1、自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的区别自己和非己的DNADNA进而降解非己进而降解非己DNADNA的防御工具的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。子克隆的操作，而且拓宽了
2、研究领域。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。第1页/共169页基因工程工具酶基因工程工具酶 限制性内切酶 连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶第2页/共169页一、细菌的限制一、细菌的限制修饰作用和限制性内切酶的发现修饰作用和限制性内切酶的发现第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶5050年代后年代后LuriaLuria和和Human(1952)BertaniHuman(1952)Bertani和和Weigle(1953)Weigle(1953)发现细菌的发现细菌的“限制限制”现象现象.1 1、细胞的限制、
3、细胞的限制修饰作用修饰作用第3页/共169页Phage（k）感染感染E.coli k不感染不感染E.coli B(E.coli B 限制限制（k）)仍有少量仍有少量(K)可在可在 E.coli B中生存，是因中生存，是因 E.coli B对对(K)进进行了修饰。行了修饰。E.coli B修饰修饰(k)*(k)感染感染E.coli(B)细菌如何对细菌如何对噬菌体进行限制和修饰？噬菌体进行限制和修饰？第4页/共169页1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在Phage入的DNA上。1965年，Arber发现修饰与的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶特异性
4、限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制限制修饰系统修饰系统(R-M Restriction-modification system)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌的限制细菌的限制修饰系统修饰系统第5页/共169页 即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，称称R-M system 限制性内切酶识别特异的限制性内切酶识别特异的DNA序列并打断序列并打断DNA，同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基化，使得限制性内切酶无法识别。化，使得限制性内切酶无法识别。这种系统在细菌中起到了免疫的作用，即外来这种系统在
5、细菌中起到了免疫的作用，即外来入侵的入侵的DNA在限制性内切酶的作用下被水解，在限制性内切酶的作用下被水解，而细菌自身的而细菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保护在甲基化酶的作用下被保护起来。起来。细菌的限制和修饰现象细菌的限制和修饰现象第6页/共169页第7页/共169页 1968年年Linn和和Arber从从E.coli B中发现限制中发现限制酶酶,M.Meselson和和R.yuan从从E.coli K中分离到另一限中分离到另一限制性的内切酶。制性的内切酶。1970年年Smith(美美)在流感嗜血杆菌又发现另一限制在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶酶即限制酶。限制酶的功能：降解不同源
6、限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源，而不降解同源DNA。1978年年W.Arber、H.O.Smith(美美)，Nathans(美美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖。得诺贝尔奖。限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现第8页/共169页二、限制性核酸内切酶二、限制性核酸内切酶是一类能够识别双链双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列特定核苷酸序列（48bp），），并由此处切割切割DNA双链双链的核酸内切酶内切酶。（Restriction endonuclease）第9页/共169页2.2.性质性质内切酶。内切酶。原核生物。原
7、核生物。即在核酸分子链的即在核酸分子链的内部内部制造切口的酶。制造切口的酶。自我保护作用。自我保护作用。3.3.功能功能细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/MR/M体系）体系）1.1.来来源源第10页/共169页限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外外源源DNADNA切成小片断。切成小片断。（1 1）限制（）限制（RestrictionRestriction）第11页/共169页细菌自身的细菌自身的DNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。酶识别切割。（2）修饰（）修饰（Modi
8、fication）Dam甲基化酶甲基化酶(Mec甲基化酶甲基化酶)GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm甲基化酶甲基化酶CCAGG或或CCTGG序列在第二个序列在第二个C上上C5位置上引入甲基位置上引入甲基第12页/共169页第13页/共169页1973年H.O Smith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：三、限制性内切酶的命名1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。第14页/共169页4.限
9、制酶前面要带上限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上修饰酶前面要带上M（Modification）。）。（现已省略）。（现已省略）。2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型菌株或型。如如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如（现在都写成平行，如EcoRI）。）。3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。的限制与修复系统，用罗马字母表示。如如EcoR I，EcoR V。第15页/共169页EcoR IEscherichia属名属名Coli种类种类Ry13株系株系编号编号 若种名头若种名头2个字母相同则其中一个可用个
10、字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。种名的第一和第三个字母。第16页/共169页I 型限制性内切酶型限制性内切酶 目前鉴定出目前鉴定出三种不同类型三种不同类型的限制性内切酶。的限制性内切酶。四、限制性内切酶的类型四、限制性内切酶的类型II 类限制性内切酶类限制性内切酶 III类限制性内切酶类限制性内切酶 第17页/共169页首先由首先由M.Meselson和和R.Yuan在在1968年年从大肠杆菌从大肠杆菌 B株株和和 K株株分离的。分离的。（1）识别位点序列）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1.I类限制性内切酶类限制性内切酶 如如 Ec
11、oB和和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列，非对称性。未甲基化修饰的特异序列，非对称性。第18页/共169页需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理）作用机理在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500 bp处处随机随机切开一条切开一条单链单链。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点）切割位点第19页/共169页 I类酶与DNA识别位点结合依赖于M亚基与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的相互作用，后者通过变构作用使酶处于活性状态。酶分子与识别位点结合之后，根据该位点的甲基化状态发挥相应的酶活性，或限制、或修饰、或既
12、不限制也不修饰。I类酶的切割位点与识别位点通常相距1,000-5,000bp，切割位点的序列并不表现出严格的特异性，两条DNA链上的断裂位点相距70-75个核苷酸，因此切开的DNA分子末端是单链形式。第20页/共169页第21页/共169页首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。2.II类限制性内切酶类限制性内切酶 分离的第一个酶是Hind 该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双链DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组及分子生物学实验中被广泛使用。第22页/共169页（1）识别位点序列未甲基化
13、修饰的双链DNA；四、五或六个碱基对，而且具有180旋转对称的回文结构。与DNA的来源无关。第23页/共169页 绝大多数的II类酶均在其识别位点内切割DNA，切割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间。一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶（Isoschizomers），其中识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶，如SstI与SacI、HindIII与HsuI等。有些酶识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶（Isocandamers）。根据被切开的DNA末端性质的不同，所有的II类酶又可分为5突出末端酶、3突出末端酶以及平头末端酶三大类。
14、II类酶分类第24页/共169页（2 2）切割位点）切割位点切开切开双链双链DNADNA。形成。形成粘性末端粘性末端（sticky sticky endend）或）或平齐末端平齐末端（blunt endblunt end）。如：）。如：识别位点处。识别位点处。第25页/共169页（3）粘性末端（）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链突出的末端。分两种类型：5端凸出（如EcoR I切点）GAATTC CTTAA GG AATTCCTTAAG5-33-55-33-5第26页/共169页CTGCAG 3端凸出（如端凸出（如Pst I切点）切点）GACGT
15、C5-33-55-33-5CTGCA G G ACGTC第27页/共169页 连接便利（4）粘性末端的意义）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。第28页/共169页第29页/共169页 补平成平齐末端凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。5末端标记末端标记凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。第30页/共169页识别位点的序列相同的限制性内切酶。（5）同裂
16、酶）同裂酶（Isoschizomers)完全同裂酶(同位酶)：识别位点和切点完全相同。如Hind 和Hsu I。第31页/共169页识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。不完全同裂酶：不完全同裂酶：第32页/共169页识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho 等（6）同尾酶）同尾酶(Isocaudamers）第33页/共169页 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的同尾酶的粘性末端互相结合后形成的“杂种位点杂种位点”一般不能一般不能再被原来的酶识再被原来的酶识别。别。？Sau 3A第34页/共169页第35页/共169页限制性
17、内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。（7）限制酶的酶活性）限制酶的酶活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。星号（*）活性 星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。第36页/共169页第37页/共169页EcoR I和BamH I等都有*活性,使用时要注意！在低盐、高pH（8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoR I：如：ECORI识别特异性放宽，GAATTCAATT第38页/共
18、169页较高的甘油浓度（5%v/v）；酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为100 U/g）；低盐浓度（pH 8.0）存在有机溶剂（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等）用其他二价离子替代镁离子（如Mn+，Cu+，Co+，Zn+等）导致星号活性的因素 第39页/共169页 以下酶类易出现“星号活性”，它们是 BamH I，Bcl I，BseB I，BssA I，EcoRI，EcoR V，Hind III，Hpa I，Kpn I，NcoI，NruI，Pst I，Pvu II，Sal I，Sca I，SnaB I，Sph I，Ss
19、p I，Xba I。以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些(2)。第40页/共169页 尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。将反应缓冲液的pH值降到7.0。二价离子用Mg+。第41页/共169页在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（8 8）ss型限制性内切酶型限制性内切酶移动切割（shifted cleavage):53第42页/共169页3.II
20、I类限制性内切酶类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切割DNA，但反应，但反应需要需要ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨腺苷蛋氨酸）。酸）。在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。第43页/共169页 III类限制类限制-修饰酶由修饰酶由R亚基和亚基和MS亚基组成，其中亚基组成，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。该类酶与该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖识别位点的结合严格依赖ATP，在与识别位点结合之后，修饰作用与限制作用在与识别位点结合之后，修饰作用与限制作用取决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在识别取决于两
21、个亚基之间的竞争。修饰作用在识别位点内进行，甲基化受体是腺嘌呤碱基，供体位点内进行，甲基化受体是腺嘌呤碱基，供体仍为仍为SAM。切割位点位于识别位点一侧的若干碱基对处，切割位点位于识别位点一侧的若干碱基对处，但无序列特异性，只与识别位点的距离有关，但无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同的而且不同的III类酶具有各自不同的距离，从类酶具有各自不同的距离，从7至至26bp不等。不等。第44页/共169页第45页/共169页五、影响限制性内切酶活性的因素五、影响限制性内切酶活性的因素 1、底物 DNA1)DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活
22、性。RNA 与 E 结合影响有效酶浓度；RNA影响(干扰)电泳区带。2)DNA浓度 DNA过大，会抑制酶活(影响酶分子扩散)。第46页/共169页 如：4g DNA/1U HPa 50l 在37下 15h 而 1g DNA/1U HPa 50l 在37下 1h 3）识别位点及邻近位点特异性序列 由于切点邻近序列不同，水解速度不同。如：DNA有5个ECORI切点，其中两个相差10倍。pBR322 DNA 有4个Nar切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。Xma切点是CGGCCG，但在GGCGGCCGCC时不切割第47页/共169页 4)
23、DNA二级/三级结构 超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需更多酶。5)提取时混入杂质可改变识别特异性 如：高浓度Hg2+、酚，氯仿、乙醇、EDTA SDS、NaCl等。第48页/共169页大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2.DNA2.DNA的甲基化程的甲基化程度度 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。第49页/共169页不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。3.3.温度温度 第50页/共169页是影响限制酶活性的重要因素。4.4.缓冲液缓冲液(Buffer
24、)(Buffer)（1）缓冲液的化学组成金属离子 如型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如Hind，ECORI）则特异性改变。离子浓度，合适激发酶活；不合适抑制酶活。牛血清蛋白(BSA)第51页/共169页MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；BSA 是酶稳定剂，机制：减少蛋白酶及非特异性吸附作用。避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾。可通过加SDS/65/5min除去。水无离子水，ddH2O，双蒸水。无菌、无污染、配成核心缓冲液，即几种酶的相近
25、buffer商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。第52页/共169页六、限制性内切酶对六、限制性内切酶对DNADNA的消的消化化1.1.内切酶与识别序列的结合模式内切酶与识别序列的结合模式 1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG第53页/共169页内切酶在内切酶在DNADNA上的上的所有所有识别位点都被切开。识别位点都被切开。2.2.完全消完全消化化 12 341234第54页/共169页只有有限数量的酶切位点被切开。只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减通过缩短保温时间、降低反
26、应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。少酶的用量可达到局部消化的目的。3.3.局部消化局部消化 12 3414第55页/共169页大多数酶可用大多数酶可用65 65 o oC C温育温育5 5分钟失活。分钟失活。或用或用乙醇乙醇沉淀沉淀DNADNA。4.4.限制酶酶切反应的终限制酶酶切反应的终止止 5.5.几种常用限制酶识别位点几种常用限制酶识别位点第56页/共169页第57页/共169页 要做定向克隆，通常要作双酶切。同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选要做定向克隆，通常要作双酶切。同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让择能让两种酶同时作用两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一
27、步。的最佳缓冲液是非常重要的一步。酶切所用的缓冲液可以从各公司的酶活性图表中选择。酶切所用的缓冲液可以从各公司的酶活性图表中选择。6.6.双酶切双酶切第58页/共169页第59页/共169页双酶切注意事项双酶切注意事项 选活性至少都在选活性至少都在8080以上的以上的bufferbuffer 注意反应温度注意反应温度 1 1）温度一致时可同时进行）温度一致时可同时进行 2 2）温度不一致时，先切温度低的，再切）温度不一致时，先切温度低的，再切温度高的温度高的先切一个，回先切一个，回收后再切另一个收后再切另一个.第60页/共169页 由于内切酶在非最佳缓冲液中进行双酶切反应时，反应速度会减缓，因
28、此需要由于内切酶在非最佳缓冲液中进行双酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长酶切时间来提高酶切速率。增加酶量或延长酶切时间来提高酶切速率。第61页/共169页从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二节第二节 DNA DNA 连接酶连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口。第62页/共169页 DNA连接酶旧称“合成酶”。是1967年在三个实验室同时发现的，最初发现于大肠杆菌。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条
29、互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。第63页/共169页（1 1）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶1.1.两种两种DNADNA连接酶连接酶只能连接只能连接粘性末端。粘性末端。分子量分子量74000dal,74000dal,辅因子辅因子NAD+,NAD+,其作用是封其作用是封闭双螺旋骨架上具有闭双螺旋骨架上具有5-5-磷酰基和磷酰基和3-3-羟基的缺口，形成磷酸羟基的缺口，形成磷酸二酯键。二酯键。二、二、DNA ligaseDNA ligase的特点的特点（2 2）T4T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶T4DNA连接酶来自于T4噬菌
30、体感染的E.coli，为T4噬菌体自身的表达产物。分子量6.8万dal，辅因子位ATP，该酶既能连接粘性末端，亦能连接齐平末端。第64页/共169页（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+2.2.连接条件连接条件第65页/共169页1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、连接反应的机理三、连接反应的机理2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi第
31、66页/共169页4.AMP随后从连接酶的赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OH HO-P-AMP-OHO-P-AMP第67页/共169页5.3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。第68页/共169页 用DNA连接酶，可催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组分子。具体做法是，在体外将具有粘性末端的DNA限制片断，插入到适当载体分子上，再用DNA连接酶连接，从而可以按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子。粘性末端粘性末端DNADNA片段的连接（连接酶的作用）片段的连接（连接酶的作用）第69页/共169页5 5GAATTCC
32、TTAAGGAATTCCTTAAG5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG第70页/共169页用粘性末端构建重组体用粘性末端构建重组体DNADNA的最主要缺点：的最主要缺点：1、无法控制外源基因的插入方向；2、由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应混合物中会发生自我环化作用，经连接酶作用，形成共价闭环的稳定环形结构。克服该缺点的
33、方法是，用碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，以移去末端的5磷酸基团，于是在连接反应中，它自身的两个末端之间就再也不能被连接酶共价连接起来了。第71页/共169页第72页/共169页1 1、同聚物加尾法、同聚物加尾法 是由美国斯坦福大学的P.Labban和D.Kaiser1972年发展起来的，可以连接任何两段DNA分子的普遍性方法。原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP)加到DNA分子单链延伸末端的3-OH上。如果在目的基因两侧加polydA，则在载体两侧加polydT。长度一般1040个残基。平末端平末端DNADNA片段的连接片段的连接第73
34、页/共169页同聚物加尾法优点:1)首先不易自身环化.2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高.3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接.缺点：1)插入的片段难以回收。2)无法控制外源基因插入方向。3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接.第74页/共169页C 3 GG5 G 3C5C3GGTTTTTTTTTT 3CC3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGC3 5 5GTTTTTTTTTTGCAA
35、AAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG第75页/共169页CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGGCATGCCCCCC 3CC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGAC
36、GTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG第76页/共169页5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCG5 55GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGG
37、GTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG第77页/共169页衔接物（衔接物（linker)linker)连接法连接法所谓衔接物是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。将衔接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。优点：克隆后还可回收原插入片断。第78页/共169
38、页第79页/共169页第80页/共169页 DNA DNA衔接物连接法尽管有诸多优点，但明显衔接物连接法尽管有诸多优点，但明显的的缺点缺点是，如果待克隆的是，如果待克隆的DNADNA片段或基因的内部也含片段或基因的内部也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把所克隆的基因切衔接物产生粘性末端的同时，也会把所克隆的基因切成不同的片段，从而对后继的亚克隆及其他操作造成成不同的片段，从而对后继的亚克隆及其他操作造成麻烦。麻烦。第81页/共169页DNADNA接头接头(adaptor)(adaptor)连接法连接法D
39、NADNA接头接头是由美国康奈尔大学吴瑞博士于1977年发明的，它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。问题：各个DNA接头分子的粘性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子，失去接头的本来意义。克服的方法是将5末端的磷酸修饰移去，其结果为暴露出的5-OH所取代。如此一来，虽然两个接头分子粘性末端之间仍具有互补碱基配对的能力
40、，但终因DNA连接酶无法在5-OH和3 OH之间形成磷酸二酯键而不会产生出稳定的二聚体分子。第82页/共169页第83页/共169页第84页/共169页连接酶反应的最佳温度是连接酶反应的最佳温度是37C。四、连接反应的温度四、连接反应的温度1.最佳温度最佳温度但在但在37下下粘性末端粘性末端的结合很不稳定。的结合很不稳定。2.实用温度实用温度所以一般采用所以一般采用 416 C。第85页/共169页增加插入片段与载体的接触机会，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。减少载体自我连接的现象。1.1.插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例 2.2.反应温度反应温度五、影响
41、连接反应的因素五、影响连接反应的因素10201020倍。倍。一般一般14161416第86页/共169页第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶一、基因工程中常用的一、基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶1.DNA聚合酶聚合酶(全酶全酶)(E.coli)2.Klenow fragment(E.coli)3.TDNA聚合酶聚合酶(TPhage感染的感染的E.coli)4.TDNA聚合酶聚合酶(TPhage感染的感染的E.coli)5.修饰的修饰的TDNA聚合酶聚合酶(测序酶测序酶)6.DNA末端转移酶末端转移酶(小牛胸腺小牛胸腺)7.反转录酶反转录酶(依赖依赖RNA)聚合酶聚合酶第87页/共169页1.共
42、同特点共同特点把把dNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的3OH端。端。2.主要区别主要区别T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。而不从模板上掉下来。其它几种其它几种DNA聚合酶只能连续添加聚合酶只能连续添加10多多个个dNTPs就会从模板上解离下来。就会从模板上解离下来。二、常用的二、常用的DNA聚合酶的特点聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。第88页/共169页高高快快无无无无遗传修饰遗传修饰T7DNA聚合酶聚合酶高高3.常用常用DNA聚合酶的特性聚合酶的特性比较比较第89页/共169页三、三、DNA
43、聚合酶在基因工程中的用聚合酶在基因工程中的用途途1.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I主要用来制备带放射性标记的主要用来制备带放射性标记的DNA探针。探针。（1）大肠杆菌）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 的性质的性质一条一条单链多肽单链多肽。用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的端的部分。就成为部分。就成为Klenow fragment。第90页/共169页 底物：底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）Mg2+带有带有3OH游离端的引物游离端的引物 DNA模板模板（2）DNA聚合酶聚合酶I（Pol I）的反应）的反应条件条件-OH53dNTPs第9
44、1页/共169页标记标记能够同某种被研究的核酸序列特异能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。子。（3）用）用DNA聚合酶聚合酶I 制备探制备探针针已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断显示位置显示位置与互补的待测序列杂交与互补的待测序列杂交第92页/共169页标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断 探针的标记方式探针的标记方式标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断53第93页/共169页 DNA聚合酶聚合酶I 对探针序列的标对探针序列的标记记切口转移法切口转移法(nic
45、k translation)：放射性同位素标记：放射性同位素标记：DNA聚合酶聚合酶I 同时具备同时具备53外切酶外切酶活性活性和和53的聚合酶的聚合酶活性（以及活性（以及35外切外切酶活性）。酶活性）。第94页/共169页53外切酶活性从外切酶活性从DNA切口的切口的下一段下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的的上一段上一段DNA的的3一侧补上一个新的核苷酸。一侧补上一个新的核苷酸。切口切口切口切口55335353第95页/共169页纯化的纯化的DNA片断片断DNase I 制制造单链切口造单链切口DNA Pol I 进行进行切口转移
46、切口转移一种一种a-32P-dNTP和和dNTPs555555553333333332P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记从头至尾都被标记8第96页/共169页 缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标记均一。主要利用了缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标记均一。主要利用了DNA聚合酶聚合酶修复修复DNA的功能，用于大分子的功能，用于大分子DNA标记（标记（1000bp最好）；最好）；缺点：单链缺点：单链DNA、RNA不能用该法标记。不能用该法标记。第97页/共169页2.Klenow fragment(DNA2.Klenow fragment(DNA聚合酶聚合
47、酶I I大片段大片段)具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活性。外切酶活性。（失去了失去了53外切酶活性外切酶活性）。）。（1）Klenow fragment的性质的性质第98页/共169页C 端端76，000 dKlenow活性活性 聚合聚合 5外切外切N 端端36，000 5外切外切 Jacobsen(1974),Joyce 和和 Grindley,(1983)克隆此克隆此大片段。大片段。DNA Pol I 枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶第99页/共169页 3 3端补平端补平5555klenowklenow补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切后形成的33隐蔽端隐蔽端。在在
48、33隐蔽端隐蔽端加上放射性标记的加上放射性标记的dNTPdNTP。klenowklenow（2 2）主要用途）主要用途第100页/共169页33隐蔽末端的隐蔽末端的DNADNA片断片断Klenow fragmentKlenow fragment补平补平根据末端的顺序选根据末端的顺序选择一种择一种 a-a-3232P-P-dNTPsdNTPs末端标记的末端标记的DNADNA限制性内切酶切限制性内切酶切5-G35-G33-CTTAA53-CTTAA55-G5-GAAAA333-CTTAA53-CTTAA55-G5-GAAAATT3TT33-CTTAA53-CTTAA55-G35-G33-CCTAG
49、53-CCTAG55-G5-GG G333-CCTAG53-CCTAG55-G5-GG GATC3ATC33-CCTAG53-CCTAG5EcoR IEcoR IBamH IBamH Ia-a-3232P-dATPP-dATPa-a-3232P-dGTPP-dGTP2525o oC 1hC 1h第101页/共169页 cDNA第二链的合第二链的合成成mRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow533553引物引物第102页/共169页 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合模板结合,在在Klenow酶的作用酶的作用
50、下下,合成合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常和酶的量。通常,产物平均长度为产物平均长度为400-600个核苷酸。个核苷酸。随机引物法标探针随机引物法标探针第103页/共169页 优点：(1)Klenow片段没有53外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4109 cpm/g探针 缺点：不能标记环状DNA 第104页/共169页纯化的DNA片断加热变性klenow进行5-3聚
