红细胞出现可见的凝集反应，加入抗球蛋白试剂后，抗球蛋白分子的Fab片段与红细胞表面的受体结合
17、，而产生红细胞凝集，因此采用此方法可以检测出血清中是否存在不完全抗体。.37抗球蛋白试验原理图抗球蛋白试验原理图.38分类及应用分类及应用 抗球蛋白试验抗球蛋白试验直接直接间接间接致敏红细胞的不完全抗体、补体致敏红细胞的不完全抗体、补体血清中的不完全抗体血清中的不完全抗体应用应用直接：直接：HDN的诊断、的诊断、AIHADE的诊断、药物诱发型溶血病的诊断的诊断、药物诱发型溶血病的诊断间接：交叉配血及血型鉴定、器官移植、等间接：交叉配血及血型鉴定、器官移植、等.39 抗球蛋白配血方法抗球蛋白配血方法.40 .41结果的判断结果的判断直接抗球蛋白试验：直接抗球蛋白试验：（1）阳性对照管凝集，阴性对
18、照管不凝集，被检管）阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管凝集，判定为阳性。凝集，判定为阳性。（2）阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管）阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管不凝集，须做阴性确认后判定结果。不凝集，须做阴性确认后判定结果。（3）阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，）阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，结果不可信不能发出报告，分析原因后重做试验。结果不可信不能发出报告，分析原因后重做试验。.42间接抗球蛋白试验：间接抗球蛋白试验：（1）阳性对照管呈现凝集反应，阴性）阳性对照管呈现凝集反应，阴性对照管不呈现凝集反应，被检管呈现对照管不呈现凝集反应，被检管呈现凝集反
19、应为阳性结果，表示被检者血凝集反应为阳性结果，表示被检者血 清中含有抗体。清中含有抗体。（2）阳性对照管不凝集和（或）阴性）阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管出现凝集，实验失败，分析原对照管出现凝集，实验失败，分析原因重做试验。因重做试验。.43第五节第五节 聚凝胺介质实验技术聚凝胺介质实验技术 聚凝胺实验技术是一种快速、简便检测红细胞不完全抗体的方法，可用来检测IgG抗体，但IgG抗体的抗-K抗体除外。一、实验原理 凝聚胺（凝聚胺（polymatchingpolymatching）法首先利用低离子介质降低溶液）法首先利用低离子介质降低溶液的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，促进血清（浆）的
20、离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，促进血清（浆）中的抗体与红细胞相应抗原结合，再加入带亚电荷的高价中的抗体与红细胞相应抗原结合，再加入带亚电荷的高价阳离子多聚物阳离子多聚物-凝聚胺溶液，中和红细胞表面的负电荷，凝聚胺溶液，中和红细胞表面的负电荷，缩短细胞间距，形成可逆的非特异性聚集，并使缩短细胞间距，形成可逆的非特异性聚集，并使IgGIgG型抗型抗体直接凝集红细胞。加入中和液后，仅由凝聚胺引起的非体直接凝集红细胞。加入中和液后，仅由凝聚胺引起的非特异性聚集，会因电荷中和而分散，而由抗体介导的特异特异性聚集，会因电荷中和而分散，而由抗体介导的特异性凝集则不会分散性凝集则不会分散.44 聚凝胺聚
21、凝胺(Polybrene)Polybrene)配血方法配血方法.45.46应用范围：血型鉴定、抗体筛查及交叉配血试验特点：灵敏、速度快、准确、操作要求高。注意事项1.不能用含有枸橼酸钠和肝素抗凝标本2.用聚凝胺试验技术交叉配血，出现不配合时，要用抗球蛋白试验重做，结果不一致时，以抗球蛋白试验为主。3.聚凝胺只能是正常红细胞发生凝集，对缺乏唾液酸的细胞（如：T细胞及B细胞）无作用。.47第六节第六节 微柱凝集试验技术微柱凝集试验技术一、实验原理 微柱凝集试验的本质是凝集反应，在凝胶介微柱凝集试验的本质是凝集反应，在凝胶介质中，红细胞抗原与相应的抗体结合，经低速离质中，红细胞抗原与相应的抗体结合，
22、经低速离心，未和抗体结合的红细胞则沉于凝胶的底部心，未和抗体结合的红细胞则沉于凝胶的底部（管底尖部），而与抗体结合或凝集的红细胞，（管底尖部），而与抗体结合或凝集的红细胞，位于凝胶上层或悬浮在凝胶中位于凝胶上层或悬浮在凝胶中 。.48一、微柱凝胶试验原理一、微柱凝胶试验原理 操作及结果的判定操作及结果的判定.49二、应用1.抗球蛋白试验 直接抗球蛋白试验和 间接抗球蛋白试验。2.ABO血型鉴定 可做单纯正定型，也可同时做正反定型。3.其他血型系统检测 如Rh其他抗原（CcEe）定型三、特征及优点：1.简便 2.准确：结果清晰明确，可重复性强。3.敏感 4.结果保存时间长 5.标本用量少 6.标
23、准化 7.安全.50四、微柱凝集试验中可能存在的问题四、微柱凝集试验中可能存在的问题1.假阳性反应2.假阴性反应3.溶血反应.51五、局限性与发展前景 微柱凝集抗人球蛋白试验及微柱胶免疫检测技术的本质是血凝试验，这理论上为制备抗原抗体包被的红细胞为指示红细胞，以间接血凝试验来检测红细胞抗原抗体以外的其他血液红细胞、中路标志、病原微生物，以及人体中其他可溶性抗体，如对药物抗体、自身抗体的检测等提供了比传统血凝检验更为敏感、准确、简单易行的方法。微柱凝集试验技术奖在临床各个领域有更为广阔的发展。.52第七节第七节 吸收放射试验吸收放射试验概念吸收试验:抗原与抗体的结合是特异性的，因此具有抗体活性的
24、血清加入相应抗原后，抗体的活性下降或消失，这种作用称为吸收试验。放散试验是抗原与抗体的结合是可逆的，在物理条件改变时，抗体又会从抗原抗体复合物上分离下来，将抗体由抗原抗体复合物上分离下来的试验称为放散试验.53冷自身抗体冷自身抗体：理论上讲凡是理论上讲凡是3737与自身红细胞不与自身红细胞不反应，而只有在低于反应，而只有在低于3737环境下才能和自身红细环境下才能和自身红细胞反应的抗体均可称为冷自身抗体。实际上，冷胞反应的抗体均可称为冷自身抗体。实际上，冷自身抗体大多数只能在很低的温度下自身抗体大多数只能在很低的温度下(例如例如4)4)与与自身细胞反应。自身细胞反应。温自身抗体温自身抗体：温自
25、身抗体是指在温自身抗体是指在3737条件下能和条件下能和自身红细胞反应的抗体。当患者血清中含有温自自身红细胞反应的抗体。当患者血清中含有温自身抗体时，患者一般均有些贫血或溶血症状。身抗体时，患者一般均有些贫血或溶血症状。.54吸收放散试验的应用 证实存在于红细胞上的弱抗原证实存在于红细胞上的弱抗原分离、鉴定混合液体分离、鉴定混合液体除去血清中不需要的抗体除去血清中不需要的抗体浓缩低效价抗体浓缩低效价抗体核实抗体特异性核实抗体特异性利用吸收放散技术鉴定引起新生溶血病和免疫性利用吸收放散技术鉴定引起新生溶血病和免疫性输血反应的抗体输血反应的抗体研究鉴别免疫性溶血性贫血的抗体研究鉴别免疫性溶血性贫血
26、的抗体.55第八节第八节 凝集抑制试验凝集抑制试验概念 抗体能与有相应抗原的红细胞发生特异性凝抗体能与有相应抗原的红细胞发生特异性凝集，体液中的可溶性抗原物质能与该抗体发生特集，体液中的可溶性抗原物质能与该抗体发生特异的中和，抑制了抗体凝集红细胞的作用。用这异的中和，抑制了抗体凝集红细胞的作用。用这种可溶性物质来抑制抗体与红细胞凝集的试验，种可溶性物质来抑制抗体与红细胞凝集的试验，称为凝集抑制试验。称为凝集抑制试验。.56第九节第九节 红细胞血型分子生物学检测红细胞血型分子生物学检测红细胞血型分子生物学检测技术红细胞血型分子生物学检测技术 随着分子生物学技术的发展，检测基因结构随着分子生物学技
27、术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌新。尤其是和突变的方法不断涌新。尤其是PCRPCR技术问世后，技术问世后，各种与各种与PCRPCR相结合的检测技术进一步推动了基因研相结合的检测技术进一步推动了基因研究的发展。分子生物学技术应用与红细胞血型的究的发展。分子生物学技术应用与红细胞血型的检测，使红细胞血型分析的技术飞越了一个崭新检测，使红细胞血型分析的技术飞越了一个崭新的阶段。的阶段。.57第九节第九节 红细胞血型分子生物学检测红细胞血型分子生物学检测红细胞血型分子生物学检测的的方法红细胞血型分子生物学检测的的方法 PCR-SSP即序列特异性引物引导的PCR反应 PCR-SSOP即序列特异性寡核苷酸探针 PCR-SSCP即单链构象多态性 PCR-RFLP即限制性片段长度多态性 PCR-RBD即反向点杂交 PCR-DNA测序液相芯片法 又称悬浮点阵技术、xMAP（即灵活的多元分析平台）、多元流式荧光微球检测技术。.58应用应用ABO疑难血型的鉴定发现ABO血型新等位基因对于ABO基因突变的研究新生儿溶血病（HDN）的辅助诊断某些疾病的病理研究法医个体识别.59.60
