1、肿瘤的分子生物学检验肿瘤的分子生物学检验 2015.11.30 肿瘤标志物的研究历史肿瘤标志物的研究历史 第第1 1阶段（阶段（1963-19781963-1978）：癌胚性抗原）：癌胚性抗原 19631963年年 Abelev Abelev AFP AFP 19651965年年 Gold&Freeman Gold&Freeman CEA CEA 第第2 2阶段（阶段（1979-19891979-1989）：糖链抗原为主）：糖链抗原为主 19801980年年 Koprowski Koprowski CA19-9CA19-9（1116-NS-19-91116-NS-19-9）19811981年年
2、 Bast Bast CA125CA125（OC125OC125）第第3 3阶段（阶段（19901990以后）：基因标志以后）：基因标志 肿瘤基因标志肿瘤基因标志一、原癌基因一、原癌基因(oncogene(oncogene，onc)onc)及其表达产物的作用及其表达产物的作用1 1、定义：、定义：原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。原癌基因包括病毒癌基因（物特征的基因总称。原癌基因包括病毒癌基因（v-oncv-onc）和细胞癌
3、基因（和细胞癌基因（c-oncc-onc）两种，它们在正常情况下以非激）两种，它们在正常情况下以非激活的形式存在，故称原癌基因。负责调控正常细胞的生活的形式存在，故称原癌基因。负责调控正常细胞的生命活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期命活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进展、细胞存活以及进展、细胞存活以及DNADNA转录等。一旦这类基因发生某些转录等。一旦这类基因发生某些错误或功能丧失时，极易导致原癌基因转变为可使正常错误或功能丧失时，极易导致原癌基因转变为可使正常细胞转化为肿瘤的转化基因或癌基因。细胞转化为肿瘤的转化基因或癌基因。2 2、特点：、特点：（1 1）v-on
4、cv-onc是病毒基因组中特殊的核苷酸序列，能是病毒基因组中特殊的核苷酸序列，能 引起细胞转化引起细胞转化（2 2）c-oncc-onc是存在于正常细胞基因组中的癌基因，是存在于正常细胞基因组中的癌基因，在正常情况下处于在正常情况下处于静止或低表达静止或低表达的状态，不的状态，不 仅对细胞无害，而且对维持细胞正常功能具仅对细胞无害，而且对维持细胞正常功能具 有重要作用，但在异常表达时，其产物可使有重要作用，但在异常表达时，其产物可使 细胞无限制分裂细胞无限制分裂 细胞癌基因与病毒癌基因核酸序列有同源性即它细胞癌基因与病毒癌基因核酸序列有同源性即它们的们的DNADNA序列是相对应的，表达产物也基
5、本相同序列是相对应的，表达产物也基本相同 细胞癌基因的作用：细胞癌基因的作用：通过其表达产物蛋白质来体现的，通过其表达产物蛋白质来体现的，负责调控正常细胞的生负责调控正常细胞的生命活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进命活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进展、细胞存活以及展、细胞存活以及DNADNA转录等。转录等。二、癌基因二、癌基因定义：原癌基因在进化上高度保守，负责调控正常细胞的生命定义：原癌基因在进化上高度保守，负责调控正常细胞的生命活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进展、细活动，包括细胞增生、生长因子信号传递、细胞周期进展、细胞存活以及胞存活以及DNA
6、DNA转录等。一旦这类基因发生某些错误或功能丧失转录等。一旦这类基因发生某些错误或功能丧失时，极易导致原癌基因转变为可使正常细胞转化为肿瘤的转时，极易导致原癌基因转变为可使正常细胞转化为肿瘤的转化基因或癌基因化基因或癌基因三三、原癌基因的激活机制、原癌基因的激活机制 原癌基因具有正常的生理功能，被激活时又具有原癌基因具有正常的生理功能，被激活时又具有致癌能力，因此研究原癌基因如何被激活是很重要的。致癌能力，因此研究原癌基因如何被激活是很重要的。现已证实现已证实 射线辐射射线辐射 化学致癌剂化学致癌剂 病毒感染病毒感染 (一一)原癌基因点突变原癌基因点突变(point mutation)(poi
7、nt mutation)癌基因在编码顺序的特定位置上的某一个核苷酸癌基因在编码顺序的特定位置上的某一个核苷酸发生突变，使其表达蛋白质中相应的氨基酸发生变化，发生突变，使其表达蛋白质中相应的氨基酸发生变化，从而获得了转化细胞的活性从而获得了转化细胞的活性 (二二)原癌基因获得外源启动子而激活原癌基因获得外源启动子而激活 肿瘤细胞中原癌基因的表达水平可以其转录的肿瘤细胞中原癌基因的表达水平可以其转录的mRNAmRNA或翻译产物蛋白质的含量来表示或翻译产物蛋白质的含量来表示 在原癌基因的上游插入外源性启动子或增强子可在原癌基因的上游插入外源性启动子或增强子可激活原癌基因，使其表达产物增多激活原癌基因
8、，使其表达产物增多 病毒的增强子常位于病毒的增强子常位于55端的长末端重复序列端的长末端重复序列(1ong terminal repeat(1ong terminal repeat，LTR)LTR)内。如果增强子插入到内。如果增强子插入到原癌基因的附近或远处，均使之激活，促使癌基因的原癌基因的附近或远处，均使之激活，促使癌基因的表达比正常表达增高几十甚至上百倍表达比正常表达增高几十甚至上百倍 (三三)原癌基因甲基化程度降低而激活原癌基因甲基化程度降低而激活 DNADNA分子中的甲基化分子中的甲基化(methylation)(methylation)对阻抑基因的对阻抑基因的转录具有重要作用转录具
9、有重要作用 现已发现在结肠腺癌和小细胞肺癌的细胞中，现已发现在结肠腺癌和小细胞肺癌的细胞中，rasras基因基因的的DNADNA甲基化水平比其邻近的正常细胞明显偏低，提示甲基化水平比其邻近的正常细胞明显偏低，提示某些原癌基因是由于甲基化程度降低而激活某些原癌基因是由于甲基化程度降低而激活 (四四)原癌基因的拷贝数增加原癌基因的拷贝数增加基因扩增基因扩增(amplification)(amplification)：某些癌基因通过一些机制在原来的染色体上复制某些癌基因通过一些机制在原来的染色体上复制多个拷贝，超出了正常细胞的癌基因剂量，导致基因多个拷贝，超出了正常细胞的癌基因剂量，导致基因产物的增
10、加，从而使细胞正常功能紊乱产物的增加，从而使细胞正常功能紊乱 例如：例如：人视网膜母细胞瘤：人视网膜母细胞瘤：N-mycN-myc扩增了扩增了10-20010-200倍，相应倍，相应的的mRNAmRNA和蛋白质产物也都大量增加和蛋白质产物也都大量增加 (五五)基因易位或重排使原癌基因激活基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（基因易位（translocationtranslocation）基因重排（基因重排（rearrangemantrearrangemant）：）：有些癌基因从其染色体的正常位置转移到另一染有些癌基因从其染色体的正常位置转移到另一染色体的某个位置，由于调控环境发生变化，导致从
11、相色体的某个位置，由于调控环境发生变化，导致从相对静止状态变成激活状态，使原癌基因表达产物显著对静止状态变成激活状态，使原癌基因表达产物显著增加而导致肿瘤的发生增加而导致肿瘤的发生 染色体易位使位于染色体易位使位于9q349q34的的c-ablc-abl基因转移到第基因转移到第2222对对染色体上，重排形成染色体上，重排形成bcr-ablbcr-abl融合基因，使表达增高，融合基因，使表达增高，蛋白质产物也由蛋白质产物也由p145p145变成变成p210p210，其酪氨酸蛋白激酶活，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生 四四、抑癌基因抑
12、癌基因 抑癌基因抑癌基因(suppresser gene)(suppresser gene)又称抗癌基因又称抗癌基因(anti-(anti-onc)onc)，是存在于正常细胞内的一类可抑制细胞生长的基因，是存在于正常细胞内的一类可抑制细胞生长的基因，并有潜在抑癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，并有潜在抑癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生 （一）抑癌基因及其表达产物（一）抑癌基因及其表达产物 抑癌基因与调控细胞分裂和分化过程相关，可能抑癌基因与调控细胞分裂和分化过程相关，可能与生长因子、某些蛋白激酶类活性密切相关
13、，只是抑与生长因子、某些蛋白激酶类活性密切相关，只是抑癌基因给予细胞的信号与原癌基因相反癌基因给予细胞的信号与原癌基因相反 （二（二）抑癌基因失活机理抑癌基因失活机理1 1、视网膜母细胞瘤、视网膜母细胞瘤(retino-blastoma(retino-blastoma，Rb)Rb)（1 1）特点：）特点：基因组成：基因组成：2727个外显子，个外显子，3-173-17外显子区域是基外显子区域是基 因重组和突变的热点因重组和突变的热点 编码：编码：p105p105的蛋白质，其有结合的蛋白质，其有结合DNADNA的活性，的活性，可受多种激酶系统催化而发生磷酸化可受多种激酶系统催化而发生磷酸化 （2
14、 2）作用：）作用：不同程度磷酸化后，都可使不同程度磷酸化后，都可使p105p105活性缺乏或完活性缺乏或完全消失。非磷酸化的全消失。非磷酸化的RbRb可防止细胞增殖，当可防止细胞增殖，当DNADNA肿肿瘤病毒抗原结合了非磷酸化的瘤病毒抗原结合了非磷酸化的RbRb时，时，RbRb的活性就受的活性就受到抑制，使细胞转化为无限增殖状态，形成肿瘤到抑制，使细胞转化为无限增殖状态，形成肿瘤 对于大量来自视网膜母细胞瘤的对于大量来自视网膜母细胞瘤的RbRb基因序列进行分析，基因序列进行分析，发现发现RbRb基因完全或部分发生缺失；另一些基因完全或部分发生缺失；另一些RbRb肿瘤中，肿瘤中，基因完整，但序
15、列分析显示有一个突变，它常发生于基因完整，但序列分析显示有一个突变，它常发生于剪接点上，由于这一变异导致剪接点上，由于这一变异导致Rb mRNARb mRNA组装时有外显子组装时有外显子被漏掉，因而产生异常被漏掉，因而产生异常RbRb蛋白质蛋白质 抑癌基因又称为隐性癌基因抑癌基因又称为隐性癌基因 （2 2）p53p53基因基因特点：特点：17p1317p13，1111个外显子，个外显子，1010个内含子个内含子编码：编码：393393个氨基酸，个氨基酸，p53p53作用：产物能结合作用：产物能结合DNADNA和被磷酸化。和被磷酸化。（1 1）抑制肿瘤细胞停滞在修复前期不能进入）抑制肿瘤细胞停滞
16、在修复前期不能进入S S期复制期复制DNADNA而促使细胞凋亡而促使细胞凋亡 野生型野生型p53p53的蛋白质的蛋白质 p53p53下调下调bcl-2bcl-2而而上调上调baxbax，促进细胞，促进细胞凋亡过程。向丢失凋亡过程。向丢失p53p53等位基因的肿瘤等位基因的肿瘤细胞中导入野生型细胞中导入野生型p53p53就会使肿瘤细胞就会使肿瘤细胞凋亡凋亡 正常细胞的生长增殖由两大基因调控正常细胞的生长增殖由两大基因调控 正调控信号：促进细胞生长和增殖，并且阻止正调控信号：促进细胞生长和增殖，并且阻止 其发生终末分化其发生终末分化癌基因癌基因 负调控信号：促进细胞成熟，向终末分化，最负调控信号：
17、促进细胞成熟，向终末分化，最 后凋亡（后凋亡（apoptosisapoptosis）抑癌基因抑癌基因 两种信号保持着动态平衡，对正常细胞的生长、两种信号保持着动态平衡，对正常细胞的生长、增殖、死亡精确地调控，当平衡被破坏，正调控信增殖、死亡精确地调控，当平衡被破坏，正调控信号基因功能过盛或负调控信号基因失活，导致细胞号基因功能过盛或负调控信号基因失活，导致细胞增殖调控的混乱而使细胞恶变增殖调控的混乱而使细胞恶变 原癌基因的激活原癌基因的激活1 1、rasras基因的变异基因的变异2 2mycmyc基因的变异基因的变异抑癌基因的失活抑癌基因的失活1 1、RbRb基因的失活基因的失活2 2、p53
18、p53基因的失活基因的失活 3 3、其他：、其他：BRCA1BRCA1和和BRCA2BRCA2：与遗传性高发乳腺癌相关的基因，：与遗传性高发乳腺癌相关的基因，与卵巢癌的发生也紧密相关与卵巢癌的发生也紧密相关 五五、检测方法：、检测方法：1 1、PCRPCRASOASO探针法探针法(PCR-allele-specific(PCR-allele-specific oligonucleotideoligonucleotide）被检基因片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经标记的野生型和突变型靶基因序列的寡核苷酸探针杂交。由于长度为20个碱基左右的探针中仅1个碱基的差异便会使其Tm值下降5
19、.07.5，因此通过严格控制杂交条件，可以使PCR产物与完全互补的探针进行杂交，也即野生型序列的产物仅与野生型探针杂交，含突变序列的产物仅与突变探针杂交。根据有无杂交信号可判断被检扩增片段中是否带有突变点。2 2、限制性片段长度多态性、限制性片段长度多态性(RFLP)(RFLP)分析分析聚合酶链式反应限制性片段长度多态（PCR RFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应
20、用PCR RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。3 3、PCR-SSCPPCR-SSCP、测序等、测序等 单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成 突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA4 4、变性梯度凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳 (DGGE)DGGE)在设计引物时应使被扩增的靶基因片段的两端含有不同的Tm值，一端较高，另一端相对较低。将PCR产物在含有梯度浓度变性剂的聚丙
21、烯酰胺凝胶中进行分离，当泳动至变性剂相应浓度的位置时，产物片段中Tm值较低一端的双链被部分变性而解链，这种部分解链的构象致使该片段的电泳迁移率大大降低。由于野生序列与突变序列的PCR产物片段的Tm不同，它们在电泳过程中被部分解链的先后不同，经过一定时间的电泳，可以发现这些产物片段在凝胶中所处的位置也不同，据此，可以区别野生序列片段还是突变序列片段。5 5、SouthernSouthern BlotBlot具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色。6 6、基因芯片、基因芯片 集成化的核酸分子杂交技术集成化的核酸分子杂交技术谢谢 谢谢
