1、天然生化物质制备大实验天然生化物质制备大实验Experiments of Preperation of Natural Biochemical products 可再生资源利用与加工实验教学中心可再生资源利用与加工实验教学中心 主主 讲：吴石金讲：吴石金 副教授副教授1动物内脏动物内脏Cyt-c的制备及测定的制备及测定2从番茄酱中提取番茄红素和从番茄酱中提取番茄红素和-胡萝卜素胡萝卜素3虎杖中羟基蒽醌的提取、分离与鉴定虎杖中羟基蒽醌的提取、分离与鉴定4 天然天然实验二实验二Cyt-c的制备及测定的制备及测定.通过通过Cyt-c 的制备，了解蛋白质制品制的制备，了解蛋白质制品制备的一般原理和步骤
2、。备的一般原理和步骤。.掌握制备掌握制备Cyt-c的操作技术及含量测定的操作技术及含量测定方法。方法。一、目的要求一、目的要求细胞色素细胞色素c（Cyt-c）它是电子传递链中一个独立的蛋白质电子载体，位于它是电子传递链中一个独立的蛋白质电子载体，位于线粒体内膜外表，属于膜周蛋白，易溶于水。它与细线粒体内膜外表，属于膜周蛋白，易溶于水。它与细胞色素胞色素c1含有相同的辅基，但是蛋白组成则有所不同。含有相同的辅基，但是蛋白组成则有所不同。在电子传递过程中，在电子传递过程中，Cyt.c通过通过Fe3+Fe2+的互变起电的互变起电子传递中间体作用。子传递中间体作用。胞液侧胞液侧 基质侧基质侧 线粒体内
3、膜线粒体内膜 Q 1/2O2+2H+H2O 延胡索酸延胡索酸 琥珀酸琥珀酸 e-Cytc e-e-e-e-NADH+H+NAD+细胞色素细胞色素c（Cyt-c）Cyt-c2e-内膜内膜外外内内二、实验原理二、实验原理 Cyt-c存在于线粒体中，心肌和酵母细胞中含量丰富。存在于线粒体中，心肌和酵母细胞中含量丰富。含铁卟啉的结合蛋白质，分子量约为含铁卟啉的结合蛋白质，分子量约为13000；蛋白质部分由；蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，赖氨酸含量较高，个左右的氨基酸残基组成，赖氨酸含量较高，pI10.7。是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于
4、水及酸性溶液，故常用酸性水提取。性水提取。分氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型呈桃分氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型呈桃红色。红色。对热较稳定，不易变性。对热较稳定，不易变性。氧化型氧化型Cyt-c在在550nm下摩尔吸收系数为下摩尔吸收系数为0.910，还原型还原型Cyt-c为为2.7710。根据已知的摩尔吸收系数，可用。根据已知的摩尔吸收系数，可用分光光度法测定分光光度法测定Cyt-c的含量的含量。摩尔吸收系数摩尔吸收系数()：是指物质在：是指物质在 1mol/L 的浓度下，比色杯厚度的浓度下，比色杯厚度为为 1cm 时的吸光度。时的吸光度。：吸光度：吸光度：
5、每升溶液中物质的摩尔数：每升溶液中物质的摩尔数：比色杯内径：比色杯内径二、实验原理二、实验原理以屠宰场新鲜猪内脏为原料，经过酸溶液以屠宰场新鲜猪内脏为原料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附及三氯乙酸沉淀得到提取，人造沸石吸附及三氯乙酸沉淀得到Cyt-c粗品。然后再用柱层析法将粗制品纯粗品。然后再用柱层析法将粗制品纯化，得精制品。化，得精制品。二、实验原理二、实验原理三、试剂和器材三、试剂和器材猪内脏猪内脏人造沸石，透析袋，树脂，三氯乙酸，人造沸石，透析袋，树脂，三氯乙酸，NH4OH(氨水氨水)，HCl，NaCl，(NH4)2SO4，BaCl2，K3Fe(CN)6，连二亚硫酸连二亚硫酸钠，钠，Na2
6、HPO4，蒸馏水。蒸馏水。四、操作方法四、操作方法 取取50 g猪心去结缔组织绞碎放入烧杯猪心去结缔组织绞碎放入烧杯 加加50 ml 0.145 mol/L三氯乙酸三氯乙酸 4玻棒搅拌浸提玻棒搅拌浸提2 h 4层纱布过滤层纱布过滤 用用 1 mol/L NH4OH调调pH6 用用 1 mol/L NH4OH调调pH6 滤纸过滤，取滤液滤纸过滤，取滤液 用用1mol/L NH4OH调调pH7.2 按按 6g/100 ml 取沸石加入取沸石加入 搅拌搅拌1 h 待沸石变红后弃上清待沸石变红后弃上清 四、操作方法四、操作方法四、操作方法四、操作方法 待沸石变红后弃上清待沸石变红后弃上清 用用100
7、ml H2O洗洗3次次 用用100 ml 0.2%NaCl洗洗3次次 待上清液澄清弃上清待上清液澄清弃上清 用用25%(NH4)2SO4每次每次10ml反复洗脱反复洗脱 至沸石变白，合并洗脱液至沸石变白，合并洗脱液 四、操作方法四、操作方法 按每按每100 ml洗脱液加洗脱液加25g固体固体(NH4)2SO4 溶解后以溶解后以3000 rpm离心离心10 min 收集上清液收集上清液,加加40%三氯乙酸直至产生絮状沉淀三氯乙酸直至产生絮状沉淀（每（每100 ml细胞色素细胞色素c液加液加2.5 ml-5 ml三氯乙酸）三氯乙酸）3000 rpm离心离心15 min 取沉淀即细胞色素粗提物取沉淀
8、即细胞色素粗提物 四、操作方法四、操作方法 取沉淀即细胞色素粗提物取沉淀即细胞色素粗提物 用用1ml H2O溶解细胞色素溶解细胞色素c 于透析袋中透析过夜于透析袋中透析过夜 用用BaCl2检查透析是否完全检查透析是否完全 回收透析完全的细胞色素回收透析完全的细胞色素c液备用液备用柱层析操作步骤柱层析操作步骤q 称取称取Sephadex-50 1 g，置于三角烧瓶，置于三角烧瓶中，加蒸馏水中，加蒸馏水60ml，于沸水浴中加热，于沸水浴中加热5小小时（此为加热溶胀；如在室温溶胀，需放时（此为加热溶胀；如在室温溶胀，需放置置4872小时）取出，待冷却至室温后装小时）取出，待冷却至室温后装柱。柱。层析
9、柱层析柱（a）自制简易层祈柱（自制简易层祈柱（1玻璃管；玻璃管；2.橡皮塞；橡皮塞；3尼龙网）；尼龙网）；（b）普通商品柱；普通商品柱；（c）双底板层析柱（双底板层析柱（1.洗脱液进出口；洗脱液进出口；2.多孔底板；多孔底板；3柱床；柱床；4恒温水进口；恒温水进口；5恒温水出口；恒温水出口；6可调节的塞子）可调节的塞子）q 层析系统连接示意图层析系统连接示意图 1密封橡皮塞；密封橡皮塞；2恒压管，恒压管，3，恒压瓶；，恒压瓶；4，层析流出液，层析流出液，5可调蜾旋夹；可调蜾旋夹；6.自动收集器；自动收集器；7.核酸一蛋白质检测仪核酸一蛋白质检测仪 BS100自动部分收集器安装圈自动部分收集器安
10、装圈1.反全阀；反全阀；2.换管臂；换管臂；3.滴管；滴管；4，5换管臂固定螺丝；换管臂固定螺丝；6.竖杆；竖杆；7.竖杆囤定竖杆囤定螓丝；螓丝；8.报警板；报警板；9.试管；试管；10.收集盘；收集盘；11.时间选挥旋钮；时间选挥旋钮；12.时间选择固定时间选择固定螺钉；螺钉；13.自动开关；自动开关；14.指示灯；指示灯；15.电源开关；电源开关；16.换向开关换向开关(逆、顺逆、顺)；17.手动开关手动开关q 1直接将样品加到层析床表面直接将样品加到层析床表面 2利用两种液体比重不同而分层的原理，利用两种液体比重不同而分层的原理，将高比重样品加入床表面低比重的洗脱液之将高比重样品加入床表
11、面低比重的洗脱液之中，样品就慢慢均匀地下沉于床表面，再打中，样品就慢慢均匀地下沉于床表面，再打开出口，使样品渗入层析开出口，使样品渗入层析。3.可用微量泵控制可用微量泵控制 流速对洗脱曲线的影响流速对洗脱曲线的影响 流速较低，分辨率较高，样品稀释较轻。流速较低，分辨率较高，样品稀释较轻。取少许取少许Cyt-c稀释后按下表进行含量测定：稀释后按下表进行含量测定：空白一空白一样品一样品一空白二空白二样品二样品二buffer2.91.42.91.4Cyt-c01.501.5K3Fe(CN)60.10.100连二亚硫酸钠连二亚硫酸钠00几粒几粒几粒几粒A550 计算计算Y(mg)A550 MWt 3
12、1.5 V(mL)稀释倍数稀释倍数 MWt:Cyt-c的分子量（的分子量（12400 Dal）3:比色时比色时溶液的体积溶液的体积 1.5:Cyt-c溶液的体积溶液的体积 V:制备所得的制备所得的Cyt-c溶液的总体积溶液的总体积五、注意事项五、注意事项 1.力争除尽猪心非心肌组织，如脂肪、血管、韧带和力争除尽猪心非心肌组织，如脂肪、血管、韧带和积血。积血。2.提取、中和要注意调节提取、中和要注意调节pH。吸附、洗脱应严格掌握吸附、洗脱应严格掌握流速。流速。3.盐析时，加入固体盐析时，加入固体(NH4)2SO4，要边加边搅拌，不，要边加边搅拌，不要一次快速加入。要一次快速加入。4.逐滴加入三氯
13、乙酸，搅匀，加完后，尽快离心。逐滴加入三氯乙酸，搅匀，加完后，尽快离心。5.透析袋要求不漏。透析袋要求不漏。六、结果与讨论六、结果与讨论1.从猪心中提取、分离、纯化从猪心中提取、分离、纯化Cyt-c化合物的原化合物的原理是什么？理是什么？2.凝胶过滤层析常见问题有哪些？凝胶过滤层析常见问题有哪些？3.如何解决分辩率不高如何解决分辩率不高 的问题？的问题？4.一般在粗品制备阶段和精品纯化阶段分别应采一般在粗品制备阶段和精品纯化阶段分别应采用哪些层析分离技术？用哪些层析分离技术？人造沸石的再生方法人造沸石的再生方法 使用过的沸石先用自来水洗去硫酸铵，再使用过的沸石先用自来水洗去硫酸铵，再用用0.2mol/L0.3mol/L氢氧化钠和氢氧化钠和1mol/L氯氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，最后用水化钠混合液洗涤至沸石成白色，最后用水反复洗至反复洗至pH78，即可重新使用。即可重新使用。中国药典中国药典（gg）：）：表示溶液表示溶液100 g中含有溶质若干中含有溶质若干g的符号。的符号。（ml ml）：）：表示溶液表示溶液100 ml中含有溶质若干中含有溶质若干ml的符号。的符号。（g ml）：）：表示溶液表示溶液100 ml中含有溶质若干中含有溶质若干g的符号的符号。
