1、 微生物的生长繁殖微生物的生长繁殖及其控制及其控制 微生物的生长繁殖微生物的生长繁殖 及其控制及其控制本章主要内容本章主要内容 微生物生长如何测定微生物生长如何测定？微生物如何进行生长？微生物如何进行生长？影响微生物生长的因素是什么？影响微生物生长的因素是什么？如何控制微生物的生长？如何控制微生物的生长？生物个体物质有规律地、不可逆增加，生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。导致个体体积扩大的生物学过程。生长:生物个体生长到一定阶段生物个体生长到一定阶段,通过特定方通过特定方式产生新的生命个体式产生新的生命个体,即引起生命个体即引起生命个体数量增加的生物学过程。数量增
2、加的生物学过程。繁殖:生长是一个逐步发生的生长是一个逐步发生的量变过程，量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程质变过程.在在高等生物高等生物里这两个过程可以明显分开里这两个过程可以明显分开,但在但在低等特别是在低等特别是在单细胞的生物单细胞的生物里里,由于细胞小由于细胞小,这这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。两个过程是紧密联系又很难划分的过程。一个微生物细胞一个微生物细胞合适的外界条件合适的外界条件,吸收营养物质吸收营养物质,进行代谢进行代谢.如果同化作用的速度超过了异化作用如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长个体的生长原生质的总量原生质的总量(重
3、量、体积、大小重量、体积、大小)不断增加不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时如果各细胞组分是按恰当的比例增长时,则达到则达到一定程度后就会发生繁殖一定程度后就会发生繁殖,引起个体数目增加引起个体数目增加.群体内各个个体的进一步生长群体内各个个体的进一步生长群体的生长群体的生长群体生长群体生长=个体生长个体生长+个体繁殖个体繁殖个体生长个体生长 个体繁殖个体繁殖 群体生长群体生长在一定时间和条件下细胞数量的增加在一定时间和条件下细胞数量的增加 （微生物群体生长）（微生物群体生长）微生物生长微生物生长:在微生物学中提到的在微生物学中提到的“生长生长”,一般均指群一般均指群体生长体生长,这一点
4、与研究大生物时有所不同。这一点与研究大生物时有所不同。第一节第一节 微生物生长的测定微生物生长的测定 以单位时间里微生物数量或生物量以单位时间里微生物数量或生物量(Biomass)的变化来评价。的变化来评价。微生物生长微生物生长:（参见（参见P151）微生物生长的测定微生物生长的测定:个体计数个体计数群体生物量测定群体生物量测定群体生理指标测定群体生理指标测定评价培养条件、营养物质等对微生物生长评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或或杀死杀死)作用的效果；作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；客观地反映微生
5、物生长的规律；通常用来测定细菌、酵母菌等通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量中所含微生物个体的数量(细菌、细菌、孢子、酵母菌孢子、酵母菌)一、计数法一、计数法1、显微镜直接计数法、显微镜直接计数法1）常规方法：）常规方法：采用细菌计数板或血球计数板采用细菌计数板或血球计数板,在显微镜下在显微镜下对微生物数量进行直接计数对微生物数量进行直接计数(计算一定容积计算一定容积里样品中微生物的数量里样品中微生物的数量).缺点缺点:不能区分死菌与活菌不能区分死菌与活菌;不适于对运动细菌的计数不适于对运动细菌的计数;需要相对高的细菌浓度需要
6、相对高的细菌浓度;个体小的细菌在显微镜下难以观察个体小的细菌在显微镜下难以观察;2）其它方法）其它方法:将已知颗粒浓度的样品将已知颗粒浓度的样品(例如血液例如血液)与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。浓度。比例计数比例计数:过滤计数过滤计数:当样品中菌数很低时当样品中菌数很低时,可以将一定体可以将一定体 积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器器.然后将滤膜干燥、染色然后将滤膜干燥、染色,并经处理使膜透明并经处理使膜透明,再在显
7、微镜下计算膜上再在显微镜下计算膜上(或一定面积中或一定面积中)的细菌的细菌数数;活菌计数活菌计数:采用特定的染色技术也可分别对活采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数。菌和死菌进行分别计数。2、培养平板计数法、培养平板计数法采用培养平板计数法要求操作熟采用培养平板计数法要求操作熟练练,准确准确,否则难以得到正确的结果否则难以得到正确的结果:样品充分混匀；样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重同一稀释度三个以上重复复,取平均值取平均值；每个平板上的菌落数目合每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；适，
8、便于准确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成一个菌落可能是多个细胞一起形成,所以在科研中一所以在科研中一般用菌落形成单位般用菌落形成单位(colony forming units,CFU)来表来表示示,而不是直接表示为细胞数。而不是直接表示为细胞数。3、膜过滤培养法、膜过滤培养法当样品中菌数很低时当样品中菌数很低时,可以将一定体积的湖水、可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器海水或饮用水等样品通过膜过滤器,然后将将然后将将膜转到相应的培养基上进行培养膜转到相应的培养基上进行培养,对形成的菌对形成的菌落进行统计。落进行统计。主要适用于只能进行液体培养的微生物主要适用于只能进行液体培
9、养的微生物,或采或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。生物。对未知样品进行十倍稀释对未知样品进行十倍稀释,然后根据估算取三然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管个连续的稀释度平行接种多支试管,对这些平对这些平行试管的微生物生长情况进行统计行试管的微生物生长情况进行统计,长菌的为长菌的为阳性阳性,未长菌的为阴性未长菌的为阴性,然后根据数学统计计算然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。出样品中的微生物数目。4.液体稀释法液体稀释法The most probable number method二、生物量法二、生物量法1、比浊法、比浊法在一定
10、波长下在一定波长下,测定菌悬测定菌悬液的光密度液的光密度,以光密度以光密度(optical density,即即O.D.)表示菌量。表示菌量。实验测量时应控制在菌浓实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性度与光密度成正比的线性范围内范围内,否则不准确。否则不准确。2、重量法、重量法 干重法：干重法：将微生物菌体或离心得到的细胞沉淀物置将微生物菌体或离心得到的细胞沉淀物置100100105105的烘箱中干燥至水份去除，然后再称重。的烘箱中干燥至水份去除，然后再称重。湿重法：湿重法：收集微生物菌体，或将微生物培养液离心，收集微生物菌体，或将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。收集细胞沉
11、淀物，然后称重。通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法方法 三三、生理生理指标指标法法 微生物的生理指标微生物的生理指标,如呼吸强度如呼吸强度,耗氧量、耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相酶活性、生物热等与其群体的规模成正相 关。样品中微生物数量多或生长旺盛关。样品中微生物数量多或生长旺盛,这这 些指标愈明显些指标愈明显,因此可以借助特定的仪器因此可以借助特定的仪器 如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来
12、 测定相应的指标。测定相应的指标。常用于对微生物的快速鉴定与检测常用于对微生物的快速鉴定与检测 微生物的生长表现在微生物的个体生长与群微生物的生长表现在微生物的个体生长与群体生长两个水平上。体生长两个水平上。微生物个体生长微生物个体生长表现为个体质量和体积表现为个体质量和体积的增加。的增加。微生物群体生长微生物群体生长是以微生物细胞的数是以微生物细胞的数量或微生物群体细胞物质量的增加作为生量或微生物群体细胞物质量的增加作为生长的指标。长的指标。一、细菌的个体生长一、细菌的个体生长（1 1）DNADNA的的复制和分离复制和分离 双向方式双向方式连续复制连续复制（2 2）细胞壁扩增）细胞壁扩增 杆
13、菌中是新合成的肽聚糖在新旧杆菌中是新合成的肽聚糖在新旧CwCw均有均有分布，而球菌是在赤道板插入，固定位置。分布，而球菌是在赤道板插入，固定位置。（3 3）细菌的分裂和调节）细菌的分裂和调节 各种物质复制后，质膜内陷伴随新肽聚糖插入，各种物质复制后，质膜内陷伴随新肽聚糖插入，导致横隔壁向心生长，最后会合，一分为二。导致横隔壁向心生长，最后会合，一分为二。调节主要依赖调节主要依赖转肽酶转肽酶和和D D，D D羧肽酶羧肽酶活性比。活性比。转肽酶转肽酶活性高些，利于活性高些，利于CWCW扩增，导致细菌扩增，导致细菌生长。生长。羧肽酶羧肽酶高些，利于横隔壁形成，导致细胞高些，利于横隔壁形成，导致细胞分
14、裂分裂。（一）无分支单细胞微生物的群体生长（一）无分支单细胞微生物的群体生长二微生物的群体生长二微生物的群体生长细胞呈指数增长细胞呈指数增长特征特征:每经历一个代时，细胞的数目就增加每经历一个代时，细胞的数目就增加1 1倍，呈指数增加，倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是无分支单细胞微生物的群体生长因而被称为指数生长，这就是无分支单细胞微生物的群体生长特征。特征。1.1.无分支单细胞微生物群体生长的特征无分支单细胞微生物群体生长的特征 2、生长曲线、生长曲线(Growth Curve):细菌接种到定量的液体培养基中细菌接种到定量的液体培养基中,定时定时取样测定细胞数量取样测定细胞数量,以
15、培养时间为横座标，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图以菌数为纵座标作图,得到的一条反映细得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。一条典型的生长曲线至少可以分为一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期。等四个生长时期。迟缓期迟缓期(Lag phase):将少量菌种接入新鲜培养基后将少量菌种接入新鲜培养基后,在开始一段时在开始一段时间内菌数不立即增加间内菌数不立即增加,或增加很少或增加很少,生长速度接生长速度接近于零近于零.也称也称延迟期、适应期。延迟期、适应期。迟缓期的特点迟缓期的
16、特点:分裂迟缓、代谢活跃分裂迟缓、代谢活跃t细胞形态变大或增长细胞形态变大或增长t细胞内细胞内RNA,尤其是尤其是rRNA含量增高含量增高,合成代合成代谢活跃谢活跃,核糖体、酶类和核糖体、酶类和ATP的合成加快的合成加快,易产易产生诱导酶。生诱导酶。t对外界不良条件反应敏感。对外界不良条件反应敏感。细胞处于活跃生长中细胞处于活跃生长中,只是分裂迟缓只是分裂迟缓;在此阶段在此阶段后期后期,少数细胞开始分裂少数细胞开始分裂,曲线略有上升。曲线略有上升。迟缓期出现的原因迟缓期出现的原因:微生物接种到一个新的环境微生物接种到一个新的环境,暂时缺乏分解和暂时缺乏分解和催化有关底物的酶催化有关底物的酶,或是缺乏充足的中间代谢产或是缺乏充足的中间代谢产物等物等.为产生诱导酶或合成中间代谢产物为产生诱导酶或合成中间代谢产物,就需要就需要一段适应期。一段适应期。调整代谢调整代谢 迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关前后所处的环境条件等因素有关,短的只需要几短的只需要几分钟分钟,长的需数小时长的需数小时.
