1、哺乳动物基因组DNA的提取实验一实验一 储备液的制备储备液的制备实验二实验二 破碎细胞破碎细胞实验三实验三 分离、纯化分离、纯化DNA实验四实验四 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA11/19/2022一、一、实验目的实验目的l通过本实验了解并掌握提取动物通过本实验了解并掌握提取动物基因组基因组DNADNA的原理和步骤。的原理和步骤。l通过本实验熟练掌握琼脂糖凝胶电泳检测通过本实验熟练掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA的实验技术。的实验技术。l熟练掌握分子生物学实验中各种仪器的使用熟练掌握分子生物学实验中各种仪器的使用方法及试剂的配制方法。方法及试剂的配制方法。11/19/2022二、
2、实验原理二、实验原理 l天然状态的天然状态的DNADNA是以脱氧核糖核蛋白是以脱氧核糖核蛋白(DNP)(DNP)形式存在于形式存在于细胞核中。要从细胞中提取细胞核中。要从细胞中提取DNADNA时，先把时，先把DNPDNP抽提出来，抽提出来，再把再把P P除去，再除去细胞中的糖，除去，再除去细胞中的糖，RNARNA及无机离子等。及无机离子等。在在EDTAEDTA和和SDSSDS等去污剂存在下，等去污剂存在下，用蛋白酶用蛋白酶K K消化细胞，消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNADNA。l用此方法得到的用此方法得到的DNADNA大小为大小为100-
3、150 kb100-150 kb，适用于，适用于噬噬菌体构建基因组文库和菌体构建基因组文库和SouthernSouthern分析。分析。11/19/2022三、仪器、材料和试剂三、仪器、材料和试剂（一）仪器（一）仪器高速冷冻离心机、微量取样器、玻璃匀浆器、高速冷冻离心机、微量取样器、玻璃匀浆器、琼脂糖凝胶电泳系统：琼脂糖凝胶电泳系统：电泳仪电泳仪、水平电泳槽、水平电泳槽、紫外透射仪紫外透射仪（或凝胶成像分析系统）、（或凝胶成像分析系统）、恒温水浴器、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴器、高压灭菌锅、超净工作台、超低温冰箱、电子天平、酸度计超低温冰箱、电子天平、酸度计11/19/2022（二）实验
4、材料、用具、药品（二）实验材料、用具、药品1.1.鼠肝或兔肝鼠肝或兔肝2.1.5 2.1.5 mLmL微量离心管、微孔过滤器、微量离心管、微孔过滤器、20mL20mL注射器、注射器、各种型号的吸头各种型号的吸头3.3.三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷(TrisTris)、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)(SDS)、乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸(EDTA)(EDTA)、醋酸钠（、醋酸钠（NaAcNaAc）、平衡酚、）、平衡酚、氯仿、异戊醇、氯仿、异戊醇、乙醇、乙醇、琼脂糖、琼脂糖、蛋白酶蛋白酶K K、RNARNA酶酶、DNADNA相对分子质量标准物、相对分子质量标准物、硼酸、硼酸、溴酚蓝溴酚
5、蓝、蔗糖蔗糖 溴化乙锭（危险）溴化乙锭（危险）11/19/2022（三）试剂（三）试剂 1.5 mol1.5 molL L NaClNaCl 2.2.0.5 mol0.5 molL L Tris.HClTris.HCl pH8.0 pH8.0 3.3.0.5 mol0.5 molL EDTA pH8.0 L EDTA pH8.0 4.4.3 mol3 molL L NaAcNaAc pH5.2 pH5.2 5.dddH 5.dddH2 2O O 6.6.生理盐水（生理盐水（0.850.85 NaClNaCl）l以上均高压灭菌以上均高压灭菌11/19/20227.10mg7.10mgmLmL蛋白
6、酶蛋白酶K K配好后用一次性过滤器过滤，配好后用一次性过滤器过滤，-20-20保存；保存；8.10mg8.10mgmLmL无无DNADNA酶的酶的RNARNA酶配好后酶配好后用一次性过滤器过滤，用一次性过滤器过滤，-20-20保存；保存；9.9.组织匀浆液组织匀浆液10.10.酶解液酶解液 11.11.提取液提取液1 1：平衡酚：平衡酚(pH8.0)(pH8.0)：氯仿：异戊醇：氯仿：异戊醇2525：2424：1 1 12.12.提取液提取液2 2：氯仿：异戊醇：氯仿：异戊醇2424：1 1 13.13.5 5TBETBE14.14.TETE缓冲液缓冲液15.15.6 6凝胶加样缓冲液凝胶加样
7、缓冲液11/19/2022四、实验步骤四、实验步骤l本实验在无液氮的条件下，制备鼠肝或兔肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。l整个操作过程中，应尽量避免DNA酶的污染，特别注意动作温和，减少对DNA的机械损伤。11/19/2022（一）储备液的制备（第一次）（一）储备液的制备（第一次）1.5 mol1.5 molL L NaClNaCl 2.2.0.5 mol0.5 molL L Tris.HClTris.HCl pH8.0 pH8.0 3.3.0.5 mol0.5 molL EDTA pH8.0 L EDTA pH8.0 4.4.3 mol3 molL L NaAcNaAc
8、pH5.2 pH5.2 5.dddH 5.dddH2 2O O 6.6.生理盐水（生理盐水（0.850.85 NaClNaCl）l以上均高压灭菌以上均高压灭菌 7.10mg7.10mgmLmL 蛋白酶蛋白酶K -20K -20保存保存 8.8.10mg10mgmLmL 无无DNADNA酶的酶的RNARNA酶酶 -20-20保存保存 9.9.5 5TBETBE 10.10.6 6凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液11/19/2022（二）破碎细胞（第二次）（二）破碎细胞（第二次）冰浴处理生理盐水冰浴处理生理盐水 玻璃匀浆器玻璃匀浆器 冰冷的生理盐水清洗冰冷的生理盐水清洗配制工作液配制工作液 处死小鼠处
9、死小鼠 取出肝脏取出肝脏 组织匀浆液组织匀浆液 酶解液酶解液2ml2ml匀浆液匀浆液 组织细胞液组织细胞液 玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆 移至移至1.5ml离心管离心管5000r5000rmin3060s min3060s 加加400ul 400ul 吹散吹散 加加400ul400ul 离心离心 无菌水无菌水 酶解液酶解液 水浴处理（水浴处理（55、1218h）11/19/2022（三）分离、纯化分离、纯化DNADNA（第三次）等量分装在两支离心管内等量分装在两支离心管内 加入加入20ul20ul的的RNaseRNase 加入等体积加入等体积提取液提取液500ul 500ul 4 10min4
10、 10min 酶解样品酶解样品 待抽提的样品待抽提的样品 抽提 静置静置 离心离心 配制配制 TETE缓冲液缓冲液 加等体积加等体积提取液提取液500ul500ul10000r10000rminmin离心离心10min 10min 4 10min4 10min 移出移出水相水相 至离心管至离心管 抽提 静置静置 10000r10000rminmin离心离心10min 10min 加加1/10 1/10 加加2 2倍倍 放入放入离心离心 移出移出水相水相 NaAcNaAc 无水乙醇无水乙醇 -75 1-2h 12000r-75 1-2h 12000rminmin离心离心15min 15min 加
11、入加入超低温冰箱超低温冰箱 融化、离心融化、离心 弃上清液弃上清液 洗涤洗涤 12000r12000rminmin离心离心15min 15min 干燥干燥 44 75%75%冷乙醇冷乙醇 离心离心 弃上清液弃上清液 加加TETE 存放存放 11/19/2022（四）琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA（第四次）制备琼脂糖凝胶制备琼脂糖凝胶 胶板的制备胶板的制备 加样加样 电泳电泳 紫外投射仪检测紫外投射仪检测 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中由负极向正极移动。11/19/20221.1.计算方法计算方法:（1
12、）摩尔质量的计算）摩尔质量的计算:质量质量(g)分子量分子量 5 mol5 molL L NaClNaCl 分子量分子量58.4458.44 x58.44（2）组织匀浆液：）组织匀浆液：10ml 5 mol5 molL L NaClNaCl 100mmol100mmolL L 5 mol5 molL Lx x 0.1mol0.1molL L 10ml 0.2ml10ml 0.2ml 体积(L)摩尔体积（mol/L）0.5(L)5（mol/L）x 146.1（g）11/19/20222.2.溶液的配置溶液的配置l（1)3mol/L1)3mol/L乙酸钠（乙酸钠（sodium acetatesod
13、ium acetate）：）：溶解溶解20.4g20.4g的三水乙酸钠于约的三水乙酸钠于约40ml40ml水中，用冰乙酸调溶液的水中，用冰乙酸调溶液的pHpH至至5.25.2，再加水定容到，再加水定容到50ml 50ml。l(2)0.5mol/L(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）:配制等摩尔的配制等摩尔的Na2EDTANa2EDTA和和NaOHNaOH溶液（溶液（0.5mol/L0.5mol/L），混合后形），混合后形成成EDTAEDTA的三钠盐。或称取的三钠盐。或称取9.31g9.31g的的Na2EDTA2H2ONa2EDTA2H2O和和1g1g的的NaOH
14、NaOH，并溶于约，并溶于约40ml40ml水中，定容至水中，定容至50ml 50ml。l(3)5mol/L(3)5mol/L氯化钠（氯化钠（NaClNaCl）：）：溶解溶解14.6g14.6g氯化钠于足量的水中，定容至氯化钠于足量的水中，定容至50ml50ml。11/19/2022(4)10(4)10十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）：）：称取称取10gSDS10gSDS慢慢转移到约含慢慢转移到约含90ml90ml的水的烧杯中，用磁的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至100ml 100ml。(5)10N(5)10N氢氧化钠（氢
15、氧化钠（NaOHNaOH）：）：溶解溶解40g40g氢氧化钠颗粒于约氢氧化钠颗粒于约90ml90ml水的烧杯中（磁力搅拌水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至100ml 100ml。(6)1mol/L(6)1mol/L盐酸（盐酸（HClHCl）：）：加加8.6ml8.6ml的浓盐酸至的浓盐酸至91.4ml91.4ml的水中。的水中。11/19/2022(7)20mg/ml(7)20mg/ml蛋白酶蛋白酶K K（proteinaseproteinase K K）：）：将将200mg200mg的蛋白酶的蛋白酶L L加入到加入到9.5ml9.
16、5ml水中，轻轻摇动，水中，轻轻摇动，直至蛋白酶直至蛋白酶K K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到到10ml10ml，然后分装成小份贮存于，然后分装成小份贮存于-20-20。(8)(8)10mg/mlRnase10mg/mlRnase（无（无DNaseDNase）（）（DNaseDNasefree free RNaseRNase）：）：溶解溶解10mg10mg的胰蛋白的胰蛋白RNARNA酶于酶于1ml1ml的的10mmol/L10mmol/L的乙酸钠的乙酸钠水溶液中（水溶液中（pH 5.0pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸）。溶解后于水浴中煮沸15min15mi
17、n，使使DNADNA酶失活。用酶失活。用1mol/L1mol/L的的TrisTrisHClHCl调调pHpH至至7.57.5，于于-20-20贮存。（配制过程中要戴手套）贮存。（配制过程中要戴手套）11/19/2022(9)Tris(9)Tris缓冲液（缓冲液（Tris-HClTris-HCl buffer buffer）将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。浓盐酸的体积（ml）pH14148.68.6212128.528.5383846465656666671.371.376 76 9.09.08.88.
18、88.68.68.48.48.28.28.08.07.87.87.67.67.47.47.2 7.2 11/19/20225 5TBETBE（电泳缓冲液）（电泳缓冲液）100mLl5.4gTris5.4gTris，l2.75g2.75g硼酸，硼酸，l2mL 0.5mol2mL 0.5molL EDTA(pH8.0)L EDTA(pH8.0)l加加蒸馏蒸馏水到水到100mL100mL（1000ml1000ml）lpH8.0pH8.011/19/20226 6上样缓冲液上样缓冲液l0 02525溴酚蓝：取溴酚蓝：取60ml60ml双蒸水，将双蒸水，将250mg250mg溴酚蓝溶解于其中溴酚蓝溶解于
19、其中l4040(W(WV)V)蔗糖水溶液：在上述溶液中蔗糖水溶液：在上述溶液中加入加入40g40g蔗糖蔗糖11/19/2022破碎细胞破碎细胞l1取0.2g鼠肝或兔肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切匆将细胞破碎，可镜检观察)。11/19/2022l2将组织细胞液移至1.5mL离心管中，5000rmin离心3060s，(尽可能在低温下操作尽可能在低温下操作)，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入5倍于细胞体积的匀浆液洗一次。11/19/2022l3沉淀加400uL无菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻转混匀(动作一定要轻)5
20、555水浴处理水浴处理121218h18h。11/19/2022分离、纯化分离、纯化DNADNA4取取20uL 20uL RNaseRNase加入1.5ml离心管内，使RNase至终浓度200gmL，3737水浴水浴1h1h。5将待抽提的样品等量分装在两支离心管内，各加入等体积提取液提取液 酚氯仿异戊醇酚氯仿异戊醇500ul500ul，抽提(慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大)一次。4 10min静置，然后10000rmin离心10min。11/19/20226.有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察。用扩口吸头移出含含DNADNA的的水相水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)。7.然后
21、加等体积提取液提取液氯仿异戊醇500ul，抽提，4 10min4 10min静置，然后10000r10000rminmin离心离心10min10min(若界面或水相中蛋白含量多，可重复5，6，7操作)。11/19/20228.用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，加110体积的NaAc，小心混匀(要充分)。9.再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-75 1-2h-75 1-2h。11/19/202210.12000r12000rminmin离心离心15min15min，弃上清。11.75冷乙醇冷乙醇洗涤一次，12000r12000rminmin离心离心15min15min。12.室温干燥(不
22、要太干，否则DNA不易溶解)，加入50L TE缓冲液。13.存放于4，轻摇溶解过夜(或2h)，即可得到实验动物基因组实验动物基因组DNADNA。11/19/2022琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA（1 1）哺乳动物基因组）哺乳动物基因组DNADNA提取检测的电泳胶制备提取检测的电泳胶制备A.A.支持胶：支持胶：1 1琼脂糖琼脂糖 称取称取0.4g0.4g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入琼脂糖，放人锥形瓶中，加入40mL40mL，0.50.5TBETBE缓冲液，置水浴加热至完全溶化，取出摇匀，缓冲液，置水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为则为1 1琼脂糖凝胶液。琼脂糖凝胶液。B.B.电泳
23、胶：电泳胶：0.30.3琼脂糖琼脂糖 称取称取0.18g0.18g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入琼脂糖，放人锥形瓶中，加入60mL60mL的的0.50.5TBETBE缓冲液，置水浴加热至完全溶化，取出摇匀，缓冲液，置水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为则为0.30.3琼脂糖凝胶液。琼脂糖凝胶液。（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用双蒸水补足由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用双蒸水补足）11/19/202211/19/2022（2）胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，取有机玻璃内槽，洗净，晾干，将有机玻璃内槽放置于一水平位置，将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在槽内
24、底部并在槽内底部放上玻璃放上玻璃，然后再放好，然后再放好样品样品梳子梳子。先用先用2.52.5琼脂糖凝胶液将有机玻璃琼脂糖凝胶液将有机玻璃内槽的两端边缘封好内槽的两端边缘封好(一定封严，不一定封严，不能留缝隙能留缝隙)。11/19/2022将冷到将冷到6060左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒人有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成人有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面一层均匀的胶面(注意不要形成气泡注意不要形成气泡)。待胶凝固后（待胶凝固后（60min60min），取出梳子，取下有），取出梳子，取下有机玻璃片，放在电泳槽内。机玻璃片，放在电泳槽内。加入电泳缓冲液加入
25、电泳缓冲液(0.5(0.5）至电泳槽中。）至电泳槽中。11/19/2022（3）加样o1.1.样品样品DNADNA：16ul16ulo2.2.上样缓冲液：上样缓冲液：4ul4ulo1.Mark DNA1.Mark DNA样品：样品：6ul6ul 共共20ul20ul11/19/2022（4）电泳o接通电泳槽与电泳仪的电源接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，注意正负极，DNADNA片段从负极向正极移动片段从负极向正极移动)。保持电压。保持电压190V190V。o当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm1-2cm处，处，停止电泳。停止电泳。11/19/2022（5）实验
26、结果o在紫外灯在紫外灯(312nm(312nm或或254nm)254nm)下观察染色下观察染色后的电泳凝胶后的电泳凝胶(图实验图实验121)121)。DNADNA存存在处应显出桔红色荧光条带在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作用眼睛有伤害作用)。o结果照片图结果照片图11/19/2022五、五、实验结果分析方法实验结果分析方法 n1.紫外分光光度计n2.电泳（琼脂糖凝胶电泳）n3.二苯胺显色法测定11/19/2022六、思考题n1.为什么在低温下进行？n2.加入EDTA的作用？n3.加SDS的作用？n4.加饱和酚
27、、氯仿有什么作用？n5.加入异戊醇有什么作用？11/19/2022七、实验报告哺乳动物基因组哺乳动物基因组DNADNA的提取的提取（综合性实验报告）（综合性实验报告）11/19/2022 细胞（细胞（Cell）植物细胞植物细胞(plant cell)动物细胞动物细胞(animal cell)11/19/202211/19/2022溶酶体(lysosome)溶酶体时酸性细溶酶体时酸性细胞器胞器,含有一系列含有一系列消化消化降解酶降解酶(d e g r a d a t i v ed e g r a d a t i v e enzymes);enzymes);分为分为初级溶酶体初级溶酶体和和次级溶酶
28、体。次级溶酶体。11/19/2022组织匀浆液组织匀浆液 （装入（装入10ml10ml离心管中）离心管中）10ml 10ml l100mmolL NaCl：0.2ml（5M NaCl）l25 mmolL EDTA(pH80)：0.5ml（0.5M EDTA pH80)ll0mmolLTris.HCIpH 80)：0.2ml（0.5M LTris.HCIpH 80)l加三蒸水:9.1ml11/19/2022酶解液（装入酶解液（装入1.5ml1.5ml离心管中）离心管中）1ml1mll200mmolL NaCl：0.04ml（5M NaCl）l50mmolL EDTA(pH 80)：0.1ml（0
29、.5M EDTA pH80)l20mmolLTris.HCl(pH 80)：0.04ml（0.5M LTris.HCIpH 80)l1SDS：0.1ml（10 SDS）l200gmL蛋白酶K：0.02ml（10mg10mgmLmL）l加三蒸水:0.7ml11/19/2022无无DNADNA酶的酶的RNARNA酶（酶（-20-20保存）保存）10mmolLTris.HCl将胰将胰RNARNA酶溶于酶溶于 浓度10mgmL 15mmolL NaCl 于100100水浴水浴处理15min15min以降解DNA酶 缓慢冷却到室温。11/19/2022平衡酚平衡酚(pH8.0)(pH8.0)：氯仿：异戊
30、醇：氯仿：异戊醇：2525：2424：1 1 (体积比体积比)即配即用即配即用 每管加每管加500ul500ul 平衡酚平衡酚(pH8.0)(pH8.0)：250ul250ul 氯仿：氯仿：240ul240ul 异戊醇：异戊醇：10ul10ul11/19/2022氯仿：异戊醇：24：1(体积比)即配即用即配即用 每支试管加500 ul 氯仿：480ul 异戊醇：20ul11/19/2022TE缓冲液 5mln10mmolL Tris.HCl(pH 80)：0.1ml（0.5M LTris.HCIpH 80)n1mmolL EDTA(PH80)：0.01ml（0.5M EDTA pH80)加三蒸
31、水至4.89mL11/19/2022酚抽提除去蛋白质的示意图11/19/2022n 加入二苯胺试剂2ml 乳白色乳白色 无色n沸水水浴10分钟。无色 浅蓝色浅蓝色 二苯胺显色二苯胺显色11/19/2022二苯胺试剂的配制 A A液液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。B B液液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。配制配制:将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。11/19/2022细胞的破碎细胞的破碎 由于高等动物由于高等动物DNA DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，主要存在于细胞核与线
32、粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：破碎细胞难；从处死动物破碎细胞难；从处死动物?分离组织器宫到破碎分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间细胞费时长。在此时期间DNA DNA 可能会被可能会被DNAaseDNAase降解，降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易即使是较易破碎的肝破碎的肝?肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA DNA 断裂。断裂。分子量大，一般比细菌的大分子量大，一般比细菌的大2323个数量级，比病个数量级，比病毒的大毒的大4545个
33、数量。对不同生物材料，要根据具体情个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。况选择适当的分离提取方法。11/19/2022核酸的酚抽提核酸的酚抽提n原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。n氯仿还可加速有机相与水相的分层。n异戊醇：抑制界面泡沫的形成。n标准程序：酚酚-氯仿氯仿。11/19/2022核酸的沉淀核酸的沉淀n原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。n醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。n有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。n温度：冰水11/19/2022 核酸的理化性质核酸的理化性质 物理性质物理性质1.1.性状：性状
34、：RNARNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色的粉末或结晶；白色的粉末或结晶；DNADNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。则为疏松的石棉一样的纤维状固体。2 2、溶解性：溶解性：RNARNA和和DNADNA都是极性的化合物，一般说来，这些化合物都都是极性的化合物，一般说来，这些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。盐易溶于水。DNADNA和和RNARNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。白。DNADNA核蛋白与核
35、蛋白与RNARNA核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。而不同。DNADNA蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在在1mol/L1mol/L的的NaCNaC溶液中溶解度比纯水高溶液中溶解度比纯水高2 2倍，在倍，在0.14mol/L0.14mol/L的的NaClNaCl溶液中溶解度最低，仅为水的溶液中溶解度最低，仅为水的1%1%，几乎不溶解；而，几乎不溶解；而RNARNA蛋蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L0.14mol/L的的NaCl
36、NaCl溶解度较大。因此，溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常用此法将两种在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。11/19/2022核酸的两性电离与等电点核酸的两性电离与等电点 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNADNA的的pIpI约为约为4-54-5，RNARNA的的pIpI约为约为2.0-2.52.0-2.5，在
37、，在pH7-8pH7-8电泳时泳向正极。电泳时泳向正极。UVUV吸收吸收 核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质。吸收的的性质。在在260nm260nm处核酸紫外吸收最强。核酸处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。的紫外吸收是核酸定量测定的基础。11/19/2022DNADNA的提取方法简介的提取方法简介为了研究为了研究DNADNA分子在生命代谢中的作用，常常需要分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取从不同的生物材料中提取DNA.DNA.由于由于DNADNA分子在生物分子在生物体内的分布及含量不同，要选
38、择适当的材料提取体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNADNA。动植物中，小牛胸腺动植物中，小牛胸腺?动物肝脏动物肝脏?鱼类精子，植物鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的种子的胚中都含有丰富的DNADNA。微生物中，谷氨酸菌体含微生物中，谷氨酸菌体含7%10%7%10%，面包酵母含，面包酵母含4%4%，啤酒酵母含啤酒酵母含6%6%，大肠肝菌含，大肠肝菌含9%10%9%10%。11/19/2022从各种材料中提取从各种材料中提取DNADNA方法不同，分离提取的方法不同，分离提取的难易程度也不同。难易程度也不同。对于低等生物。如从病毒中提取对于低等生物。如从病毒中提取DNA DNA 比较容
39、易，比较容易，多数病毒多数病毒DNA DNA 分子量较小，提取时易保持其结分子量较小，提取时易保持其结构完整性。构完整性。从细菌及高等动植物中提取从细菌及高等动植物中提取DNADNA难度大一些。难度大一些。细菌细菌DNA DNA 分子量较大，一般达分子量较大，一般达2 210 10 道尔顿。道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌因此易被机械张力剪断。细菌DNADNA，除核除核DNA DNA 外，还有质粒外，还有质粒DNA DNA 等。等。11/19/2022核酸的分离纯化、测定及核酸的分离纯化、测定及研究方法研究方法一一、分离核酸的一般原则分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中
40、，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。11/19/2022（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：原则：保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。（二）核酸的纯度要求（二）核酸的纯度要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。11/19/2022（三）核酸分离纯化的注意事项（三）核酸分离纯化的注意事项l为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意
41、：l 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；破坏；l 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在酯键的破坏，操作多在pH4pH41010条件下进行；条件下进行；l 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNADNA酶需要金属二价阳离酶需要金属二价阳离子子MgMg2
42、+2+，CaCa2+2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTAEDTA或柠檬酸盐等或柠檬酸盐等基本上可以抑制基本上可以抑制DNADNA酶的活性。而酶的活性。而RNARNA酶不但分布广泛、极易污染样品，酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNARNA提取过程中的主提取过程中的主要危害因素；要危害因素；l 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其机械剪切力，其次是高温。次是高温。11/19/2022 高温：高温：如长时
43、间煮沸，除水沸腾带来如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为常规操作温度为0 044以降低核酸酶的活以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。性从而减少对核酸的生物降解。机械剪切力：机械剪切力：包括强力高速的溶液振包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及爆炸式地破裂及DNADNA样品的反复冻融等。这样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机些操作细节在实验操作中应加倍注意
44、。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性线性DNADNA分子，如真核细胞的染色体分子，如真核细胞的染色体DNADNA等。等。11/19/2022二、核酸分离纯化的一般步骤二、核酸分离纯化的一般步骤l破碎细胞破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子子沉淀核酸沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质去除盐类、有机溶剂等杂质纯纯化干燥化干燥溶解。溶解。l核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。高的核酸分子。11/19/2022
