1、生物必修必修 人教版人教版专题五DNA和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题3血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 学学 习习 目目 标标课课 程程 标标 准准1掌握提取生物大分子的基本过程和方法。掌握提取生物大分子的基本过程和方法。(重重点点)2理解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子理解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。的基本原理。(重、难点重、难点)3尝试对血液中的血红蛋白进行提取和分离。尝试对血液中的血红蛋白进行提取和分离。尝试蛋白质的提取与分离尝试蛋白质的提取与分离1 1自主学习自主学习2 2新知解读新知解读3 3指点迷津指点迷津4 4核心素养核心素养5 5问题释疑问题释疑6
2、 6知识构建知识构建7 7训练巩固训练巩固8 8课课 时时 作作 业业自自 主主 学学 习习分配色谱法分配色谱法相对分子质量大小相对分子质量大小相对分子质量相对分子质量较小较小较大较大较慢较慢较大较大凝胶外部凝胶外部短短快快相对分子质量相对分子质量外界外界酸和碱酸和碱相对稳定相对稳定12水水使用比例使用比例带电粒子带电粒子迁移迁移pH多肽多肽核酸核酸正电正电负电负电电场电场相反相反带电性质带电性质大小大小形状形状迁移速度迁移速度各种分子各种分子琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胺电泳聚丙烯酰胺凝胺电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯
3、度鉴定去除杂蛋白去除杂蛋白低速短时间低速短时间生理盐水生理盐水黄色黄色(2)血红蛋白的释放：在血红蛋白的释放：在_和和_的作用下，红细胞破裂，释的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：把混合液离心后，将试管中的液体用滤纸过滤，除分离血红蛋白溶液：把混合液离心后，将试管中的液体用滤纸过滤，除去去_，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的_。(4)透析：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。透析：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。蒸馏水蒸馏水甲苯甲苯脂溶性沉淀层脂溶性沉淀层 红色透明液体红色透明
4、液体2凝胶色谱操作凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作：准备材料凝胶色谱柱的制作：准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安装色谱柱。安装色谱柱。(2)凝胶色谱柱的装填。凝胶色谱柱的装填。(3)样品的加入和洗脱。其基本过程是调节缓冲液面样品的加入和洗脱。其基本过程是调节缓冲液面加入蛋白质样品加入蛋白质样品调调节缓冲液面节缓冲液面洗脱洗脱收集分装蛋白收集分装蛋白质。至此，血红蛋白即可得到粗分离。质。至此，血红蛋白即可得到粗分离。3纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是_ _。SDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳洗涤次数洗涤次数离心速度离心速度离心时间离心时间血浆蛋白
5、血浆蛋白过高过高过长过长白细胞白细胞洗脱液洗脱液沸水浴加热沸水浴加热气泡气泡洗脱次序洗脱次序红色区带均匀一致地移动红色区带均匀一致地移动？思考？思考红细胞破碎后混合液中含有什么成分？红细胞破碎后混合液中含有什么成分？提示：提示：红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯等。脂质、甲苯等。1相对分子质量较大的蛋白质，无法进入凝胶内部的通道，移动速度较相对分子质量较大的蛋白质，无法进入凝胶内部的通道，移动速度较慢。慢。()分析：分析：相对分子质量较大的蛋白质，无法进入凝胶内部的通道，移动速度相对分子质量较大的蛋白质
6、，无法进入凝胶内部的通道，移动速度较快。较快。2在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维的影响，维持持pH基本不变。基本不变。()判断题判断题3电泳法分离样品只取决于蛋白质的相对分子质量大小。电泳法分离样品只取决于蛋白质的相对分子质量大小。()分析：分析：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。子的分离。4
7、红细胞的洗涤是为了彻底除去杂蛋白，应快速高速离心。红细胞的洗涤是为了彻底除去杂蛋白，应快速高速离心。()分析：分析：红细胞的洗涤目的是除去杂蛋白，离心的目的是使红细胞沉淀，而红细胞的洗涤目的是除去杂蛋白，离心的目的是使红细胞沉淀，而杂蛋白等均在上清液中，应低速缓慢离心，如果高速离心则会导致白细胞等一杂蛋白等均在上清液中，应低速缓慢离心，如果高速离心则会导致白细胞等一起沉淀，起不到分离的效果。起沉淀，起不到分离的效果。5纯化蛋白质的原理是根据不同蛋白质之间以及蛋白质与其他分子之间存纯化蛋白质的原理是根据不同蛋白质之间以及蛋白质与其他分子之间存在电荷差异进行的。在电荷差异进行的。()分析：分析：纯
8、化蛋白质的方法是凝胶色谱法，利用的是不同蛋白质之间以及蛋纯化蛋白质的方法是凝胶色谱法，利用的是不同蛋白质之间以及蛋白质与其他分子之间存在分子大小的差异进行的。白质与其他分子之间存在分子大小的差异进行的。6样品处理和粗分离的目的都是除去相对分子质量较小的杂质。样品处理和粗分离的目的都是除去相对分子质量较小的杂质。()分析：分析：样品处理的目的是除去相对分子质量较大的杂质。样品处理的目的是除去相对分子质量较大的杂质。7透析袋是一种选择透过性膜。透析袋是一种选择透过性膜。()8SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的依据是蛋白质分子相对分子质聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的依据是蛋白质分子相对分子质量和带
9、电性质的差异。量和带电性质的差异。()分析：分析：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂活性剂十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的电荷量，消除了不同蛋白质间的电荷差别，负电荷远远超过天然蛋白质分子的电荷量，消除了不同蛋白质间的电荷差别，使蛋白质分子电泳迁移率完全取决于相对分子质量的大小。使蛋白质分子电泳迁移率完全取决于相对分子质量的大小。新新 知知 解解 读读(一一)依据蛋白质的特性的差异依据蛋白质的特性的
10、差异蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质(如形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、如形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等亲和力等)千差万别，由此可提取和分离各种蛋白质。千差万别，由此可提取和分离各种蛋白质。知识点知识点1血红蛋白提取和分离的方法血红蛋白提取和分离的方法(二二)蛋白质的分离方法：凝胶色谱法蛋白质的分离方法：凝胶色谱法1概念：凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量大小分离蛋概念：凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。白质的有效方法。2原理：大多数凝胶由糖类化合物构成的小球体，内部有许多贯穿的通原理：大多数凝胶由糖类化合
11、物构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶部的通道，路程较长移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。(三三)缓冲溶液缓冲溶液1作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影的影响，维持响，维持pH基本不变。基本不
12、变。2配制：通常由配制：通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。范围内使用的缓冲液。(四四)电泳电泳1概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。2原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定在一定pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极
13、移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。度，从而实现样品中各种分子的分离。电泳利用了除哪些性质外使样品中各种分子分离电泳利用了除哪些性质外使样品中各种分子分离()A带电性质差异带电性质差异B分子的大小分子的大小C分子的形状分子的形状D分子的变性温度分子的变性温度解析解析电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，带电性质不电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过
14、程，带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度。同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度。D典例典例 1变式训练变式训练1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来()A相对分子质量大的相对分子质量大的 B溶解度高的溶解度高的C相对分子质量小的相对分子质量小的 D所带电荷多的所带电荷多的解析解析凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通
15、道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。A知识点知识点2提取和分离血红蛋白的实验操作提取和分离血红蛋白的实验操作(二二)凝胶色谱操作的主要步骤凝胶色谱操作的主要步骤3纯度鉴定纯度鉴定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。4结果分析与评价结果分析与评价蛋白质提取和分离分为哪几
16、步蛋白质提取和分离分为哪几步()A样品处理、凝胶色谱操作、样品处理、凝胶色谱操作、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳B样品处理、凝胶色谱操作、纯化样品处理、凝胶色谱操作、纯化C样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定解析解析蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。步。A中凝胶色谱操作及中凝胶色谱操作及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。C典例典例 2变式训练变式训练2
17、 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为下图中哪一个为下图中哪一个()解析解析本题考查对凝胶色谱法分离蛋白质原理的理解，蛋白质相对分子本题考查对凝胶色谱法分离蛋白质原理的理解，蛋白质相对分子质量越大，越容易通过凝胶间隙而先被洗脱，蛋白质相对分子质量越小则易进质量越大，越容易通过凝胶间隙而先被洗脱，蛋白质相对分子质量越小则易进入凝胶内部而后被洗脱。入凝胶内部而后被洗脱。B指指 点点 迷迷 津津聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳的区别聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳的区别1聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)凝胶的格子是带有酰
18、胺侧链的碳一碳聚合物，没有或很少带有离子的侧凝胶的格子是带有酰胺侧链的碳一碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电泳作用比较小，不易和样品相互作用。基，因而电泳作用比较小，不易和样品相互作用。(2)由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度的交联结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以度比，形成不同程度的交联结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据需分离物质的分子大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，根据需分离物质的分子大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有
19、比较好的机械性能。又有比较好的机械性能。(3)在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。检测仪直接测定。(4)丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理。琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理。(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大，近似自由电泳，样琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大，近似自由电泳，样 品扩散较自由，电品扩散较自由，电流对样品吸附极微，因此电
20、泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。流对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖透明，无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外灯检测及定量琼脂糖透明，无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外灯检测及定量测定。测定。(4)电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。存。下列关于电泳的说法，正确的是下列关于电泳的说法，正确的是()A电泳是指不带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程电泳是指不带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程B电泳的过程要在一定的电泳的过程要在一定的pH下，所以一定要使用缓冲液下，
21、所以一定要使用缓冲液C葡聚糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法葡聚糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法D聚丙烯酰胺凝胶电泳中，溶液中加入聚丙烯酰胺凝胶电泳中，溶液中加入SDS，电泳的迁移率主要取决于分，电泳的迁移率主要取决于分子所带电荷的多少和分子相对分子质量的大小子所带电荷的多少和分子相对分子质量的大小B典例典例 3解析解析电泳的过程实质上是带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，电泳的过程实质上是带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A项错误；最常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，项错误；最常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，C项错
22、项错误；聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，为了消除电荷对迁移率的影响，可在凝胶误；聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，为了消除电荷对迁移率的影响，可在凝胶中加入中加入SDS，SDS可以与各种蛋白质形成蛋白质可以与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所带负电荷所带负电荷的量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质之间的电荷的量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质之间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小，差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小，D项错误；电泳过程要在一定的项错误；电泳过程要在一定的pH条件下进行，所以要在溶液中加入缓冲液，以维持溶液条件下进行，
23、所以要在溶液中加入缓冲液，以维持溶液pH的稳定，的稳定，B项正项正确。确。核核 心心 素素 养养以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是()A洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢动慢思维过程思维
24、过程A项，项，思考思考生理盐水的作用；生理盐水的作用；B项，项，思考思考选用猪成熟的红细胞选用猪成熟的红细胞的目的；的目的；C项，如何监测凝胶色谱法的分离过程；项，如何监测凝胶色谱法的分离过程；D项，分离过程中，明确相对项，分离过程中，明确相对分子质量的大小与移动速度的关系。分子质量的大小与移动速度的关系。D案案 例例解析解析生理盐水为猪体细胞的等渗溶液，所以在洗涤红细胞时，使用生生理盐水为猪体细胞的等渗溶液，所以在洗涤红细胞时，使用生理盐水可维持红细胞的正常形态，理盐水可维持红细胞的正常形态，A项正确；由于哺乳动物成熟的红细胞缺少项正确；由于哺乳动物成熟的红细胞缺少细胞核和各种细胞器，所以提
25、纯时杂蛋白相对较少，细胞核和各种细胞器，所以提纯时杂蛋白相对较少，B项正确；如果凝胶色谱柱项正确；如果凝胶色谱柱装填得很成功，分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭装填得很成功，分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出，所以血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离窄、平整，随着洗脱液缓慢流出，所以血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测，过程的监测，C项正确；当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子项正确；当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，后洗质量较小的蛋白
26、质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，后洗脱出来，脱出来，D项错误。项错误。规律总结规律总结(1)血红蛋白的收集：利用血红蛋白的颜色，当红色的蛋白质血红蛋白的收集：利用血红蛋白的颜色，当红色的蛋白质接近色谱柱底端时，就要收集流出液。接近色谱柱底端时，就要收集流出液。(2)其他无色蛋白质的收集：可以在实验其他无色蛋白质的收集：可以在实验时加入指示剂以掌握样品的移动位置，确定最佳的收集时机。时加入指示剂以掌握样品的移动位置，确定最佳的收集时机。问问 题题 释释 疑疑教材教材P70“旁栏思考题旁栏思考题”凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对凝胶实际上是一些微小
27、的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，从而影响分离的效果。样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，从而影响分离的效果。知知 识识 构构 建建训训 练练 巩巩 固固课课 时时 作作 业业
